Summary
Bu adım adım protokolü Drosophila negatif geotaxis davranışı sinekler yüzlerce ev sahipliği yapan ve eylemlerinin bir elektrik motoru ile eşitler otomatik çoklu silindir sistemi kullanarak çözümler. Eşitleme sinek negatif geotaxis davranış, dijital kaydedilen ve analiz kendi kendine tasarlanmış RflyDetection yazılım kullanarak denetlesinler.
Abstract
Nörodejeneratif hastalıklar sık ilerici kaybı hareket yeteneği, düşük yaşam süresi ve yaş bağımlı ateş ile ilişkilidir. Bu hücresel mekanizmasını anlamak için olaylar ve onların nedensel birbirleriyle ilişkisi, Drosophila melanogaster, Gelişmiş genetik araçlar ve çeşitli davranış özellikleri ile hastalık modelleri değerlendirmek için kullanılır nörodejeneratif fenotipleri. Burada Drosophila yetişkin negatif geotaxis davranış, ateş ile ilişkili olası motor kusurları için bir göstergesi olarak analiz etmek için bir yüksek-den geçerek yöntemi açıklanmaktadır. Otomatik bir makine tasarlanmış ve daha sonra saniye dakika için bir ders üzerinde negatif geotaxis davranış kayıt sağlayan bir ilk elektrik dürtü kullanarak sürücü sinek eşitleme için geliştirilmiştir. Dijital olarak kaydedilmiş video görüntüleri daha sonra istatistiksel veri işleme için kendi kendine tasarlanmış RflyDetection yazılımı ile işlenir. Tek anında göre el ile kontrollü negatif geotaxis tahlil farklı, bu kesin, hızlı ve yüksek üretilen iş iletişim kuralı veri toplama devamını sağlar sinekler yüzlerce aynı anda, ilerlemek için verimli bir yaklaşım sağlamak bizim Lokomotor açıkları ateş ile ilişkili temel mekanizması anlama.
Introduction
İletişim kuralları ve yöntemleri çeşitli Drosophila yetişkin tırmanma davranışı çözümlemek için geliştirilmiştir. Oldukça zahmetli, geleneksel analiz çoğunlukla bir tek sinek bireysel bir şişe koyarak içerir ve sinekler eşitleme1,2,3için,4aşağı dokunun için el ile bir güç kullanır. Bu sıkıcı ve zaman alıcı, büyük yüksek üretilen iş çalışmaları için uygun olmayan ve sinekler gibi diğer sınırlamalar dokunun eskiden el ile kuvvet potansiyel farklılıklar vardır. Tahlil geliştirmek için hızlı yinelemeli negatif Geotaxis (yüzük) tahlil hangi aynı saat5' te üzerinden çok sayıda yüksek üretilen iş analiz sağlar geliştirilmiştir. Ancak, tahlil hala sinek eylem eşitlemek için el ile uygulamakla bir kuvvet gerektirir. Bizim sürümü önceki tahlil revize yüzük tahlil, birden çok sinek içeren şişeleri sinek eşitleme6sürücü için bir elektrik motoru ile otomatik olarak kontrol hosting bir metal Bankası içerir. Kayıt üzerine hemen eşitleme sonra kaydedildikten sonra tırmanma anında kendini tasarlanmış bir yazılım kullanılarak analiz. Bizim otomatik yüzük tahlil bir tek sinek, teker teker, üzerinden veri toplama sıkıcı ve emek yoğun işlem ortadan ve daha verimli olması verileri edinme işlemi etkin. Buna ek olarak, otomatik yüzük tahlil mekanizması temel Alzheimer aydınlatmak için çalışmalar ve Parkinson Hastaligi, yüksek verim7,8,9 yaklaşımla doğrulama bir sayısında istihdam .
Bu makalede, RNAi sinekler tahrik DDC-Gal4 kullanarak otomatik yüzük tahlil göstermektedir. DDC-Gal4 özellikle dopaminerjik (DA) ve serotonerjik nöron, ifade bir Gal4 böylece ateş10eşlik eden Lokomotor açıkları ile ilişkili hedef gen etkileri analiz etmek için harika bir araç gösteren çizgidir. Buna ek olarak, biz UAS-Dicer2, UAS-Dicer2 oluşturmak için RNAi verimliliği artırır bir sinek çizgi dahil; DDC-Gal4 aracı satır. Kullanmak için seçtiğimiz RNAi sinekler olduğunu auxilin (aux) RNAi v16182 (auxR16182), biz daha önce üzerinde bir etkisi sergilemek belirledik bir gen sinek Lokomotor aktivite8. auxGFP uçar Ayrıca aux overexpression üzerine etkilerini çözümlemek için hazırlanır. Biz otomatik yüzük tahlil sinek negatif geotaxis ölçmek, sonuçları sunmak ve sonuçları elde herhangi bir etkileri görüşmek için nasıl kullanılacağını gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fly toplama
- 25 ° C, % 70 nem ve 12 h/12 h açık/koyu döngüsü standart sinek Gıda sinekler korumak.
- UAS-Dicer2 toplamak; DDC-GAL4 sinek virginsunder karbondioksit (CO 2) anestezi.
- İçin 2 gün eski yetişkin erkek sinek aşağıdaki genotip taşıyan bu bakireler cross: UAS-mCD8GFP (kontrol), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (aux overexpression), ve auxR 16182; auxGFP (kurtarmak, bir erkek ile): kadın oranı 1:2.
- Ayrı toplamak yeni eclosed kadın ve erkek her düzenli sinek flakon 25 standart gıda ile 10 sinekler yerleştirerek her grup deney, başına 3 şişe içinde ° C.
- Bağlı olarak deneme, tutmak toplanan 35 gün uçar ve günde 5, 15, 25 ve 35 otomatik yüzük analiz için kullanýn.
2. Yüzük tahlil otomatik
- Transfer her genotip başına toplanan sinekler (unisex) şişe, sonra şişe bir vida ile güvenli 10. Denetim sinek ve sinek birlikte deneyler her kümesi için farklı genotip taşıyan analiz (en çok 10 şişe aynı anda, her şişeyi 10 sinekli).
- Önünde cihazları yerleştirilen dijital kamera açmak ve bir kez sinek kaydetmeye başlayın tüm yüklendi ve hazır.
- 1dk sinekler şişeleri yerleşmek için izin sonra adım sürücü kontrol eder adım denetleyicisinde açın; bu böylece arka arkaya yükselir ve cihaz 4 kez 2 musluklar bağlı kolu denetlemek için küçük elektrikli motor sürücüler s. Bkz: şekil 1.
- Dokunarak sonra sinekler duvar yükselmeye başlar dikkat edin. Kayıt devam etmesini sağlamak.
- 3-5 ardışık denemeler için 2.3 içinde 60-s aralığı adımda anlatıldığı gibi eşitleme yineleyin.
- 5, 15, 25 ve 35 gün eski sinekler için denemeyi tekrarlamak. Her grup için en az 3 bağımsız deney, en az 30 toplanan ile her deneme (3 şişe) uçar.
3. Veri analizi
- bilgisayara kaydedilen videoyu içe.
- 6'video fotoğrafını çeker her deneme için dokunarak sonra s.
- Anlık görüntü görüntü ithalat RflyDetection yazılım kullanarak (bkz: Şekil 2), ' dosya ' menü.
- Flakon üst ve alt taban tam olarak araç çubuğunda temel simgesini kullanarak ve sonra üst ve alt taban görüntü üzerinde işaretlemek için imleci kullanarak belirlediği.
- İçine şişe (örneğin, 10 işte) başına sinekler sayısı giriş ' rect Flys ' alan ve flakon uzunluğu (örneğin, 14 cm) ' tüp yükseklik ' alan ayarları bar içinde.
- Tek tek sinek pozisyonları tespit ve her şişe için ekranda noktalı etiketli Not.
Not: Resim 2 tüm menü düğmesini tıklama konumlarını gösterir.
- Tek tek sinek pozisyonları tespit ve her şişe için ekranda noktalı etiketli Not.
- Not yazılım otomatik olarak tırmanma her sinek belirler ve bir tablo sağ panelde her şişede 10 sinekler üzerinden ortalama değerleri görüntüler. (Bkz: Şekil 2)
- Daha fazla istatistik analiz istatistiksel yazılım (örneğin, prizma) tırmanma numarasıyla işlemek.
- ± SEM ortalama olarak veri mevcut
- p hesaplamak-değerleri önem (yıldız ile belirtilen * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001) tek yönlü ANOVA Bonferroni ile birden fazla karşılaştırma testini kullanarak
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede sinek negatif geotaxis davranış değerlendirirken otomatik bir yüzük tahlil kullanımını gösterir. Önceki yüzük tahlil bizim tahlil sinek eylem eşitlemek için bir elektrik güç sağlar ve sinek kadar yüzlerce çözümleyen bir otomatik cihaz aynı anda içerir (şekil 1). Dicer2 analizi; DDC > auxR16182 DA nöronların ifadede aux sinek Lokomotor aktivite için çok önemli olduğunu düşündüren uçar uçar, hem erkek hem de kadın için bir 6 sn süre içinde tırmanma mesafe bir yaş bağımlı azalma gösterdi. Yetenek tırmanma DA nöronların auxGFP overexpression üzerine etkilenmiş gibi görünmüyor ve auxR16182 ve auxGFP DA nöronların ortak ifadesi RNAi fenotip (Şekil 2 ve şekil 3) kurtarıldı. Motor kusurları DA nöron dejenerasyonu ile ilişkili değerlendirmek için yüksek-den geçerek ve verimli bir yaklaşım olarak otomatik yüzük tahlil doğrulama ek olarak, bu sonuçlar da otomatik bu yaklaşım potansiyeli belirlenmesinde yararlı olduğunu belirtmek Parkinson hastalığı risk faktörleri ve nörodejeneratif işlevlerine bir ipucu sağlar.
Şekil 1. Otomatik yüzük aparat. (A ve B) ön ve arka sayısı cihazları: soket (1), dikey çelik çubuk (2), tüp metal temel çerçeve (3), şeffaf plastik şişeleri (4), köpük bar (5) (6), mikro-step sürücü (7), elektronik denetleyicisi (8), güvenliğini sağlamak için bir vida switch (9), küçük elektrik motoru (10) ve küçük elektrik motoru (11) bağlı kolu. Dikdörtgen metal çerçeve vida ile güvenli 10 şeffaf plastik şişeleri (2.1 cm çapında, 14,5 cm yüksekliğinde) holding 46 cm × 26 cm × 16 cm uzunluğundadır. Cihaz üzerinde açmak için önce (8) döner, üzerinde (9), geç'i tıklatın (7) ve (10) sonuç olarak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Bir temsilci analizini anlık görüntü görüntü görüntüsünü RflyDetection tarafından görüntü. Anlık görüntü resmi RflyDetection yazılımı içine alınır ve eylem her kutsal kişilerin resmi vasıl belgili tanımlık arayüzey için sağdaki metinle gösterilir. Üst ve alt taban ayarlama sonra yazılım otomatik olarak algılar ve şişe içinde sinek konumunu belirten. Tırmanma uzaklığı (cm) 6 s için her anında ve her şişe ortalama değerlerini bir tabloda görüntülenir. Bu sayılar o zaman daha fazla istatistik analiz istatistik yazılımı içine alınır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. İstatistik çubuk grafikler bir yaş bağımlı düşüş gösteren aux ifade downregulated DA nöronlar içinde olduğunda tırmanma yeteneği uçmak. Otomatik yüzük tahlil negatif geotaxis davranış aşağıdaki genotip taşıyan sinekler için analiz etmek için kullanıldı: auxR16182/ + (Hayır Gal4), UAS-Dicer2; DDC-Gal4 sinekler geçti w1118 (kontrol), UAS-mCD8GFP (kontrol), auxR16182, auxGFPve auxR16182; auxGFP (kurtarma) için. Not hem erkek hem de dişi sinekler önemli ölçüde yavaş ne zaman aux ifade DA nöronların düşürüldü zaman içinde tırmandı. Lokomotor açıkları aux ifade reintroducing üzerine kurtarıldı. Sinekler 5, 15, 25 ve 35 gün eski değerlendirildi. (A)erkek ve kadın (B) sinekler ayrı ayrı gösterilir. Efsaneler genotip etiketleri farklı bar renge karşılık gelen sağ tarafta gösterilir. Veri olarak ortalama ± SEM pgösterilir-değerleri önem (yıldız ile belirtilen * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns: anlam, bir bar nesnelere belirtmek için yıldız işaretleri aşağıda çizilmiş karşılaştırmak) mCD8GFP denetimi veya aux RNAi tek yönlü ANOVA Bonferroni ile birden fazla karşılaştırma testi kullanılarak karşılaştırma hesaplanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan otomatik yüzük tahlil aynı anda yüzlerce sinekler sinek negatif geotaxis davranışının yüksek üretilen iş çözümleme sağlar. Daha önce bir tek sinek bireysel bir şişe içinde gözlemleri yetişkin tırmanma analiz etmek için mevcut stratejileri içerir ve sinek konumu el ile göz tarafından algılanır. Bu oldukça sıkıcı oluşum bazen yanlış okuyup veya veri, hem de emek yoğun iş yanlış yorumlanmasına yol açabilir. Bizim otomatik yüzük tahlil basit bir tıklama ile başlar ve cihaz otomatik olarak eşitler ve ilâ 100 sinekler tırmanma yeteneği değerlendiriyor. Elektrik eşitleme kontrol zaman ve diğer parametreleri için daha kesin bir yol sağlar, ve genel yakalama sinek kadar yetişkin tırmanma işlemi dikkatle ölçülebilir.
Sonra bizim kendi kendine tasarlanmış RflyDetection yazılımı ile tam sinek olarak tanımlanabilir. Yazılımı pozisyonlar için belirlenen alanı içinde tüm sinekler alınıyor önce dikkate genel 2D şişe alanı (dikdörtgen çerçeve tarafından belirlenir) ve üst ve alt taban alır ve bunları noktalar sunar. Ayrıca, otomatik hesaplamayı tırmanma mesafe ve ortalama değerleri daha hızlı ve daha kolay veri işleme sağlar. Veri setleri sinekler büyük bir grup üzerinde tanıdıklarını toplanacak ve bir makul zaman dilimi7,8,9içinde analiz.
Bir yaş bağımlı düşüş olsa bile ateş ile ilişkili tırmanma etkinliği burada anlatılan, bu tahlil eşit Lokomotor aktivite gelişimsel hatalarına karşı ilgili analiz etkilidir. Bu amaçla, otomatik yüzük tahlil Drosophila negatif geotaxis yetişkin herhangi bir aşamada ve iki beyin fonksiyonu normal veya patolojik durumunu analiz etmek için yararlı ve verimli bir yaklaşım olduğunu. Yine de, tahlil kullanımı sınırlı olan tamamen RflyDetection yazılım rağmen tüm sinekler analiz el ile herhangi bir yanlışlıkla tanımlama yeteneği olanlar topraklarımız'ın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Bloomington stok merkezi ve Viyana Drosophila RNAi Merkezi sinek hisse senetleri için teşekkür ederim. Yüzük cihazları için patent için Shanghai gelişmiş Araştırma Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi ait. RflyDetection yazılım Fu-de Huang yapılmalıdır için İstekler (yazar listeye bakın). Bu eser Ulusal temel araştırma programı, Çin'den hibe tarafından desteklenmiştir (973 Program 2013CB945602) ve Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31270825 ve 31171043). Ho laboratuvar üyeleri tartışma ve Yorumlar için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
- Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
- Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
- Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
- Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
