Summary
このステップ バイ ステップのプロトコルは、ハエの数百をホストし、電気モーターで彼らの行動を同期自動マルチ シリンダー システムを用いたショウジョウバエ負の走動作を分析します。試金飛ぶ負走動作同期、デジタル記録および自己設計されていた RflyDetection ソフトウェアを使用して分析しました。
Abstract
神経変性疾患は、運動能力、減らされた寿命、年齢依存性神経変性の進歩的な損失に頻繁に関連付けられます。これらの細胞のメカニズムを理解するには、イベント、および高度な遺伝学的ツールと多様な行動特徴、相互、キイロショウジョウバエ、これらの因果関係、モデルとして使用疾患を評価するため神経変性の表現型。ここでの神経変性に関連する運動障害のための徴候としてショウジョウバエ大人の負の走動作を分析する高スループット方法をについて説明します。自動機設計、ドライブ飛ぶ同期の後で分に秒の経過とともに負の走動作の記録をできるように、初期の電気衝動を使用するために開発。デジタル録画したビデオからの画像の統計データ操作の自己設計されていた RflyDetection ソフトウェアで処理されます。1 つのフライに基づいて手動で制御される負走アッセイとは異なり、この高速、高精度、高スループット プロトコルにより、データ集録からハエの何百ものよりも、同時に事前に効率的なアプローチを提供すること、神経変性疾患に関連付けられている運動の赤字の基になるメカニズムを理解します。
Introduction
さまざまなプロトコルおよび方法は、ショウジョウバエ成人登山行動を分析するために開発されています。かなり骨の折れる、伝統的な分析はほとんど 1 つのフライを入れている個々 のバイアルが含まれます、同期1,2,3,4のハエを叩く手動力を使用します。退屈な時間のかかる、高スループットの大規模研究には不向きで、ハエだけでなく、その他の制限をタップするために使用マニュアルの力の潜在的な変化です。アッセイを改善するために同じ時間5時多数のハエを高スループット分析が可能迅速な反復負走 (リング) アッセイを開発されました。ただし、アッセイはまだ飛ぶアクションを同期に手動で発揮力が必要です。改訂前の測定の時にリングの試金の私達のバージョンには、自動的に飛ぶ同期6を駆動する電気モーターによって制御される複数のフライを含むバイアルをホスティング金属ベースが含まれています。録音時に同期が、記録された後すぐにクライミング場を用いて自己設計されていたソフトウェア。私たちの自動化されたリングの試金、1 つずつ、1 つのフライからのデータ収集に手間と労力のかかるプロセスを排除しより効率的なデータ取得プロセス。さらに、自動リング アッセイは、機構の基になるアルツハイマーを明らかにする研究、パーキンソン病、高効率7,8,9 でのアプローチを検証の数で採用されています。.
この記事では、RNAi ハエを駆動DDC Gal4を使用して自動化されたリングのアッセイを示しています。DDC Gal4はドーパミン作動性 (DA) とセロトニン神経細胞で具体的に表現する Gal4 ライン10神経変性を伴う運動障害に関連付けられているターゲット遺伝子の効果を分析するための素晴らしいツールをこうして表します。さらに、我々 はUA Dicer2UAS-Dicer2;を生成するための RNAi の効率を高めるフライラインを組み込むDDC Gal4ライン ツールします。私たちを使用する選択 RNAi ハエはオーキシリン(aux) RNAi v16182 (auxR16182)、我々 は以前の効果を展示する識別した遺伝子飛ぶ運動8。auxGFPハエもaux過剰発現に及ぼす影響を分析するため用意しています。自動リング試金を使用してフライ負走を測定、結果を提示し、結果から取得で何か影響を議論する方法を紹介します。
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Protocol
1 飛ぶコレクション
- 25 ° C、湿度 70%、12/12 h 明暗サイクルで標準的なはえの食糧にハエを維持します。 。
- 収集 UAS-Dicer2;DDC GAL4 フライ virginsunder 二酸化炭素 (CO 2) 麻酔 。
- は 2 日間の古い大人の男性のハエの次の遺伝子型を運ぶにこれらの処女をクロス: UA mCD8GFP (コントロール) auxR 16182 (aux RNAi) 、auxGFP (aux 過剰発現)、および auxR 16182;auxGFP (救助)、男性: 女性の比率 1:2 。
- 個別収集新しく 25 で標準的な食品の各正規フライ バイアルに 10 ハエを配置する実験ごとに各グループの 3 バイアルにこの男女 ° C
- 実験によって維持、収集まで 35 日間を飛ぶし、5、15、25、35 日で自動リング分析に使用します 。
2。リング測定を自動化
- 転送 10 採集されたハエ (男女兼用) 遺伝子ごとに各バイアル、し、ネジでバイアル。コントロールや一緒に実験のセットごとに異なる遺伝子型を運ぶ蠅を分析 (最大で 10 バイアル同時に各バイアル 10 ハエ).
- 装置の前に置かれたデジタル カメラの電源し、ハエを一度録音を開始、すべて読み込まれ、準備ができています 。
- バイアルに定住するハエの 1 分を可能にした後オンにステップ ドライバー制御ステップ コント ローラー; これは、連続して上昇し、4 回に 2 装置をタップを接続されているレバーを制御する小さな電気モーター ドライブ s。 図 1 を参照してください。
- めねじでは、ハエが壁を登るを開始することに注意してください。録音を続けることを確認します 。
- 3 に 5 の連続した試験の 2.3 で 60 の間隔の手順の説明に従って、自動同期を繰り返す 。
- は、5、15、25、35 日間の古いハエの実験を繰り返します。グループごとに、少なくとも 3 の独立した実験を行う、各実験に少なくとも 30 収集飛ぶ (3 バイアル).
3。データ分析
- 録画したビデオをコンピューターにインポートします 。
- 6 でビデオのスナップショットを取るトライアルごとにタップした後で s.
- RflyDetection ソフトウェア スナップショット イメージをインポート ( 図 2 を参照) を使用して、' ファイル ' メニュー 。
- ツールバーの [ベースライン アイコンを使用して画像の上限と下限のベースラインをマークするカーソルを使用して正確にバイアルの上限と下限のベースラインを設定します 。
- 入力 (例えば、10 ここ) バイアルあたりハエの数、' rect を飛ぶ ' フィールドとバイアルの長さ (例えば、14 cm ここ) で、' チューブ高さ ' 設定バー内にあるフィールド。
- 個々 の飛行位置を検出し、各バイアルの画面上のドットの付いたメモします
。 注: 図 2 は、すべてのメニューのボタンのクリックの位置を示します 。
- 個々 の飛行位置を検出し、各バイアルの画面上のドットの付いたメモします
- ソフトウェアは自動的に各フライの登山距離を決定します、右側のパネルの表に各バイアルに 10 ハエから平均値が表示されます。( 図 2 参照)
- プロセス、さらに統計分析統計ソフトウェア (例えば プリズム) 登山番号です 。
- 現在データとして意味 ± SEM.
- P を計算-意義の値 (アスタリスクで示されている * p < 0.05、* * p < 0.01、* * * p < 0.001) 複数の比較テスト ボンフェローニの一方通行 ANOVA を使用して
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Representative Results
この記事では、フライの負の走動作を評価する自動リング アッセイの使用を示します。以前リング アッセイとは異なり、我々 の分析含む飛ぶアクションを同期に電気の力を提供し、数百のハエを分析自動化装置同時に (図 1)。Dicer2; の解析DDC > auxR16182 、DA ニューロンのaux式、フライの自発運動に重要示唆しているハエは、男女ともにハエの 6 のタイム フレームで登山距離、年齢依存的な低下を示した。DA ニューロン、 auxGFP過剰発現に影響していないよう登坂力と共同auxR16182およびauxGFP DA ニューロンで発現救出 RNAi 表現型 (図 2および図 3)。検証に加えて自動リング アッセイ DA ニューロン変性に関連付けられているモーターの欠陥を評価するための高スループットで効率的な方法として、これらの結果もこの自動化されたアプローチがある可能性を特定するに役に立つパーキンソン病のリスク因子し、神経変性職務上の手掛かりを提供します。
図 1。自動リング装置。(AとB) フロントと装置の背面ビュー: (6) フレーム (3)、透明プラスチック バイアル (4)、バー (5) 泡、金属ベースの管、マイクロ ステップ ドライバー (7)、電子コント ローラー (8) を確保するためのネジ、垂直鋼棒 (2) ソケット (1)スイッチ (9)、小型モータ (10)、小さな電気モーター (11) に接続されているレバー。長方形の金属フレームのサイズは、46 cm × 26 cm × 16 cm、10 透明なプラスチック バイアル (直径 14.5 cm 高さ 2.1 cm) ネジを使用して保護を保持しています。装置をオンに最初 (8) が点灯するスイッチ (9) をクリックして (7) と (10) その結果。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。代表の分析 RflyDetection による画像のスナップショットします。スナップショット イメージは RflyDetection ソフトウェアにインポートし、インターフェイスで各アイコンのアクション、右側のテキストで示されます。上部と下部の基準計画を設定した後、ソフトウェアは自動的に検出し、バイアル内フライの位置をマークします。6 登山距離 (cm) 各フライの s と各バイアルの平均値がテーブルに表示されます。これらの数字は、さらに統計分析のための統計解析ソフトウェアにインポートされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。統計バー グラフの年齢に依存して減少を示す登山能力を飛ぶは、 aux式が DA ニューロンのダウンレギュ レートします。自動リング試金が次の遺伝子型を運ぶハエの負の走動作の分析に使用された: auxR16182/+ (ないの Gal4) UA Dicer2;DDC Gal4ハエw1118 (コントロール)、 UA mCD8GFP (コントロール) auxR16182auxGFPとauxR16182; auxGFP (救助) に渡った。男性と女性の両方のハエ登ったときaux式の DA ニューロンの減少した時間をかけて大幅に遅くなることに注意してください。歩行障害は、 aux式を再導入時に救出されました。5、15、25、35 日間の古いのハエを評価しました。男性 (A) と (B) のメスの成虫が個別に表示されます。遺伝子型ラベルの異なるバーの色に対応する伝説は、右側に表示されます。データのとおり、平均 ± SEM. p-意義の値 (アスタリスクで示されている * p < 0.05 * * p < 0.01、* * * p < 0.001、ns: オブジェクトを示すアスタリスクの下意義、バーが描画されません比較) mCD8GFPコントロールまたはaux RNAi ボンフェローニの多重比較検定一方通行 ANOVA を使用して比較することを求めた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明した自動リング アッセイはハエの何百ものフライの負の走動作の高スループット解析を同時にできます。以前アダルト登山を分析するための既存の戦略を含む個々 のバイアルで 1 つのフライの観察と目で飛ぶ位置を検出して手動で。このむしろ退屈なプロセスは、誤読や労働集約的な仕事と同様、データの誤解もあります。私たちの自動化されたリングの試金は単純なクリックで始まり、装置は自動的に同期および最大 100 はえのクライミング能力を評価します。電気の同期時間を制御し、他のパラメーターより正確な手段を提供します、大人登山飛ぶの全体的なキャプチャ プロセスを慎重に測定できます。
次に、私たちの自己設計されていた RflyDetection のソフトウェアとフライの正確な位置を識別できます。ソフトウェアは、指定領域内のすべてのハエの位置を取得する前に (長方形フレームによって決まる)、考慮全体的な 2D バイアル領域、上部と下部の基準を考慮し、ドットとしてそれらを提示します。さらに、登山距離と平均値の自動計算は、迅速かつ容易にデータ操作を実行できます。ハエの大規模なグループをデータ セットのもっともらしく収集し、合理的な時間枠7,8,9内で解析することができます。
年齢依存性に減少にもかかわらず神経変性に関わる登山活動はここに記載されて、このアッセイは同様に発達障害に関連する活動の分析に有効です。このため、自動リング試金はいずれか、任意の大人の段階で脳機能の正常組織及び病変状態ショウジョウバエ負走を分析するための便利で効率的なアプローチです。それにもかかわらず、アッセイの限定使用で RflyDetection ソフトウェアにもかかわらずすべてのハエを完全に分析手動で誤って識別する能力 uncaptured もの。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ブルーミントンの在庫センターとウィーンショウジョウバエRNAi のはえの在庫センターに感謝しますリング装置のためのパテントは、中国科学院上海高等研究所に帰属します。RflyDetection ソフトウェアは、フー ・ ド ・黄にすべきである要求 (著者リスト参照)。この仕事は基本的な研究プログラムの中国国家からの補助金によって支えられた (973 プログラム 2013CB945602)、国家自然科学基金、中国の (31270825 および 31171043)。Ho 研究室メンバーのディスカッションとコメントに感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
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