Summary
El yazması, bir maya tabanlı Floresans muhabir tahlil kaçakçılığı dahil ve bitki toksin Risin (RTA) bir alt birim sitotoksik süreçleri öldürmek hücresel bileşenleri tanımlamak için nasıl kullanılacağını açıklar.
Abstract
Bakteriyel ve bitki A / B toksinler yararlanmak doğal ticaret yolları ökaryotik hücrelerde sitozol onların hücre içi isabet ulaşmak için ve en sonunda öldürmek için. Böyle A / B toksinler genellikle oluşur bir enzimatik etkin Asubunit (örneğin, "Risin" toksin (RTA)) ve bir veya daha fazla hücre için belirli bağlama toksin yüzey reseptörleri hücre için sorumlu olan Bsubunit(s), bağlama. Nasıl bizim mevcut bilgi A / B toksinler verimli endositoz ve intraselüler protein yüksek ökaryotik hücrelerde sıralama gibi temel hücresel mekanizmaları anlamaya yardımcı hücreleri bilim adamları sarhoş edici yetenekli. Tıbbi açıdan, aynı şekilde büyük toksin ticaret yolları hastalar için yeterli tedavi çözümleri bulmak veya sonunda kanser tedavisi için tedavi toksin tabanlı uygulamalar geliştirmek için tanımlamak önemlidir.
Beri genom çapında analizleri a / B toksin memeli hücrelerinde kaçakçılığı, zaman alıcı, karmaşık ve pahalı, çeşitli çalışmalarda a / B toksin taşıma Saccharomyces cerevisiaeMaya model organizma olarak gerçekleştirilen. Maya ve daha yüksek ökaryotik hücrelerin daha az karmaşık, temel hücresel süreçler olmasına rağmen çok sık Maya elde edilen sonuçlar ve vardır benzer memeli durumuna aktarılabilir.
Burada, hücre içi RTA Maya ticareti analiz etmek için hızlı ve kolay muhabir tahlil açıklayın. Yeni tahlil önemli bir avantajı sitozol sadece RTA retro-translocation endoplazmik retikulum (ER) üzerinden araştırmak için bir fırsattır, ama oldukça endositoz ve retrograd toksin acil servise plazma zarı taşıma. Tahlil geçici kullanma-in RTA toksisite Floresans emisyon yeşil flüoresan protein (GFP) aracılığıyla dolaylı ölçüm sağlar bir muhabir plazmid vivo içinde çeviri sonra. RTA verimli 28S rRNA depurination tarafından protein biyosentezi inisiyasyon önlediğinden bu tahlil konak hücre proteinleri tanımlaması değişiklikleri tespiti yoluyla hücre içi RTA ulaşım dahil Floresans emisyon sağlar.
Introduction
Etkili tedavi tedaviler hala büyük ölçüde eksik olduğundan hastalarda bulaşan bakteri üreten toksin tarafından her sosyal sağlık sistemi için ciddi bir tıbbi ve mali yük özellikle temsil eder. Yeni tedavi stratejileri, tıbben a karmaşık bağımlılık yapan maddeler mekanizmaları geliştirmek için / B toksinler kolera toksini, Shiga toksin veya "Risin" gibi tam olarak uygulanmalıdır roman güçlü deneyleri üzerinde dayalı moleküler seviyede anlaşılması gerekir.
Son yıllarda, birçok araştırma A analiz girişiminde / B toksin taşımacılığında Maya ve radyoaktif toksin gibi zaman alıcı ve maliyet yoğun yöntemleri kullanarak memeli hücreleri etiketleme siRNA tabanlı tarama yanı sıra1,2 3yaklaşıyor. Bazı durumlarda, toksin kaçakçılığı Floresans mikroskobu tarafından görüntülenmeyecektir vivo içinde bireysel toksini alt birimleri fluorophores, kuantum nokta veya floresan proteinler4,5ile kimyasal ve/veya genetik kaplin sonra olmuştur. Ne yazık ki, bu değişiklikler genellikle etkin olmayan ve/veya değiştirilmiş doğal özellikleri toksinler için yol. Enzim lacZ, luciferase veya floresan proteinler gibi temel muhabir sistemlerinin kullanımı dolaylı olarak çok çeşitli bilimsel sorular cevap vermenin başka bir zarif yolu yok (örneğin GFP veya Discosoma sp. kırmızı floresan protein () dsRed)).
Bu makale, basit bir protokol, extracellularly uygulanan RTA S. cerevisiaehücre içi taşıma gereken hücresel bileşenleri tanımladığı açıklanmıştır. Böylece, dolaylı olarak GFP Floresans emisyon tarafından sonra içinde vivo RTA-aracılı protein çeviri inhibisyon ölçen bir protein biyosentezi sensör GFP tarafından takip bir N-terminal ER-Mümessillik sinyal içeren bir floresan-muhabir plazmid görür çeviri6. RTA endositoz ve/veya hücre içi ticareti olumsuz (veya olumlu) etkilenir ki vahşi-türüne göre belirli Maya silme mutant içinde durumda bu bir artış (ya da azalmak) GFP Floresans emisyon6' tespit edilebilir.
Şimdiye kadar tüm yöntemleri Maya hücreleri RTA Ulaştırma analiz RTA ER sitozol retro-translocation sürecine sınırlandı. Böyle yapay bir sistemde, bir ER alma sinyali içeren RTA bir intihar fenotip1,7' kaynaklanan bir indüklenebilir organizatörü üzerinden ifade edilir. B-alt "Risin" in birim bağlama hücre aynı şekilde bu el yazması açıklanan deneysel kurulumunda eksik ve böylece, tamamen doğal durum "Risin" holotoxin zehirlenme8, toksin taşıma plazma temsil etmiyor olsa da, membran acil servise Golgi aygıtı aracılığıyla yakından bu roman tahlil ile taklit. İlginçtir, pilot çalışmada elde edilen ilk sonuçlar RTA tarafından kullanılan ticaret yolları "Risin" holotoxin zehirlenme güzergahı ile çarpıcı benzerlikler ortaya gösterir.
Özet olarak, açıklanan yöntemi belirli bir rolü RTA endositoz seçili hücresel proteinler ve Maya kaçakçılığı belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu deneysel kurulumu kolayca diğer ribozom üretilen ve çeşitli Maya ve bakteriyel türler gibi zymocin veya Shiga toksin salgıladığı toksinler ihracı için adapte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Resim 1' de genel deneysel iş akışı genel bakış tasvir edilir.
Dikkat: RTA insanlar için çok toksiktir. Emanet laboratuvar izni S2 (Biyogüvenlik seviye 2 eşdeğeri) gereklidir. Lütfen tüm deneme sırasında eldiven.
1. Contegra ifadesi O'nun öğesini RTA Escherichia coli olarak
- E. coli hücreleri ifade plazmid pET24-RTA(onun) 6 veya standart elektroporasyon protokolleri9,10kullanarak boş vektör pET24a(+) ile dönüşümü. Boş plazmid içeren hücreler bir negatif kontrol hizmet vermektedir.
- Seçimden sefaloridin içeren (100 µg/mL) LB plakalar üzerinde olumlu klonların sonra RTA ifade Plazmid ve 5 mL LBkan orta (LB orta ile sefaloridin 100 µg/mL) boş vektörde içeren hücre aşılamak ve 37 ° C ve 24 saat için 220 devir/dakika, kuluçkaya.
- 1 L LBkan orta 5 mL öncesi kültür ile ek ve hücreleri 0.8-1.0 (yaklaşık 3-4 h) OD600 gelinceye hücreleri 37 ° C ve 220 devir/dakika, kuluçkaya. Bundan sonra kültür sıcaklık 28 ° C için azaltmak ve 1 M H2O. izopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) stok çözüm hazırlamak
- RTA ifade E. coli 1 mM son bir konsantrasyon IPTG ekleyerek teşvik.
- 3.5 h 28 ° c ve 220 devir/dakika, hasat hücreleri tarafından Santrifüjü 10.000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika, sonra iki kez ile 5 mL de bağlama arabellek (500 mM NaCl, 10 mM imidazole ve 20 mM KH2PO4 Pelet yıkama pH 7.4 =) 10.000 x g ve 10 dk ve resuspend Pelet 5 mL bağlama arabelleği için 4 ° C '.
Not: Bu aşamada Protokolü duraklatılmış ve hücreleri 80 ° C'de için birkaç gün saklanabilir.
2. O'nun öğesini RTA benzeşme Kromatografi ile saflaştırılması
- Hücreleri aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak buzda solüsyon içeren temizleyicide: 15 s darbe (20 mikron), 30 s Duraklat. Bu beş kez tekrarlayın.
- Hücre lysate, 21,000 x g ve 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi ve steril enjektör filtre sistemi (0.2 µm gözenek boyutu) kullanarak süpernatant filtre.
Not: Hücre granül başarıyla sonicated örnekleri şeffaf kenarlıklarını göster. - 5 mL ile Ni2 +donatılmış bir otomatik arıtma sistemi kullanın-steril filtre E. coli süpernatant dan O'nun öğesini RTA kesir arındırmak için benzeşme sütun temel. Genel olarak, 1 mL/dk elüsyon hızını kullanın ve verimli olmayan toksin bağlayıcı ve toksin aktivite kaybı önlemek için tüm arıtma sistemi serin.
Not: Verimli RTA arıtma için parametreleri Tablo 1' de listelenmiştir. Ayrıca bkz: Becker ve ark. daha fazla bilgi9için.- Kısaca, benzeşim sütun bağlama arabellek depolama arabellek kaldırmak için 20 mL ile equilibrate. Bir Ģırınga kullanarak benzeşme sütuna süpernatant steril filtre uygulayın.
- Sütun bağlama arabellek sütundan ilişkisiz proteinler kaldırmak için 25-35 mL ile yıkayın. 280 Absorbans UV kadar çamaşır adımı gerçekleştirmeniz nm başlangıç UV değeri yakın olduğunu.
- Bağlı RTA kesir elüsyon arabellek 20-35 ml elute (500 mM imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH 7.2 =) ve örnek buz (şekil 2A ve şekil 2B) üzerinde tutun.
Not: Elüsyon RTA fraksiyonunun UV emme bir artış tarafından işaretlenir. Unutmayın ki sadece spesifik olmayan ilişkili proteinler ile kontaminasyonu önlemek için bu kesir toplamak için. - Eluted örnekleri 20 µL Coomassie mavi11 veya Western blot analizi12,13 (isteğe bağlı) Boyama gerçekleştirmek için kullanın. Birincil RTA algılamak ve örnek saflık (şekil 3) doğrulamak için anti-O'nun antikorlar (1:1, 000) ve ikincil anti-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) kullanın.
- Eluted RTA kesir 5 mL desalting sütun desalt ve 0, 8 M sorbitol örnek equilibrate.
- Arıtma sistemi benzeşme sütun desalting sütun tarafından eski yerine koymak ve ilk sütun 0, 8 M sorbitol 20 mL ile equilibrate.
- Eluted RTA kesir bir şırınga ile sütun uygulanır. Sütun 0, 8 M sorbitol 100 mL ile yıkama ve UV emme (şekil 2C) artmaya başlar başlamaz desalted RTA kesir bir 15 mL tüp elute.
- Eluted RTA kesir 4 ° C'de depolayın
Not: tuz kirlenmesini önlemek için gürültülerinden artırır doğrudan RTA kesir örnekleme durdurur. Desalting yordam parametreleri tablo 1'de listelenmiştir.
- Eluted RTA kesir 10.000 x g ve 4 ° C'de 30-180 dk 10 kDa kesme spin sütun için 1-2 mL son hacmi kullanarak için konsantre ve örnek 4 ° C'de 3-4 hafta için saklayın.
Dikkat: RTA etkinlik tam bir kaybına yol açar dondurma beri örnek dondurma değil. - Bir geleneksel protein tayini kit kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek. Protein konsantrasyonu 1-1.5 mg/mL aralığında olmalıdır.
Not: RTA protein konsantrasyonu çok yüksek ise çökelti eğilimi (> 5 mg/mL).
3. Maya dönüştürme ve hücre duvarı kaldırma
- Vahşi-türü veya seçili Maya silme mutantlar standart lityum asetat dönüştürme yöntemleri14kullanarak GFP muhabir plazmid pRS315-K28SP- GFP6 ile dönüşümü. Hücreleri lösin drop-out (d/o) üzerinde kuluçkaya olumlu klon seçim için 2-3 gün için 30 ° C'de glikoz tabak (% 2 glikoz, %1,5 agar, % 0.5 amonyum sülfat, %0,17 Maya azot Bankası (YNB) ve %0.087 d/o mix lösin olmadan).
- 3 farklı Maya klonlar her plaka almak ve 220 devir/dakika ve 30 ° C-OD600 lösin d/o raffinose orta (%2 raffinose, % 0.5 amonyum sülfat, %0,17 YNB ve %0.087 d/o lösin mix) 100 ml klonlar aşılamak 1.0-2.0 = (2-4 x 107 hücre/mL).
Not: Hücre büyümesini farklı Maya silme suşlarının farklıdır. OD600 bir Spektrofotometre ile izleyin. - OD600 değerleri hesaplamak için seyreltik örnekleri OD600 0,1-0,3 = (1:5-1:10 dilutions) ve OD600 bir Spektrofotometre ölçmek. H2O lösin d/o raffionose orta karşılık gelen tutarı ile desteklenmiş başvuru olarak kullanın.
- Bitirme adım 3.5, spheroplasted 50 mL kültürünün 4 µL 496 µL spheroplasting arabellek (yaklaşık 2 × 106 spheroplasts) ile karıştırın ve santrifüj kapasitesi 400 x g de 10 dakika sonra.
- 10 mL H2O resuspend Pelet distile, girdap örnek 30 s ve plaka 10 µL lösin d/o glikoz plakaları (% 2 glikoz, %1,5 agar, % 0.5 amonyum sülfat, %0,17 YNB ve %0.087 d/o mix lösin olmadan) örneğinin dışarı için.
- Hücreleri 30 ° C'de 3 gün kuluçkaya Yetişkin hücre kolonileri plaka üzerinde toplam sayısını saymak. Veri değerlendirme için 98 daha yüksek verimliliği ile sadece örnekleri kullanır (Toplam hücre koloni < 40 kolonileri/plaka).
4. GFP muhabir tahlil ölçüm 96-şey plakaları
- Tohum dışarı adım 3.7 96-şey tabak (200 µL/de) içine elde Maya hücre spheroplasts.
- 70 µL stabilize lösin d/o raffinose orta negatif kontrol içeren eklemek (eluate bir Ni2 +-benzeşme arıtılmış lysate hücre boş vektör ifade E. coli IPTG kaynaklı hücrelerden) veya RTA 5 µM (son RTA konsantrasyon içinde saf 160 g/M'ye RTA karşılık gelen) her şey içinde.
- Hemen GFP ifade ikna etmek ve daha sonra ölçüm başlatmak için 30 stabilize µL galaktoz çözüm (% 30 galaktoz, 0, 8 M sorbitol) ekleyin.
Not: deney başına en az 3 teknik çoğaltır gerçekleştirmek ve Maya zorlanma 3 Biyolojik çoğaltır. - Numune Hazırlama (adımları 4.1-4.3), Floresans Reader'da 96-şey plaka koymak ve ölçüm başlatmak sonra. GFP Floresans algılama için gerekli ayarla 475/509 nm filtre kullanın. Ölçümler 30 ° c, 120 rpm ve sallayarak çapı 1 mm 20 h (10 dk aralıklarla ölçüm) bir zaman penceresi üzerinde gerçekleştirin.
Not: Normalde tüm okuyucu sistemlerinde GFP filtre kümesi kullanılabilir. Sıcaklık, ölçüm aralıkları ve RTA konsantrasyon zaman penceresini kendi ihtiyaçları için ayarlanabilir. Temsilcisi sonuçları şekil 4' te gösterilmiştir. - İsteğe bağlı: kalite kontrol ölçüm ek iç denetimlerini kullanın. Bir negatif kontrol 30 µL stabilize lösin d/o raffinose orta yerine % 30 galaktoz (GFP indüksiyon) ekleyerek hazırlayın. Buna ek olarak, 70 µL 0,8 M stabilize sorbitol G418 çözüm (300 µg/mL) ekleyin. Maya ifadede GFP engeller gibi protein çeviri inhibitörü G418 protein inhibisyonu için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.
- Yüzde 20 h saat noktası göre aşağıdaki denklemi için göreli GFP Floresans hesaplamak (bkz. şekil 4A):
nerede NC negatif kontrol olduğunu
- Alternatif olarak, her ölçüm için göreli GFP Floresans belirlemek (Ayrıca bkz: adım 4.4 Bu durumda 10 min) Yukarıdaki denklem kullanarak. Şekil 4B' de gösterildiği GFP Floresans yoğunluklarda (y ekseni) Zaman içinde (x ekseni) kurutma tarafından bir grafik oluşturun.
nerede NC negatif kontrol olduğunu
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kabaca başarılı RTA ve sonraki GFP muhabir tahlil deney için tek adımları özetleyen Resim 1, bu el yazması açıklanan Protokolü'nün genel iş akışı gösterilmektedir. Tek tek her adım daha ayrıntılı bir açıklamasını iletişim kuralında bulunabilir. Şekil 2 bir başarılı RTA arıtma beklenen sonucu benzeşme Kromatografi (şekil 2A) ve boş vektör kontrolü (şekil 2B) tarafından gösterilmiştir. Şekil 2C protein tepe (mavi) ve tuz eluted tepe (kahverengi) ideal ayrılması gösteren bir desalting denemenin temsilcisi sonucu gösterir. Etkili bir RTA arıtma şekil 3bir Coomassie lekeli SDS-jel şeklinde sunulmaktadır. Son olarak, şekil 4 bu basit ve sağlam GFP tabanlı muhabir tahlil yöntemi6tarafından elde edilen bazı orijinal sonuçlarını özetler. Şekil 4A kurulan GFP muhabir tahlil güvenilir sonuçlar üretmek yapabiliyor ve şematik bu çalışmada kullanılan GFP muhabir plazmid tasvir gösterilmiştir. Grafikte, Maya spheroplasts RTA tedavi ve tedavi olmayan koşullar altında göreli GFP Floresans birbirleri ile karşılaştırılır. Beklendiği gibi hemen hemen hiçbir GFP Floresans sigara kaynaklı hem de G418 tedavi olan hücreleri gösterir. Tedavi sigara ve negatif denetimi değerlendirilmesi (boş vektör) hücrelerdeki GFP ifade etkilenmez ve her iki örnekleri arasında önemli farklılıklar değil gözlendi. Buna ek olarak, RTA tedavi etkinliği inhibe onun ribozom tarafından aracılı beklenen GFP Floresans azaltma yol açar. Şekil 4B', RTA kaynaklı GFP Floresans inhibisyon bir zaman eğrisi görüntülenir. Bu tür veri sunumunu GFP ifade (galaktoz indüksiyon sonra 90 dk) ve RTA (210 dakika sonra vahşi-türü hücre uygulamada) tarafından translasyonel inhibisyon başlangıç noktası zamanlama hakkında ek bilgiler içerir. RTA-aracılı Floresans azalma en olası gecikme alımını kinetik ve RTA hücre içi taşıma sitozol için yansıtır. Şekil 4 c seçili Maya mutantlar 20 h RTA tedavi sonra elde edilen ve RTA-tedaviye kıyasla ve RTA tedavi vahşi tipi hücrelere kıyasla göreceli GFP Floresans göstermektedir. Daha önceki çalışmalar zaten her iki proteinler RTA ER sitozol retrotranslocation Maya1katılmaktadırlar gösterdi çünkü uygun pozitif kontrolü olarak ERAD bileşenleri Hrd1p ve Der1p seçilmiştir. Bu nedenle, her iki mutantlar vahşi tipi hücrelere kıyasla GFP Floresans içinde beklenen artış gösteriyor. Buna ek olarak, göreli GFP Floresans değerler Δyos9 ve Δnup120 hücreleri önemli ölçüde farklı değildir. O zaten ne ER kalite kontrol lektin Yos9p eksikliği ne de bir eksikliği nükleer gözenek protein Nup20p RTA toksisite ve taşıma1etkiler tanımlanmıştır. Belirli benzeşme Kromatografi ve desalting parametrelerinin listesini Tablo 1' de bulunabilir.
Şekil 1: genel iş akışını RTA arıtma ve muhabir GFP tabanlı tahlil ve. RTA arıtma (solda) E. coli dönüşümü ifade veya boş vektör ardından yetiştirme ve IPTG bağlı RTA ifade ile başlar. Sonra hücre lizis ve steril filtrasyonu, süpernatant Ni2 + benzeşme Kromatografi ile saflaştırılmış ve örnek saflık Coomassie boyama veya Western blot ile doğrulanır. Önce eluted RTA kesirler GFP muhabir tahlil deneyde kullanmaya hazırsınız, kesirler desalted konsantre ve olması gereken ve protein konsantrasyonu belirlenmelidir. GFP muhabir tahlil deney (sağda) vahşi-türü ve/veya seçili Maya silme mutantlar GFP ifade yapısı ile dönüşüm başlar. Ekimi sonra hücre duvarı RTA vivo içinde alımını sağlamak için enzimatik tedavi tarafından kaldırılır. Sonra GFP Floresans Maya hücre spheroplasts, zaman içinde bir floresan okuyucu toksin tedavi ve tedavi olmayan koşullar altında ölçülür (475/509 nm). Son olarak, göreli GFP Floresans 4,6 adımda gösterilen Denklem kullanılarak belirlenir ve şekil 4' te gösterildiği gibi görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Temsilcisi benzeşme Kromatografi ve evde beslenen hayvan-RTA(onun) 6 ve boş vektör kontrol içeren E. coli hücre sonuçlarını desalting. (A)tipik arıtma grafiği bir E. coli hücre lysate örnek RTA vektör pET24-RTA(onun) 6(onun) 6 ifade. Mavi eğrisi temsil eden UV emme 280 nm aromatik Yüzüklerin Trp, Tyr ve Cys amino asitler tarafından neden olduğu ve protein göstergesi olarak hizmet vermektedir. Sütun yüklerken ilişkisiz proteinler akışı aracılığıyla içinde (0-10 mL) tespit edilir. İlişkisiz protein bağlayıcı arabelleğe ile yıkayarak kaldırma sonra elüsyon arabellek konsantrasyon 0 ile %100 (kırmızı eğri) artar ve ilişkili proteinler hemen sütundan eluted. 25 ve 30 mL arasında mavi eğrisi zirvesine bağlı RTA (kara kutu) O'nun öğesini kısmını temsil eder. (B) tipik arıtma grafiği bir E. coli lysate hücrelerden boş vektör kontrolü ifade. (A) olduğu gibi aynı arıtma iletişim kuralı. Siyah kutusunda gösterildiği gibi negatif kontrol sütunundaki hiçbir protein eluted. (C) bir E. coli pET24-RTA(onun) 6 örnek benzeşme arıtma sonra Desalting diyagramı. Diyagram RTA protein Fraksiyonu (20-30 mL arasında 280 nm Absorpsiyon zirvesine) ayrılması gösterir ve tuz kesir (artan gürültülerinden en yüksek, sonra 30 mL).Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temsilcisi Western analiz farklı örnekleri önce ve sonra benzeşme arıtma. 20 µL hücre lysate (şerit 2-4) veya SDS-sayfa ve Coomassie mavi boyama tarafından analiz arıtılmış örnek (şerit 5-7) farklı RTA türevleri (sadece değiştirilmemiş RTA bu çalışmada kullanılmıştır). 1 yolu, protein merdiven; Lane 2, değiştirilmemiş RTA; Lane 3, RTAHDEL; Lane 4, RTAKDEL; Lane 5, değiştirilmemiş RTA; Lane 6, RTAHDEL; Lane 7, RTAKDEL. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: temsilcisi sonuçlar elde tarafından muhabir tahlil vahşi-türü ve seçili Maya RTA tedavi silme mutantlar için. (A) göreli GFP Floresans vahşi-türü muhabir plazmid pRS315-K28SPiçeren Maya spheroplasts - GFP (sağda) altında (% 3 galaktoz, GFPind.) indüklenen ve sigara kaynaklı (%2 raffinose, GFPrepr.) 20 h GFP sonra koşullar indüksiyon. Göreli GFP Floresans da RTA huzurunda analiz (5 mikron), G418 (300 µg/mL) veya negatif kontrol (NC). Protein çeviri inhibitörü G418 pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir ve Maya ifadede GFP engeller. Ortalama değer ve standart sapma (SD) gösterilir. (A)(B) göreli GFP Floresans zaman ders 20 h üzerinden görüntülenir. Bu diyagram GFP ifade ve çeviri inhibisyon RTA tarafından zamanlama hakkında ek bilgi sağlar; eğri davranışı dolaylı olarak Kinetik RTA alımı ve hücre içi ulaşım sitozol için yansıtır. (C) temsilci seçilen Maya mutantlar arızalı ya da değil (Hrd1p ve Der1p) olarak bilinen hücresel proteinler sonucu (Yos9p ve Nup120p) Maya1,6' ticareti RTA dahil. Noktalı çizgi pozitif kontrol suşları tarafından elde edilen floresan emisyon temel öneme sahip bir eşik temsil eder (açıklama için bkz: başvuru6). Ortalama değer ve standart sapma (SD) gösterilir. Rakam Becker ve ark. güncellenmiştir 6 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Benzeşme chromotography parametresi | ||
| Ölçüm parametreleri | UV (280 nm), elüsyon arabellek konsantrasyon, kondüktansı | |
| Ayarlar | Değişken/adet | Değer |
| Akış hızı | mL/dk | 1 |
| En fazla sütun basınç | MPa | 0,35 |
| Dalga boyu | NM | 280 nm |
| Bağlama arabellek | Pozisyon pompa | A |
| Elüsyon arabellek | Pozisyon pompa | B |
| Başlangıç konsantrasyonu elüsyon arabellek | % | 0 |
| Sistem birimi tazminat | mL | 10 |
| Sütun denge | mL | 20 |
| Superloop/şırınga üzerinde örnek enjeksiyon | mL | hücre lysate birim |
| Adım yıkama | mL | 20-35 |
| Elüsyon adım | mL | 20-35 |
| Konsantrasyon elüsyon arabellek elüsyon sırasında | % | 100 |
| Ayarlamayı sütun % 20 ile alkol | mL | 50 |
| Desalting parametresi | ||
| Ölçüm parametreleri | UV (280 nm), kondüktansı | |
| Ayarlar | Değişken/adet | Değer |
| Akış hızı | mL/dk | 4 |
| En fazla sütun basınç | MPa | 0,35 |
| Dalga boyu | NM | 280 nm |
| Bağlama arabellek | Pozisyon pompa | A |
| Elüsyon arabellek | Pozisyon pompa | B |
| Başlangıç konsantrasyonu elüsyon arabellek | % | 0 |
| Sistem birimi tazminat | mL | 10 |
| Sütun denge | mL | 20 |
| Superloop/şırınga üzerinde örnek enjeksiyon | mL | hücre lysate birim |
| Arabellek enjeksiyon (0,8 M sorbitol) desalting | mL | 100 |
| Ayarlamayı sütun % 20 ile alkol | mL | 50 |
Tablo 1: sütun temel benzeşme arıtma ve desalting için kullanılan parametreler. Tüm ilgili sütun ayarları (örneğin, akış hızı, elüsyon arabellek konsantrasyon, denge ve çamaşır adım süresi) ve (örneğin, gürültülerinden veya UV emme) ölçülen parametreler listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıdaki Protokolü gerçekleştirirken, biz deneme başarılı bir sonuç elde etmek için aşağıdaki önerileri öneririz.
Kapaklı protein ifade için 1 mM IPTG konsantrasyonu aşmayacak şekilde önemlidir. IPTG konsantrasyonları > 1 mM inhibe organizatörü kaynaklı RTA ifade ve toksin verimleri düşürmek için kurşun. Ayrıca, hücreleri 28 ° C eklenmesi vücut oluşumu, verimsiz katlama ve toksin inactivation önlemek için daha yüksek sıcaklıklarda ekili olmamalıdır. RTA ifade (örneğin, 20-28 ° C) daha düşük sıcaklıkta mümkündür ve aynı zamanda biyolojik aktif toksin üretim için açar. Ancak, ek sıcaklık azaltma önemli ölçüde RTA etkinlik/katlama iyileştirmez ve 28 ° C (veri gösterilmez) ile karşılaştırıldığında daha düşük bir toplam toksin verim sonuçları.
Benzeşme Kromatografi (Tablo 1) arıtma parametreleri en iyi duruma getirilmiş bir otomatik arıtma sistemi kullanımı 5 mL Ni2 + benzeşme sütun ile donatılmış ve diğer ev yapımı veya ticari sütun sistemlerine Eğer ayarlanması gereken RTA saflık ve verim alt-optimal. (Coomassie-lekeli SDS-jelleri ek proteinler görünümünü gösterilir) alt-optimal RTA saflık durumunda bağlama arabellek imidazole konsantrasyon artış normalde belirsiz bağlama için pozitif yüklü proteinlerin azaltır sütun, böylece genel RTA saflık artan. Alt-optimal RTA verimleri, ek sonification algılama adımları (4-8 bakliyat), uzun kuluçka kez (5 h) veya daha büyük kültür birimleri getirilmesi durumunda (> 1 L) genel toksin verimi artırmak için yardımcı olabilir. Ancak, aynı zamanda başarılı bir şekilde RTA spin sütun tabanlı sistem (veri gösterilmez) yolu ile arındırmak için fırsat olduğunu otomatik bir sistem laboratuarda kullanılabilir değilse.
Desalting adımı sırasında gürültülerinden yükselmeye başladığı anda örnekleme yordamı atlayın önemlidir. Tuz, özellikle imidazole, ile kirlenme GFP muhabir assay olarak kullanılan RTA içeriği doğrudan etkileyen yanlış RTA konsantrasyonu tayini çıkan protein konsantrasyonu ölçümü etkiler.
4 ° C'de arıtılmış RTA depolamak ve donma önlemek için önemlidir. Donmuş numuneler RTA azaltılmış bir etkinlik XTT tabanlı hücreye canlılık deneyleri HeLa hücreleri (veri gösterilmez) göster. Arıtılmış örnekleri için biyolojik faaliyetlerini sürekli olarak azalmış önce hafta 3-4 civarında tutulabilir. Buna ek olarak, RTA 0,8 M sorbitol çökelti eğilimi gösterir, çünkü yüksek RTA konsantrasyonları (≥5 mg/mL) sonra spin sütun konsantrasyonu kritik öneme sahiptir.
Yöntemin bir dezavantajı RTA sağlam Maya hücreleri tarafından kullanılan normal değil gerçektir. Güvenilir sonuçlar elde etmek için Maya hücre duvarı enzimatik tedavi ile tamamen kaldırılması gerekiyor. Bu nedenle, 3,4-3.5 adımlarda açıklanan yöntemler tarafından spheroplast oluşumu verimliliği her Maya baskı kontrol etmek için esastır. Alt-optimal spheroplast hazırlık durumunda litik enzim konsantrasyon ve kuluçka zamanı olmalı en iyi duruma getirilmiş ve faz kontrast mikroskobu ile izlenir. Overdigestion (hayalet oluşumu) ise ters yaklaşım yetersiz sindirim durumunda gerekli litik enzim konsantrasyon ve/veya KULUÇKA zamanı azaltarak önlenebilir. Suşları ile yetersiz hücre duvarı kaldırma verileri veri değerlendirme dışlanmaları gerekir.
Ayrıca deneysel kurulum tamamen "Risin" doğal zehirlenme süreci taklit değil belirtilmelidir. Hücre bağlama B alt birim "Risin" (ÜSSE), normalde hücre yüzeyinde memeli hücreleri15galaktoz artıkları için verimli toksin bağlama için sorumlu olduğu eksik. Teorik olarak, bu sınırlama ile arıtılmış "Risin" holotoxin onun A ve B alt birimi içeren deney yaparak üstesinden gelebilir. Yine de, Maya hücreleri galaktoz artıkları bağlayıcı ÜSSE8aracılık onların hücre yüzeyinde sahip olmayan; Bu gerçeği de neden olduğu gibi Maya hücreleri "Risin" karşı duyarlı değildir açıklar. Böylece, o ÜSSE hücre bağlama bileşeni Maya modeli olarak hareket edeceğini eğer belli değildir. İlginçtir, eski çalışmalar zaten RTA hücresini B alt birim16bağlama memeli hücrelerinin sitozol ulaşmak mümkün olduğunu gösterdi. Bu fenomen anlamak için biz Maya toksin plazma zarı sitozol ticareti kolaylaştırmak hücresel bileşenleri tanımlamak için deneysel kurulumunda sadece RTA kullanmaya karar verdi. Doğal olarak, RTA Maya kaçakçılığı dahil bileşenleri verimli "Risin" holotoxin taşıma memeli hücreleri6' için gerekli bileşenleri için çarpıcı benzerlikler gösterir. Bu sonuçlara göre bu ÜSSE daha önce sözde daha hücre içi "Risin" Ulaştırma küçük bir rol oynar ve yalnızca ilgili ilk kişi memeli hücre yüzey için önemlidir spekülasyonlar.
Buna ek olarak, siRNA tabanlı sistemlerde memeli hücreleri mükemmel doğal toksin durumu yansıtacak ama zaman alıcı ve pahalı3vardır. Ayrıca, Maya silme mutantlar kullanımı önemli avantajı bu ayılar siRNA tabanlı sistemler genellikle protein seviyesini azaltma için yol ise mutantlar tam bir knock-out protein ilgi göster. Bazı durumlarda, rezidüel protein düzeyleri mademki yok değişmiş fenotip görülmektedir ve böylece belirli protein katılımı siRNA tabanlı sistemlerde görünür değildir toksin taşıma için yeterli olabilir.
Her ne kadar orijinal sadece gerekli olmayan Maya silme suşları kullanılmıştır6, sıcaklığa duyarlı suşları gibi azalmış bereket mRNA pertürbasyon (nem) koleksiyonu suşları17 tarafından (azaltılmış ifade düzeyi temel eğitim proteinler) aynı şekilde gelecekte böyle bir yöntem için uygundur. Genel olarak, gerekli proteinlerin rolü olamaz bu tahlil ile canlılık onların eksikliği nedeniyle araştırdık, bu nedenle bir sınırlama tahlil sisteminin temsil eder.
Ancak, yeni muhabir tahlil hangi model organizma S. cerevisiaeRTA Ulaştırma analiz etmek için denemek mevcut yöntemler bir zarif ve alternatif strateji temsil eder. Mevcut çalışmalar ve hücre içi plazmid-RTA ifade sistemleri kullanılan retro-translocation analiz için ER sitozol1,7olarak kısıtlanır. Şimdi hücre dışı RTA uygulamasının başarılı uygulama olasılığı sadece ER retrotranslocation çalışmaya aynı zamanda dolaylı olarak RTA taşıma Başbakanın gelen olsa da acil servise Golgi analiz etmek için açılır.Hücresel fonksiyon ve yerelleştirme Maya çoğunluğunun genler günümüzde keşfetti ve veritabanlarında kullanılabilir, belirlenen aday proteinler doğrudan belirli bölümler için tahsis edilecek ve/veya taşıma yolları.
Genel olarak, tanıtılan muhabir tahlil yöntemi aday proteinler toksinler veya toksin altbirimden (örneğin, RTA) protein çeviri vivo içindeengellemek hücre içi kaçakçılığı dahil tanımlamak için kolay ve güçlü bir yaklaşım temsil eder. Nispeten düşük standart sapmalar (1-%10) yanı sıra yüksek veri tekrarlanabilirlik orijinal çalışmada onaylar bu ifadeler. 96-şey plaka biçimi nedeniyle hızlı bir tarama çeşitli Maya mutant toksin arıtma sonra bir gün içinde mümkündür.
Gelecekte, Maya silme kütüphanelerin yüksek üretilen iş tarama yöntemi kullanma imkanı vardır. Geçerli kurulum, uygulamalı RTA konsantrasyonu (5 mikron) göreli GFP Floresans % 50 azaltmak yapabiliyor. Bu koşullar altında yöntem ile negatif (artan GFP floresan) ve pozitif (azaltılmış GFP floresan) etkileri RTA ulaşım hizmeti silme mutantlar belirlemek için avantajı sunuyor. Yüksek işlem hacmi gösterimleri için tedavi ve tedavi örnekleri arasında daha güçlü bir fark bazen faydalıdır. Daha yüksek RTA konsantrasyonları kullanarak ve/veya ölçü aralığı (örneğin, 48 h) artan tarafından GFP ifade daha da belirgin bir bloğunu ulaşılabilir olmalıdır.
Bu yöntem sadece Maya hücre dışı uygulanan RTA zehirlenme süreci analiz etmek için sınırlı değildir, ama aynı zamanda bu GFP muhabir zorlanma bir plazmid aracılığıyla RTA ifade ederek RTA ER Mümessillik analiz etmek için fırsat olduğunu vurguladı olduğunu (veri değil gösterilen). Ayrıca, tarama yaklaşım aynı şekilde proteinler zymocin18 gibi gelecekte inhibe diğer protein sentezi hücre içi taşıma yolları çalışmaya adapte edilebilir. İyi karakterize öldürme zymocin aksine, nispeten küçük sitozol19,20verimli toksin taşıma için sorumlu ticaret yolları hakkında bilinir. Böylece, zymocin doğal Maya hücreleri tarafından kapladığı gibi zymocin gelecek çalışmalar için en uygun bir aday temsil eder. Böylece, hücre duvarı kaldırılması GFP muhabir tahlil (zaman ve maliyet) ile ilgili genel performansını artırır atlanabilir. Bu güçlü muhabir tahlil yardımıyla, zymocin Maya hücre içi taşıma route(s) incelemek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada parçalar (SFB 1027, A6) Deutsche Forschungsgemeinschaft hibe tarafından desteklenen nazik vardı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
