Summary
이 단계별 프로토콜 파리의 수백을 접대 하 고 전기 모터에 의해 그들의 행동을 동기화 하는 자동화 된 멀티 실린더 시스템을 사용 하 여 초파리 부정적인 geotaxis 동작을 분석 합니다. 동기화 시 디지털 기록 및 자체 디자인된 RflyDetection 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된 비행 부정적인 geotaxis 동작 분석입니다.
Abstract
신경 퇴행 성 질환 운동 능력, 감소 된 수명, 및 연령에 따라 neurodegeneration의 진보적인 손실에 자주 연관 된다. 이러한 세포의 메커니즘을 이해 하 이벤트, 그리고 그들의 인과 관계 서로, 초파리 melanogaster, 정교한 유전자 도구와 다양 한 행동 기능으로 사용 된다 질병 모델 평가 신경 고기입니다. 여기는 초파리 성인 부정적인 geotaxis 행동, neurodegeneration와 관련 된 가능한 모터 결함에 대 한 표시로 분석 하는 높은 처리량 방법에 설명 합니다. 자동화 기계 설계 및 드라이브 플라이 동기화 나중 초 분에 걸쳐 부정적인 geotaxis 행동의 녹음 수 있도록 초기 전기 전류를 사용 하 여 개발 되었습니다. 디지털 녹화 된 비디오에서 이미지 다음 통계 데이터 조작에 대 한 자체 설계 RflyDetection 소프트웨어와 함께 처리 됩니다. 다른 하나의 비행에 따라 수동으로 제어 부정적인 geotaxis 분석 결과,이, 빠르고, 정확 하 고 높은 처리량 프로토콜을 사용 하 데이터 수집에서 더 많은 파리의 수백 보다 동시에, 사전에 효율적인 접근 방식을 제공 하 우리 운전 적자 neurodegeneration 연관의 기본 메커니즘을 이해.
Introduction
다양 한 프로토콜 및 방법 초파리 성인 등반 동작의 분석을 위해 개발 되었습니다. 오히려 힘 드는 전통적인 분석 주로 개별 유리병에 넣어 하나의 비행을 포함를 사용 하 수동 힘 동기화1,2,3,4내려 파리를 누릅니다. 지루한 및 시간이 걸리는, 큰 높은 처리량 연구에 대 한 부적 절 한 이며 다른 제한 뿐만 아니라 파리 다운 탭을 사용 하는 수동 힘의 잠재적인 변이 있다. 분석 결과 개선 하기 위해, 급속 한 반복 부정적인 Geotaxis (반지) 분석 결과 수많은 파리 같은 시간5이상의 높은 처리량 분석을 수 있는 개발 되었다. 그러나, 분석 결과 여전히 비행 행동을 동기화를 수동으로 exerting 힘을 요구 한다. 이전 분석 결과 따라 수정 반지 분석 결과의 우리의 버전 포함 금속 기지 비행 동기화6를 전기 모터에 의해 자동으로 제어 하는 여러 비행 포함 하 튜브를 호스팅. 녹음 시 즉시 동기화 다음 기록 후 즉시 등반 자체 설계 소프트웨어를 사용 하 여 분석. 우리의 자동화 된 반지 분석 결과 지루하고 노동 집약 과정에서 한 번에 하나씩 단일 비행 데이터 수집에 제거 하 고 더 효율적으로 데이터 수집 프로세스를 활성화. 또한, 자동된 링 분석 결과 메커니즘 기본 Alzheimer를 명료 하 게 하는 연구와 파 킨 슨 병, 고효율7,8,9 접근 유효성 검사의 수에 고용은 .
이 문서에서 자동된 링 분석 결과를 DDC Gal4 RNAi 파리 구동을 사용 하 여 보여 줍니다. DDC Gal4 따라서 neurodegeneration10동반 운전 적자와 관련 된 타겟 유전자 효과 분석 하기 위한 훌륭한 도구를 나타내는 dopaminergic (다)와 serotonergic 신경, 특히 표현 Gal4 라인입니다. 또한, 우리 통합 UAS-Dicer2, RNAi 효율성, UAS-Dicer2; 를 생성을 향상 플라이 라인 DDC Gal4 라인 도구. 우리가 사용 하도록 선택 하는 RNAi 파리는 auxilin (보조) RNAi v16182 (auxR16182), 우리가 이전에 효과 전시 하기 위하여 확인 하는 유전자 비행 운동 활동8. auxGFP 파리는 또한 보조 overexpression 시 효과 분석에 대 한 준비. 우리는 비행 부정적인 geotaxis 측정, 결과, 결과에서 얻은 어떤 의미를 토론 하 자동된 링 분석 결과 사용 하는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
1. 비행 컬렉션
- 25 ° C, 습도 70%, 그리고 12 h/12 h 명암 주기에서 표준 비행 거리 음식에 파리를 유지.
- 수집 UAS-Dicer2; DDC GAL4 비행 virginsunder 이산화탄소 (CO 2) 마 취.
- 2 일 오래 된 성인 남성 파리 다음 genotypes을 들고 하이 처녀 크로스: UAS-mCD8GFP (제어), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (보조 overexpression), 그리고 auxR 16182; auxGFP (구조), 남자와 함께: 1: 2의 여성 비율.
- 별도로 수집 새로 eclosed 남성 및 여성 25 표준 음식 각 일반 비행 유리병에서 10 파리 배치 실험, 당 각 그룹에 대 한 3 튜브에서 ° c.
- 실험, 유지는 수집된 최대 35 일 파리와 하루 5, 15, 25, 35에서 자동된 링 분석에 대 한 그들을 사용.
2. 반지 분석 결과 자동
- 전송 10 각 유전자 형 당 수집된 파리 (남녀 공통) 유리병, 다음 나사와 유리병을 확보. 제어 파리와 함께 실험의 각 집합에 대 한 다른 genotypes을 들고 파리를 분석 (최대 10 리 바이 알, 동시에 각 유리병에 10 파리).
- 디지털 카메라 장치, 앞에 설정 하 고 파리 한 번 녹음 시작은 모두 로드 하 고 준비.
- 허용 튜브에 정착 파리에 대 일 분, 후 단계 드라이버를 제어 하는 단계 컨트롤러 설정;이 연속적으로 상승 하 고 4 회 2에서에서 장치 탭을 연결 된 레버를 제어 하는 작은 전기 모터 드라이브 s. 그림 1을 참조 하십시오.
- 도청, 후 파리 벽 승천을 시작 하는 것을 참고. 계속 녹음.
- 2.3에서 60의 간격 3 ~ 5 연속 재판 단계에서 설명한 대로 동기화 반복.
- 5, 15, 25, 그리고 35 일 된 파리에 대 한 실험을 반복합니다. 각 그룹에 대 한 적어도 3 독립적인 실험, 적어도 30 수집 된 각 실험 (3 병) 난다.
3. 데이터 분석
- 컴퓨터에 녹화 된 비디오를 가져올.
- 6 비디오의 스냅샷을 각 재판에 대 한 감청 후 s.
- RflyDetection 소프트웨어에 스냅숏 이미지를 가져오는 ( 그림 2 참조)를 사용 하는 ' 파일 ' 메뉴.
- 도구 모음에서 기본 아이콘을 사용 하 여 다음 이미지에 위와 더 낮은 베이스 라인을 표시 하는 커서를 사용 하 여 정확 하 게는 유리병의 위와 더 낮은 베이스 라인을 설정.
- 에 유리병 (예를 들어, 여기에 10) 당 파리의 수를 입력은 ' rect에 Flys ' 필드와 유리병 길이 (예를 들어, 여기에 14 cm)에 ' 튜브 높이 ' 설정 표시줄에 필드.
- 개별 비행 위치 검색 하 고 각 유리병에 대 한 화면에 표시 됩니다.
참고: 그림 2는 모든 메뉴 단추 클릭의 위치를 나타냅니다.
- 개별 비행 위치 검색 하 고 각 유리병에 대 한 화면에 표시 됩니다.
- 소프트웨어 자동으로 각 비행에 대 한 등반 거리를 결정 하 고 오른쪽 패널에 테이블에 각 유리병에 10 파리에서 평균된 값을 표시 합니다. ( 그림 2 참조)
- 추가 통계 분석을 위해 통계 소프트웨어 (예를 들어, 프리즘) 등반 수 처리.
- 현재 데이터 의미 ± SEM.
- P 계산-의미의 값 (별표로 표시 * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001)를 사용 하 여 단방향 ANOVA Bonferroni 여러 비교 테스트
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Representative Results
이 기사는 비행 부정적인 geotaxis 행동 평가에서 자동된 링 분석 결과의 사용을 보여줍니다. 이전 반지 분석 결과는 달리 우리의 분석 결과 동시에 비행 행동을 동기화 하는 전기 힘을 제공 하 고 파리의 수백까지 분석 하는 자동된 장치 포함 (그림 1). Dicer2;의 분석 DDC > auxR16182 DA 뉴런에 보조 식 비행 운동 활동에 대 한 중요 한 제안 파리 남성과 여성 모두 파리에 대 한 6-s 시간 프레임에서 등반 거리에는 연령에 따라 감소 했다. 상승 능력 auxGFP overexpression 다 신경에 따라 영향을 받을 것 같지 않습니다 그리고 auxR16182 및 auxGFP DA 뉴런에서의 공동 식 구조 RNAi 표현 형 (그림 2 및 그림 3). 다 신경 퇴보와 관련 된 모터 결함을 평가 하기 위한 높은 처리량 및 효율적인 접근 방식으로 자동된 링 분석 결과 검증 하는 것 외에도 이러한 결과 또한 나타낼이 자동화 된 접근 가능성 확인 파 킨 슨 병 위험 요인 그리고 그들의 신경 기능에 단서를 제공 한다.
그림 1입니다. 자동화 된 링 기구. (A 와 B) 전면 및 후면 기구: 소켓 (1), 수직 강철 막대 (2), (6) 프레임 (3), 투명 한 플라스틱 튜브 (4), (5) 바 거품, 금속 기지에 튜브, 마이크로 스텝 드라이버 (7), 전자 컨트롤러 (8)을 보호 하기 위한 나사 스위치 (9), 작은 전기 모터 (10), 및 작은 전기 모터 (11)에 부착 된 레버. 직사각형 금속 프레임의 크기는 46 c m × 26 c m × 16 cm, 들고 10 투명 한 플라스틱 튜브 (2.1 cm 직경, 높이 14.5 cm) 나사와 보안. 장치를 설정 하려면 먼저 클릭 스위치 (9), (8)에, (7), (10) 따라서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 담당자의 분석 스냅샷 이미지 RflyDetection. 스냅샷 이미지 RflyDetection 소프트웨어에 수입 하 고 인터페이스에서 각 아이콘에 대 한 작업 텍스트 오른쪽에 표시 됩니다. 위쪽 및 아래쪽 기준선을 설정한 후 소프트웨어 자동으로 감지 하 고 유리병 안에서 비행 위치를 표시. 등반 거리 (cm)에 6 각 비행에 대 한 s와 각 유리병에 대 한 평균된 값을 테이블에 표시 됩니다. 이 숫자는 다음 추가 통계 분석을 위해 통계 소프트웨어에 가져옵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 통계 막대 그래프에는 연령에 따라 감소를 보여주는 등반 능력 비행 때 보조 식 다 신경에 downregulated. 자동된 링 분석 결과 다음 genotypes을 들고 파리에 대 한 부정적인 geotaxis 동작 분석 하는 데 사용 되었다: auxR16182/ + (Gal4), UAS-Dicer2; DDC Gal4 파리 w1118 (제어), UAS-mCD8GFP (제어), auxR16182, auxGFP, 및 auxR16182; auxGFP (구조)를 넘어. 둘 다 남성과 여성 파리 때 보조 식 다 신경에 감소 되었다 시간이 지남에 현저 하 게 느리게 상승 note. 운전 적자 보조 식 reintroducing 따라 구출 했다. 파리의 5, 15, 25, 35 일 된 평가 됐다. (A) 남성과 여성 (B) 파리는 별도로 표시 됩니다. 다른 바 색상에 해당 하는 유전자 형 레이블 범례는 오른쪽에 표시 됩니다. 데이터는 표시로 평균 ± SEM. p-의미의 값 (별표로 표시 * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, ns: 아무 의미, 바 개체를 나타내기 위해 별표 아래 그린 비교) mCD8GFP 컨트롤 또는 보조 RNAi를 사용 하 여 단방향 ANOVA Bonferroni와 여러 비교 테스트에 비교 하는 것을 계산 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 자동된 링 분석 결과 동시에 파리의 수백에 대 한 비행 부정적인 geotaxis 동작의 높은 처리량 분석을 수 있습니다. 이전 성인 등반을 분석 하기 위한 기존 전략 개별 유리병에 하나의 비행의 관측을 포함 하 고 비행 위치 수동으로 눈에 의해 감지. 이 오히려 지루한 과정 잘못 또는 노동 집약 일 뿐만 아니라 데이터의 오해에 때로는 발생할 수 있습니다. 우리의 자동화 된 반지 분석 결과 간단한 클릭으로 시작 하 고 장치를 자동으로 동기화 하 고 최대 100 파리의 등반 능력을 평가. 전기 동기화 제어 시간 및 다른 매개 변수를 더 정확한 수단을 제공 합니다, 그리고 그래서 성인 등반 하는 것을 비행의 전체 캡처 프로세스 신중 하 게 측정 될 수 있다.
다음으로, 우리의 자체 디자인된 RflyDetection 소프트웨어와 함께 정확한 비행 위치 식별할 수 있습니다. 소프트웨어 고려 전체 2D 유리병 영역 (사각형 프레임에 의해 결정), 및 위쪽 및 아래쪽 기준선에 지정 된 영역 내에서 모든 파리에 대 한 위치를 취득 하기 전에 걸리며 점으로 그들을 선물 한다. 또한, 등반 거리와 평균된 값의 자동 계산 빠르고 쉽게 데이터 조작이 있습니다. 파리의 큰 그룹을 통해 데이터 집합을 듯 수집 하 고 합리적인 시간 프레임7,,89내에서 분석 될 수 있습니다.
연령에 따라 감소 비록 neurodegeneration 연관 등산 활동은 여기 설명,이 분석 결과 분석 발달 결함 관련 운동 활동에 동등 하 게 효과적 이다. 이 위해, 자동화 된 반지 분석 결과 유용 하 고 효율적인 접근을 분석 하기 위한 초파리 부정적인 geotaxis에 어떤 성인 무대에 뇌 기능의 정상 또는 병 적인 상태 이다. 그럼에도 불구 하 고, 분석 결과 사용을 제한 했다 완전히 분석 RflyDetection 소프트웨어에도 불구 하 고 모든 파리의 수동으로 실수로 어떤을 식별 하는 능력 uncaptured 것 들.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 블루밍턴 재고 센터와 비엔나 초파리 RNAi 센터 플라이 주식에 대 한 감사합니다. 링 장치에 대 한 특허는 상하이 고급 연구소, 과학의 중국 아카데미에 속한다. 요청에 RflyDetection 소프트웨어 푸 드 황 하 여야 한다 (저자 목록 참조). 이 작품은 국가 기본 연구 프로그램의 중국에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (973 프로그램 2013CB945602)와 국가 자연 과학 재단의 중국 (31270825 및 31171043). 우리 호 연구소 회원을 토론 및 의견을 위한 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
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