Summary
Этот шаг за шагом протокола анализирует поведение отрицательных geotaxis дрозофилы , с использованием автоматизированной системы многоцилиндровых, которая содержит сотни мух и синхронизирует их действий, электродвигатель. После синхронизации assayed летать негативные geotaxis поведение, записанные в цифровом формате и проанализированы с помощью RflyDetection программного обеспечения собственной разработки.
Abstract
Нейродегенеративные заболевания часто связаны с постепенной утратой способности движения, сокращение продолжительности жизни и нейродегенеративные зависит от возраста. Чтобы понять механизм клеточного этих событий и их причинно-следственных связей друг с другом, Drosophila melanogaster, с его сложных генетических инструментов и разнообразных поведенческих особенностей, используются в качестве модели заболеванием для оценки нейродегенеративных фенотипов. Здесь мы описываем метод высокой пропускной способностью анализировать поведение взрослых негативные geotaxis дрозофилы , как признак для возможных моторных дефектов, связанных с нейродегенеративные. Автомат разработан и создан для привода летать синхронизации с использованием первоначальный Электрический импульс, затем позволяя запись негативного geotaxis поведения течение секунд до минут. Изображения из цифровой записи видео затем обрабатываются с помощью собственной разработки программного обеспечения RflyDetection для обработки статистических данных. В отличие от управляемые вручную негативные geotaxis assay основанный на один летать, этот точные, быстрые и высок объём протокол позволяет сбора данных из более чем сотни мух одновременно, обеспечивая эффективный подход для продвижения наших понимание в основной механизм двигательного дефицита, связанные с нейродегенеративные.
Introduction
Целый ряд протоколов и методов были разработаны для анализа дрозофилы взрослых восхождение поведения. Довольно трудоемким, традиционный анализ главным образом включает в себя положить один летать в отдельных флакона и использует ручной силы для коснитесь летит вниз для синхронизации1,2,3,4. Это утомительно и времени, не подходит для крупных высок объём исследований и имеет потенциал вариантов ручной силы для нажмите вниз мух, а также другие ограничения. Чтобы улучшить assay, пробирного быстрого итеративного негативные Geotaxis (кольцо) была разработана, который позволяет высок объём анализ многочисленных мух на же время5. Однако проба по-прежнему требует вручную оказания силы для синхронизации летать действий. Наша версия кольцо assay, пересмотрен после предыдущего анализа, включает в себя металл базу хостинг несколько летать содержащих флаконов, автоматически контролируется электродвигатель ездить летать синхронизации6. После записи, Муха, восхождение сразу после синхронизации регистрируется затем анализируются с помощью собственной разработки программного обеспечения. Наша автоматизированная пробирного кольцо устранила утомительным и трудоемким процессом сбора данных от одной мухи, один в то время и включен процесс сбора данных быть более эффективным. Кроме того в ряде исследований для выяснения механизма основной Альцгеймера и Паркинсона, проверка подход с высокой эффективностью7,8,9 был нанят автоматизированных assay кольцо .
В этой статье мы демонстрируем автоматизированных пробирного кольцо, с помощью DDC-Gal4 инициативе RNAi мух. DDC-Gal4 линия Gal4 конкретно выражая дофаминергической (DA) и серотонинергической нейронов, таким образом представляя большой инструмент для анализа целевого гена эффекты, связанные с двигательного дефицита, сопровождающих нейродегенеративные10. Кроме того мы внедряем Бла-Dicer2, летать линии, что повышает эффективность интерференции, сформировать бла-Dicer2; DDC-Gal4 инструмент линия. RNAi мух, мы решили использовать это auxilin (aux) v16182 интерференции (auxR16182), ген, который мы определили ранее выставлять влияние на двигательную активность8летать. для анализа воздействия на aux гиперэкспрессия готовы также auxGFP мух. Мы покажем как использовать автоматизированные кольца assay измерить летать негативные geotaxis, результаты и обсудить любые последствия, полученные результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fly коллекции
- сохранить мух на стандартных покупать продовольствие при 25 ° C, влажность 70% и цикл 12 h/12 h свет/темно.
- Собирать бла Dicer2; DDC-GAL4 летать virginsunder анестезии двуокиси углерода (CO 2).
- Крест эти Девы 2-дневных взрослых мужчин мух, перевозящих следующие генотипы: Уан mCD8GFP (контроль), auxR 16182 (aux RNAi) auxGFP (aux гиперэкспрессия), и auxR 16182; auxGFP (спасения), с мужчиной: женский соотношение 1:2.
- Отдельно собирать недавно eclosed мужчин и женщин в 3 флаконов для каждой группы за эксперимент, размещение 10 мух в каждом регулярно летать флакон с стандартное питание на 25 ° с.
- В зависимости от эксперимента, сохранить собранные летит до 35 дней и использовать их для автоматического анализа кольцо в день 5, 15, 25 и 35.
2. Автоматизированный кольцо Assay
- передачи 10 собранных мух (унисекс) за генотипа в каждом флаконе, а затем безопасного флакона с винтом. Анализ управления мух и мух, перевозящих различных генотипов вместе для каждого набора экспериментов (до 10 ампул одновременно, 10 мух в каждом флаконе).
- Включите цифровой камеры, расположенной перед аппаратом, и начать запись после мухи все загружены и готовы.
- После позволяя 1 мин для мух поселиться во флаконах, включите шаг контроллера, который управляет шаг драйвера; это диски небольшой электродвигатель для управления рычага, так что он последовательно поднимается и краны аппарат 4 раза в 2 s. Смотрите Рисунок 1.
- После касания, обратите внимание, что мухи начинают восхождение стены. Убедитесь, что запись продолжается.
- Повторить синхронизации, как описано в шаге 2.3 в 60-х интервал для последовательных испытаний 3-5.
- Повторить эксперимент по 5, 15, 25 и 35 день старые мух. Проводить по крайней мере 3 независимые эксперименты для каждой группы, каждый эксперимент с по крайней мере 30 собранных мухи (3 флаконов).
3. Анализ данных
- Импорт записанного видео в компьютер,.
- Снимок видео на 6 сек после разговоров, для каждого разбирательства.
- Импорт моментального снимка образа в RflyDetection программного обеспечения (см. рис. 2), используя ' файл ' меню.
- Установить верхний и нижний базовых флакон точно, используя базовые значок на панели инструментов и затем курсор для обозначения верхних и нижних исходных линий на изображении.
- Ввода количество мух на флакон (например, 10 здесь) в ' летит в rect ' поле и флакон длины (например, 14 см здесь) в ' высота трубы ' поля в строке параметров.
- Обратите внимание, что индивидуальные летать позиции обнаруживаются и помечены точками на экране для каждого флакона.
Примечание: На рисунке 2 показывает позиции всех нажатий кнопок меню.
- Обратите внимание, что индивидуальные летать позиции обнаруживаются и помечены точками на экране для каждого флакона.
- Обратите внимание, что программное обеспечение автоматически определяет восхождение расстояние для каждого fly и отображает усредненные значения из 10 мух в каждом флаконе в таблице на правой панели. (См. Рисунок 2)
- Восхождение номер с статистического программного обеспечения (например, Призма) для дальнейшего анализа процесса.
- Подарок, данные как средний ± SEM.
- Вычисления p-значения значение (обозначаются звездочками, * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001) с использованием односторонний дисперсионный анализ с Бонферрони множественные сравнения test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эта статья демонстрирует использование автоматизированных assay кольцо в оценке летать негативные geotaxis поведение. В отличие от предыдущих assay кольцо, наши пробирного включает автоматизированный аппарат, который обеспечивает электрической силы для синхронизации летать действий и анализирует до сотни мух одновременно (рис. 1). Анализ Dicer2; DDC > auxR16182 мух показал снижение возраста зависимых восхождение на расстоянии в 6-s временные рамки для мужчин и женщин мухи, предполагая, что aux выражение в DA нейронов имеет решающее значение для fly двигательной активности. Восхождение способности, кажется, не будут затронуты при auxGFP гиперэкспрессия в DA нейронов, и Сопредседатель выражение auxR16182 и auxGFP в DA нейронов спасли RNAi фенотип (рис. 2 и рис. 3). В дополнение к проверке автоматизированных assay кольцо как высок объём и эффективный подход для оценки моторных дефектов, связанных с DA нейрон дегенерации, эти результаты также показывают, что это автоматизированный подход является полезной в выявлении потенциальных Риск болезни Паркинсона факторов и предоставляет ключ на их нейродегенеративных функции.
Рисунок 1. Автоматизированный аппарат кольцо. (A и B) передний и задний вид аппарата: гнездо (1), вертикальный стальной стержень (2), винт для обеспечения трубку на раму (3), прозрачные пластиковые флаконы (4), пена бар (5), металлическая база (6), микро шаг драйвер (7), электронный контроллер (8), переключатель (9), небольшой электродвигатель (10) и рычаг, придает небольшой электродвигатель (11). Размер прямоугольной металлокаркаса — 46 см × 26 см × 16 см, проведение 10 прозрачный пластиковых флаконах (2,1 см в диаметре, 14,5 см в высоту), обеспеченные с помощью винтов. Чтобы включить аппарат, сначала нажмите на переключатель (9), который включается (8), (7) и (10) соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Анализ представителя снимок изображения на RflyDetection. Снимок изображения импортируются в RflyDetection программного обеспечения и действий для каждого значка в интерфейсе указывается с текстом справа. После установки верхней и нижней исходных данных, программное обеспечение автоматически обнаруживает и знаменует летать позицию внутри флакона. Альпинистские расстояние (см) в 6 s для каждого fly и усредненные значения для каждого флакона отображаются в таблице. Эти цифры, затем импортируются в статистическое программное обеспечение для дальнейшего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Статистические графики бар показаны снижением возраста зависимых летать восхождение способность когда выражение aux downregulated DA нейронов. Автоматизированный assay кольцо использовался для анализа негативных geotaxis поведение для мух, перевозящих следующие генотипы: auxR16182/ + (не Gal4), бла-Dicer2; DDC-Gal4 мух пересекли w1118 (управления), бас mCD8GFP (контроль), auxR16182, auxGFP, и auxR16182; auxGFP (спасения). Обратите внимание, что мужчины и женщины мухи поднялся значительно медленнее, со временем, когда выражение aux был сокращен в DA нейронов. Опорно-двигательного дефицита были спасены по реинтродукции aux выражение. Летит по 5, 15, 25 и 35 день старые были оценены. Самец (A) и женского (B) мух показываются отдельно. Легенды с генотип этикетки, соответствующие различным бар цвета отображаются справа. Данные отображаются как среднее ± SEM. p-значения значение (обозначаются звездочками, * p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, НС: не имеет значения, Бар было обращено ниже звездочек, чтобы указать объекты для сравнить) были рассчитаны по сравнению с mCD8GFP управления или aux интерференции с помощью односторонний дисперсионный анализ с Бонферрони множественные сравнения теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Автоматизированных пробирного кольцо, описанные здесь позволяет одновременно высок объём анализ поведения летать негативные geotaxis сотни мух. Ранее существующих стратегий для анализа взрослых восхождение включать замечания одной мухи в отдельных во флаконе, и летать позиция определяется вручную глаз. Это довольно трудоемкий процесс может иногда вызывать искажения или неправильного толкования данных, а также трудоемкой работы. Наша автоматизированная пробирного кольцо начинается с простым нажатием кнопки, и аппарат автоматически синхронизирует и оценивает восхождение способность до 100 мух. Электрические синхронизации обеспечивает более точное время управления и других параметров, поэтому общего захвата летать взрослых восхождение процесса может быть тщательно измерена.
Далее с нашей собственной разработки программного обеспечения RflyDetection, можно определить точное положение летать. Программное обеспечение принимает в рассмотрение общего 2D флакона (определяется прямоугольной рамки) и верхней и нижней исходных линий, до приобретения позиций для всех мух в назначенной области и представляет их в виде точек. Кроме того автоматический расчет восхождение расстояния и усредненные значения позволяет быстрее и проще с данными. Наборы данных над большой группы мух можно правдоподобно собраны и проанализированы в течение разумного периода времени7,8,9.
Даже несмотря на то, что снижение возраста зависимых альпинизма деятельности, связанной с нейродегенеративные описан здесь, этот assay столь же эффективным в анализе двигательной активности отношение к пороков развития. С этой целью автоматизированных assay кольцо это полезный и эффективный подход для анализа дрозофилы негативные geotaxis в любой взрослой стадии и либо нормальный или патологические состояния функции мозга. Тем не менее, assay ограниченное использование полностью анализа всех мух несмотря на RflyDetection программного обеспечения Неуловленные те способности вручную определить любые случайно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Блумингтон фондовой центр и Венский центр RNAi дрозофилы летать запасов. Патент на кольцо аппарат принадлежит к Шанхай передовых научно-исследовательский институт, Китайской академии наук. Просит за RflyDetection программное обеспечение должно быть Фу-де-Хуан (см. список авторов). Эта работа была поддержана грантов от национальной программы базовых исследований Китая (973 программы 2013CB945602) и национальные естественные науки фонд Китая (31270825 и 31171043). Мы благодарим членов Хо лаборатории для обсуждения и комментариев.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
- Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
- Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
- Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
- Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
