Summary
पांडुलिपि में, हम एक खमीर के उपयोग का वर्णन आधारित प्रतिदीप्ति रिपोर्टर परख के लिए सेलुलर और साइटोटोक्सिक संयंत्र विष ricin (आरटीए) के एक उपइकाई की हत्या की प्रक्रिया में शामिल घटकों की पहचान ।
Abstract
बैक्टीरियल और संयंत्र एक/बी विषाक्त पदार्थों युकेरियोटिक कोशिकाओं में प्राकृतिक तस्करी रास्ते का दोहन करने के लिए cytosol में अपने intracellular लक्ष्य (ओं) तक पहुंचने और अंततः को मारने के लिए । इस तरह के एक/बी विषाक्त पदार्थों को आम तौर पर एक enzymatically सक्रिय Asubunit से मिलकर बनताहै (जैसे, ricin विष एक (आरटीए)) और एक या एक से अधिक सेल बाध्यकारी Bsubunit (ओं) है, जो विशिष्ट कोशिका की सतह रिसेप्टर्स के लिए बाध्यकारी विष के लिए जिंमेदार हैं । कैसे एक/बी विषाक्त पदार्थों को कुशलतापूर्वक नशीला कोशिकाओं में सक्षम है की हमारी वर्तमान ज्ञान वैज्ञानिकों मौलिक सेलुलर तंत्र को समझने में मदद की, endocytosis और intracellular उच्च युकेरियोटिक कोशिकाओं में छंटाई प्रोटीन की तरह । देखने के एक चिकित्सा बिंदु से, यह इसी तरह के प्रमुख विष तस्करी मार्गों की पहचान करने के लिए रोगियों के लिए पर्याप्त उपचार समाधान खोजने के लिए या अंततः चिकित्सकीय विष विकसित कैंसर थेरेपी के लिए आवेदन आधारित महत्वपूर्ण है ।
के बाद से एक/बी विष स्तनधारी कोशिकाओं में तस्करी के जीनोम चौड़ा विश्लेषण जटिल है, समय लेने वाली, और महंगी, एक/बी विष परिवहन पर कई अध्ययनों खमीर मॉडल जीव Saccharomyces cerevisiaeमें प्रदर्शन किया गया है । कम जटिल होने के बावजूद, मौलिक खमीर और उच्च युकेरियोटिक कोशिकाओं में सेलुलर प्रक्रियाओं समान है और बहुत बार खमीर में प्राप्त परिणाम स्तनधारी स्थिति को हस्तांतरित किया जा सकता है ।
यहां, हम वर्णन एक तेजी से और रिपोर्टर परख का उपयोग करने के लिए खमीर में आरटीए के intracellular तस्करी का विश्लेषण । नए परख का एक आवश्यक लाभ के लिए न केवल आरटीए रेट्रो translocation endoplasmic जालिका से cytosol में (एर) की जांच करने का अवसर है, बल्कि endocytosis और प्लाज्मा झिल्ली से एर में पतित विष परिवहन । परख एक रिपोर्टर प्लाज्मिड कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के माध्यम से आरटीए विषाक्तता के अप्रत्यक्ष माप की अनुमति देता है का उपयोग करें (GFP) vivo अनुवाद में के बाद । चूंकि आरटीए कुशलतापूर्वक 28S rRNA depurination द्वारा प्रोटीन के संश्लेषण की दीक्षा को रोकता है, इस परख प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में परिवर्तन का पता लगाने के माध्यम से intracellular आरटीए परिवहन में शामिल मेजबान सेल प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता है ।
Introduction
विष उत्पादन बैक्टीरिया से संक्रमण से पीड़ित रोगियों को एक सामाजिक स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली के लिए एक गंभीर चिकित्सा और वित्तीय बोझ का प्रतिनिधित्व करते हैं, विशेष रूप से कुशल चिकित्सीय उपचार के बाद से अभी भी काफी हद तक लापता हैं । नई चिकित्सीय रणनीतियों, चिकित्सा प्रासंगिक एक/बी विषाक्त पदार्थों जैसे हैजा विष, शिगा विष, या ricin के जटिल नशा तंत्र विकसित करने के लिए पूरी तरह से आणविक उपंयास शक्तिशाली परख है कि लागू किया जाना है के आधार पर स्तर पर समझने की जरूरत है ।
हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों से खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में समय लेने वाली और लागत जैसे रेडियोधर्मी विष लेबलिंग1,2 के रूप में अच्छी तरह के रूप में सिरना आधारित स्क्रीनिंग का उपयोग करके एक/ 3दृष्टिकोण । कुछ मामलों में, विष तस्करी विवो में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा रासायनिक और के बाद fluorophores, क्वांटम डॉट्स, या फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ व्यक्तिगत विष उपइकाई के आनुवंशिक युग्मन4,5visualized किया गया है । दुर्भाग्य से, इस तरह के संशोधनों अक्सर विषाक्त पदार्थों के निष्क्रिय और/ परोक्ष रूप से वैज्ञानिक प्रश्नों की एक विस्तृत विविधता का जवाब देने के लिए एक और सुरुचिपूर्ण तरीका रिपोर्टर जैसे lacZ, luciferase, या फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे GFP या Discosoma सपाएंजाइमों पर आधारित प्रणालियों का उपयोग है । लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन ( dsRed)) ।
इस पांडुलिपि में, एक सरल प्रोटोकॉल वर्णित है जो सेलुलर घटकों की पहचान करता है intracellular परिवहन के लिए आवश्यक extracellularly लागू आरटीए में S. cerevisiae। जिससे, एक प्रतिदीप्ति-रिपोर्टर प्लाज्मिड एक एन-टर्मिनल ईआर-आयात संकेत युक्त एक प्रोटीन के रूप में GFP कृत्यों द्वारा पीछा किया जाता है, जो परोक्ष रूप से आरटीए में GFP प्रतिदीप्ति उत्सर्जन द्वारा मध्यस्थता प्रोटीन अनुवाद निषेध का उपाय है vivo में अनुवाद6. मामले में है कि आरटीए endocytosis और/या intracellular तस्करी नकारात्मक है (या सकारात्मक) एक विशेष खमीर विलोपन उत्परिवर्ती में जंगली प्रकार की तुलना में प्रभावित है, यह एक वृद्धि (या GFP प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में कमी) के माध्यम से पता लगाया जा सकता है6।
अब तक खमीर कोशिकाओं में आरटीए परिवहन का विश्लेषण करने वाले सभी तरीके आरटीए की ईआर-टू-cytosol रेट्रो-translocation प्रक्रिया तक ही सीमित थे । इस तरह के एक कृत्रिम प्रणाली में, एक ईआर आयात संकेत युक्त आरटीए एक आत्मघाती phenotype1,7में जिसके परिणामस्वरूप एक inducible प्रमोटर से व्यक्त किया जाता है । हालांकि सेल बाध्यकारी बी-ricin के उप इकाई इसी तरह प्रयोगात्मक सेटअप में लापता है इस पांडुलिपि में वर्णित है और, इस प्रकार, पूरी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं करता है ricin holotoxin नशे की प्राकृतिक स्थिति8, प्लाज्मा से विष परिवहन एर के लिए Golgi तंत्र के माध्यम से झिल्ली बारीकी से इस उपंयास परख के साथ नकल उतारा जा सकता है । दिलचस्प है, प्रारंभिक पायलट अध्ययन में प्राप्त परिणामों से संकेत मिलता है कि आरटीए द्वारा इस्तेमाल की तस्करी रास्ते ricin holotoxin के नशा मार्ग के साथ हड़ताली समानताएं प्रकट करते हैं ।
संक्षेप में वर्णित विधि में आरटीए endocytosis में चयनित सेलुलर प्रोटीन की विशिष्ट भूमिका और खमीर में तस्करी का निर्धारण किया जा सकता है । इसके अलावा, इस प्रायोगिक सेटअप आसानी से उत्पादित विषाक्त पदार्थों को निष्क्रिय और विभिंन खमीर और बैक्टीरियल प्रजातियों जैसे zymocin या शिगा विष से स्रावित अंय ribosome के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
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Protocol
नोट: सामान्य प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह का ओवरव्यू चित्र 1में दिखाया गया है ।
सावधानी: आरटीए मनुष्यों के लिए अत्यधिक विषाक्त है । सुरक्षा प्रयोगशाला अनुमति S2 (सुरक्षा स्तर 2 समकक्ष) की जरूरत है । कृपया पूरे प्रयोग के दौरान दस्ताने पहनें ।
1. Heterologous अभिव्यक्ति के अपने-टैग आरटीए में ई कोलाई
- ई. कोलाई कोशिकाओं को अभिव्यक्ति के साथ रूपांतरितकरेंप्लाज्मिड pET24-आरटीए(उसक) 6 या खाली वेक्टर pET24a(+) का उपयोग मानक electroporation चलत9,10। रिक्त प्लाज्मिड वाले कक्ष ऋणात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करते हैं ।
- कनमीसिन-युक्त पर सकारात्मक क्लोनों के चयन के बाद (१०० µ जी/लगाना कोशिकाओं से युक्त आरटीए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड या खाली सदिश में 5 मिलीलीटर पौंडकान मध्यम (१०० µ जी के साथ पौंड मध्यम) और ३७ डिग्री सेल्सियस और २२० rpm पर मशीन के लिए 24 ज ।
- 5 मिलीलीटर पूर्व संस्कृति और ३७ डिग्री सेल्सियस और २२० rpm पर गर्मी कोशिकाओं के साथ 1 एल पौंडकान मध्यम पूरक जब तक कोशिकाओं 0.8-1.0 के एक आयुध डिपो६०० (लगभग 3-4 ज) तक पहुंच चुके हैं । इसके बाद, 28 डिग्री सेल्सियस के लिए संस्कृति के तापमान को कम करने और isopropyl के 1 मीटर तैयार-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) शेयर समाधान में एच2O.
- 1 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए IPTG जोड़कर ई. कोलाई की आरटीए अभिव्यक्ति प्रेरित ।
- 28 ° c और २२० rpm पर ३.५ एच के बाद, 10 मिनट के लिए १०,००० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक द्वारा फसल कोशिकाओं, दो बार गोली धो बाध्यकारी बफर के 5 मिलीलीटर (५०० mm NaCl, 10 mm imidazole, और 20 मिमी KH2PO4 , पीएच = ७.४) पर १०,००० x g और 4 ° c 10 मिनट के लिए, और 5 मिलीलीटर बाध्यकारी बफर में गोली reसस्पेंड ।
नोट: प्रोटोकॉल इस स्तर पर रोका जा सकता है और कोशिकाओं को ८० डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
2. अपने-tagged आरटीए के माध्यम से अपनत्व क्रोमैटोग्राफी का शुद्धिकरण
- निंनलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर बर्फ पर Sonicate कोशिकाओं: 15 एस पल्स (20 माइक्रोन), 30 एस ठहराव । इस चरण को पांच बार दोहराएं ।
- २१,००० x g पर सेल lysate और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और फिल्टर supernatant एक बाँझ सिरिंज फिल्टर सिस्टम (०.२ µm ताकना आकार) का उपयोग कर ।
नोट: सफलतापूर्वक sonicated नमूने के कक्ष छर्रों पारदर्शी बॉर्डर्स दिखाएँ । - एक स्वचालित शुद्धि 5 एमएल नी2 +आधारित समानता कॉलम के साथ सुसज्जित प्रणाली का प्रयोग करें अपने को शुद्ध-टैग से बाँझ से आरटीए अंश-फ़िल्टर ई. कोलाई supernatant । सामांय में, 1 मिलीलीटर की एक रेफरेंस स्पीड का उपयोग करें/और पूरे शोधन प्रणाली शांत करने के लिए गैर कुशल विष बाध्यकारी और विष गतिविधि के नुकसान को रोकने के ।
नोट: कुशल आरटीए शुद्धिकरण के लिए पैरामीटर्स तालिका 1में सूचीबद्ध हैं । बेकर एट अलभी देखें । अधिक जानकारी के लिए9.- संक्षेप में, equilibrate संग्रह बफ़र को निकालने के लिए बाइंडिंग बफ़र के 20 मिलीलीटर के साथ समानता स्तंभ । लागू बाँझ-समानता कॉलम पर फ़िल्टर्ड supernatant एक सिरिंज का उपयोग कर ।
- स्तंभ से अनबाउंड प्रोटीन को निकालने के लिए बाइंडिंग बफ़र के 25-35 मिलीलीटर के साथ कॉलम को धो लें । २८० एनएम पर यूवी अवशोषक प्रारंभिक यूवी मूल्य के करीब है जब तक धुलाई कदम प्रदर्शन ।
- 20-35 एमएल के रेफरेंस बफर (५०० एमएम imidazole, ५०० एमएम NaCl, 20 एमएम KH2पीओ4, पीएच = ७.२) में Elute बाउंड आरटीए अंश और बर्फ पर नमूना (फिगर 2a और फिगर 2 बी) रखें ।
नोट: आरटीए अंश का रेफरेंस यूवी अवशोषण में वृद्धि के द्वारा चिह्नित किया गया है । विशेष रूप से विशिष्ट बाध्य प्रोटीन के साथ संक्रमण को रोकने के लिए इस अंश इकट्ठा करने के लिए कृपया ध्यान दें । - eluted नमूनों की 20 µ एल का उपयोग करने के लिए Coomassie नीले दाग11 या पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण12,13 (वैकल्पिक) प्रदर्शन । उपयोग प्राथमिक विरोधी अपने एंटीबॉडी (1:1000) और माध्यमिक विरोधी माउस-आईजीजी-एचआरपी (1:10000) आरटीए का पता लगाने और नमूना शुद्धता की पुष्टि करने के लिए (चित्र 3) ।
- ०.८ मीटर सोर्बिटोल में एक 5 एमएल के साल्टिंग कॉलम और equilibrate सैंपल पर नमक eluted ्त अंश ।
- शुद्धिकरण प्रणाली के संबधी कॉलम को साल्टिंग कॉलम से बदलें और सबसे पहले ०.८ मीटर सोर्बिटोल के 20 मिलीलीटर के साथ कॉलम को equilibrate ।
- एक सिरिंज के माध्यम से कॉलम में eluted आरटीए अंश लागू करें । कॉलम को धोकर ०.८ मीटर सोर्बिटोल की १०० एमएल के साथ elute और 15 एमएल की ट्यूब में मिलाकर नमकीन आरटीए अंश जैसे ही यूवी अवशोषण (figure 2c) को बढाना शुरू करें).
- 4 ° c पर eluted ्त अंश को संग्रहित कर ᱶ ।
नोट: नमक संदूषण से बचने के लिए जब कंडक्टर बढ़ता है तो सीधे आरटीए अंश नमूने को रोकें । प्रतिमान की प्रक्रिया के लिए तालिका 1 में सूचीबद्ध होते हैं ।
- १०,००० x g और 4 ° c पर eluted ्त अंश को 30-180 मिनट के लिए एक 10 केडीए कट-ऑफ स्पिन कॉलम का प्रयोग कर 1-2 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 सप्ताह के लिए स्टोर के नमूने पर ध्यान दें ।
चेतावनी: के बाद से फ्रीज नहीं नमूना रोक नहीं है आरटीए गतिविधि का पूरा नुकसान होता है । - एक पारंपरिक प्रोटीन निर्धारण किट का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण । प्रोटीन एकाग्रता 1-1.5 मिलीग्राम/एमएल की सीमा में होना चाहिए ।
नोट: आरटीए अगर प्रोटीन एकाग्रता बहुत अधिक है हाला करने के लिए कर रहे हैं (& #62; 5 मिलीग्राम/एमएल) ।
3. खमीर परिवर्तन और सेल दीवार हटाने
- GFP रिपोर्टर प्लाज्मिड pRS315-K28सपा-GFP6 मानक लिथियम एसीटेट परिवर्तन तरीकों14का उपयोग कर के साथ जंगली प्रकार या चयनित खमीर विलोपन म्यूटेंट बदलना । leucine ड्रॉप-आउट (d/o) ग्लूकोज प्लेटों (2% ग्लूकोज, १.५% आगर, ०.५% अमोनियम सल्फेट, ०.१७% खमीर नाइट्रोजन बेस (YNB), और ०.०८७% डी/ओ मिश्रण पर leucine बिना) के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन सकारात्मक क्लोन चयन के लिए 2-3 दिनों के लिए ।
- प्रत्येक थाली से 3 अलग खमीर क्लोन उठाओ और leucine डी के १०० मिलीलीटर में क्लोन लगाना/o raffinose मध्यम (2% raffinose, ०.५% अमोनियम सल्फेट, ०.१७% YNB, और ०.०८७% डी/ओ मिश्रण के बिना leucine) पर २२० rpm और 30 ° से आयुध डिपो६०० = 1.0-2.0 (2-4 x 107 कोशिकाओं/
नोट: अलग खमीर विलोपन उपभेदों के सेल विकास अलग है । एक spectrophotometer के माध्यम से मॉनिटर आयुध डिपो६०० । - आयुध डिपो६०० मूल्यों की गणना करने के लिए, आयुध डिपो६०० = 0.1-0.3 (1:5 करने के लिए 1:10 कमजोर पड़ने) और माप ओडी६०० में एक spectrophotometer के नमूनों को पतला । संदर्भ के रूप में, leucine d/o raffionose माध्यम की इसी राशि के साथ एच2o पूरक का उपयोग करें ।
- ३.५ कदम परिष्करण के बाद, मिश्रण 4 ४९६ µ एल spheroplasting बफर के साथ spheroplasted ५० मिलीलीटर संस्कृति के µ एल (लगभग 2 × 106 spheroplasts) और 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर ४०० एक्स जी
- 10 एमएल एच2में गोली स्थगित हे आसुत, भंवर नमूना के लिए 30 एस, और बाहर प्लेट 10 µ एल पर नमूने के leucine d/o ग्लूकोज प्लेटों (2% ग्लूकोज, १.५% आगर, ०.५% अमोनियम सल्फेट, ०.१७% YNB, और ०.०८७% डी/ओ मिक्स बिना leucine).
- 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए कोशिकाओं की मशीन । प्लेट पर उगी सेल कालोनियों की कुल संख्या की गणना करे । डेटा मूल्यांकन के लिए, केवल ९८% से अधिक दक्षता वाले नमूनों का उपयोग करें (कुल सेल कॉलोनी संख्या & #60; ४० कालोनियों/
4. ९६ में GFP रिपोर्टर परख माप-अच्छी तरह से प्लेटें
- बीज खमीर सेल spheroplasts में ३.७ चरण में प्राप्त ९६-अच्छी तरह से प्लेटें (२०० µ एल/
- Add ७० µ l स्थिर leucine d/o raffinose मध्यम नकारात्मक नियंत्रण युक्त (एक नी की eluate2 +-अपनत्व शुद्ध कोशिका lysate से IPTG-प्रेरित ई. कोलाई खाली वेक्टर व्यक्त कोशिकाओं) या 5 µ एम के एक अंतिम आरटीए एकाग्रता में शुद्ध आरटीए ( प्रत्येक कुआं में १६० g/L आरटीए) के लिए संगत ।
- तुरंत जोड़ने के 30 µ l स्थिर गैलेक्टोज समाधान (30% गैलेक्टोज, ०.८ M सोर्बिटोल) GFP अभिव्यक्ति प्रेरित और बाद में माप शुरू.
नोट: प्रयोग और 3 जैविक प्रतिकृति प्रति खमीर तनाव के अनुसार कम से कम 3 तकनीकी प्रतिकृति प्रदर्शन । - नमूना तैयारी खत्म करने के बाद (कदम 4.1-4.3), एक प्रतिदीप्ति रीडर में ९६-अच्छी तरह से थाली रखो और माप शुरू. GFP प्रतिदीप्ति डिटेक्शन के लिए आवश्यक 475/509 एनएम फ़िल्टर सेट का उपयोग करें । 30 डिग्री सेल्सियस, १२० rpm पर माप प्रदर्शन, और 20 घंटे (10 मिनट के अंतराल को मापने) के एक समय खिड़की पर 1 मिमी के एक मिलाते हुए व्यास के साथ ।
नोट: GFP फ़िल्टर सेट सामान्य रूप से सभी रीडर सिस्टम में उपलब्ध है. तापमान, समय खिड़की, अंतराल को मापने, और आरटीए एकाग्रता अपनी आवश्यकताओं के लिए समायोजित किया जा सकता है । प्रतिनिधि परिणाम आरेख 4में दिखाए जाते हैं । - वैकल्पिक: गुणवत्ता नियंत्रण के लिए माप में अतिरिक्त आंतरिक नियंत्रणों का उपयोग करें । 30 µ को जोड़कर एक नकारात्मक नियंत्रण तैयार l स्थिर leucine d/o raffinose माध्यम के बजाय 30% गैलेक्टोज (no GFP प्रेरण). इसके अलावा, ०.८ मीटर सोर्बिटोल स्थिर G418 समाधान (३०० µ g/एमएल) के ७० µ l को जोड़ें । प्रोटीन अनुवाद अवरोधक G418 प्रोटीन अवरोध के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है के रूप में यह खमीर में GFP अभिव्यक्ति रोकता है ।
- की गणना सापेक्ष GFP प्रतिदीप्ति प्रतिशत में 20 के लिए एच समय बिंदु निंनलिखित समीकरण के अनुसार ( चित्र 4aदेखें):
जहां नेकां नकारात्मक नियंत्रण है
- वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक मापने बिंदु के लिए सापेक्ष GFP प्रतिदीप्ति निर्धारित (इस मामले में 10 मिनट, यह भी कदम ४.४) ऊपर समीकरण का उपयोग करके देखें । जैसा कि चित्र 4Bमें दिखाया गया है, समय के साथ GFP प्रतिदीप्ति तीव्रता (y-अक्ष) को सोख्ता करके एक ग्राफ़ बनाएं (x-अक्ष) ।
जहां नेकां नकारात्मक नियंत्रण है
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Representative Results
इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल के सामांय कार्यप्रवाह चित्रा 1में सचित्र है, मोटे तौर पर सफल आरटीए शुद्धि के लिए एकल कदम सारांश और बाद में GFP संवाददाता परख प्रयोग । प्रत्येक व्यक्ति के चरण का एक अधिक विस्तृत विवरण प्रोटोकॉल में पाया जा सकता है । चित्रा 2 अपनत्व क्रोमैटोग्राफी (चित्रा 2a) और खाली वेक्टर नियंत्रण (चित्रा बी3) द्वारा एक सफल आरटीए शोधन के अपेक्षित परिणाम दिखाता है । चित्र 2c एक नमक के एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है प्रोटीन पीक (नीला) और नमक-eluted चोटी (ब्राउन) के आदर्श जुदाई illustrating प्रयोग । एक प्रभावी आरटीए शुद्धि एक Coomassie के रूप में प्रस्तुत किया जाता है-सना हुआ एसडीएस जेल चित्रा 3में । अंत में, चित्रा 4 कुछ मूल इस सरल और मजबूत GFP-रिपोर्टर परख विधि6द्वारा प्राप्त परिणामों संक्षेप । चित्रा 4a दिखाता है कि स्थापित GFP रिपोर्टर परख के लिए विश्वसनीय परिणाम उत्पंन करने में सक्षम है और योजनाबद्ध रूप से GFP रिपोर्टर इस अध्ययन में इस्तेमाल किया प्लाज्मिड दर्शाया गया है । ग्राफ में आरटीए-स्वास्थ्यकर्मी व गैर स्वास्थ्यकर्मी स्थितियों के तहत खमीर spheroplasts के सापेक्ष GFP प्रतिदीप्ति की तुलना एक-दूसरे से की जाती है । के रूप में की उंमीद है, गैर प्रेरित और साथ ही G418-इलाज कोशिकाओं लगभग कोई GFP प्रतिदीप्ति दिखाओ । गैर-इलाज और नकारात्मक नियंत्रण-इलाज (खाली वेक्टर) कोशिकाओं में, GFP अभिव्यक्ति प्रभावित नहीं है और दोनों नमूनों के बीच महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया । इसके विपरीत, आरटीए उपचार की उंमीद GFP प्रतिदीप्ति अपनी ribosome बाधा गतिविधि द्वारा मध्यस्थता कमी की ओर जाता है । चित्रा 4Bमें, आरटीए-प्रेरित GFP प्रतिदीप्ति अवरोध का एक समय वक्र प्रदर्शित किया जाता है । इस तरह के डेटा प्रस्तुति GFP अभिव्यक्ति के समय के बारे में अतिरिक्त जानकारी शामिल है (गैलेक्टोज प्रेरण के बाद ९० मिनट) और आरटीए द्वारा अनुवादात्मक अवरोध के प्रारंभिक बिंदु (जंगली प्रकार की कोशिकाओं में आवेदन के बाद २१० मिनट) । आरटीए की मध्यस्थता में देरी प्रतिदीप्ति कमी सबसे अधिक संभावना cytosol को आरटीए के कैनेटीक्स और intracellular परिवहन को दर्शाता है । चित्र 4c एक 20 एच आरटीए-उपचार के बाद चयनित खमीर म्यूटेंट से प्राप्त रिश्तेदार GFP प्रतिदीप्ति दिखाता है और आरटीए-उपचार की तुलना में और आरटीए-इलाज जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में । ERAD अवयव Hrd1p और Der1p उपयुक्त सकारात्मक नियंत्रण के रूप में चुना गया क्योंकि पहले के अध्ययनों से पहले ही दिखा दिया है कि दोनों प्रोटीन ईआर में शामिल कर रहे है-cytosol retrotranslocation में आरटीए के खमीर1। इसलिए, दोनों म्यूटेंट जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में GFP प्रतिदीप्ति में अपेक्षित वृद्धि दिखाते हैं । इसके विपरीत, सापेक्ष GFP में प्रतिदीप्ति मान Δyos9 और Δnup१२० कक्ष काफी अलग नहीं हैं । यह पहले से ही वर्णन किया गया है कि न तो ईआर गुणवत्ता नियंत्रण लेक्टिन Yos9p की कमी और न ही परमाणु ताकना प्रोटीन में कमी Nup20p से प्रभावित आरटीए विषाक्तता और परिवहन1। विशिष्ट संबध क्रोमैटोग्राफी और लवण पैरामीटर की एक सूची तालिका 1में पाया जा सकता है ।
चित्र 1: आरटीए शुद्धि और GFP के सामान्य कार्यप्रवाह-रिपोर्टर परख । आरटीए शुद्धि (बाएं) अभिव्यक्ति या खाली वेक्टर खेती और IPTG-प्रेरित आरटीए अभिव्यक्ति के बाद के साथ ई. कोलाई के परिवर्तन के साथ शुरू होता है । सेल lysis और बाँझ-निस्पंदन के बाद, supernatant एनआई के माध्यम से शुद्ध है2 + संबध क्रोमैटोग्राफी और नमूना शुद्धता Coomassie धुंधला या पश्चिमी दाग के माध्यम से सत्यापित है. इससे पहले कि eluted आरटीए भागों GFP रिपोर्टर परख प्रयोग में उपयोग करने के लिए तैयार हैं, भागों को नमकीन और केंद्रित होने की जरूरत है, और प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित किया जाना चाहिए । GFP संवाददाता परख प्रयोग (दाएं) जंगली प्रकार के परिवर्तन के साथ शुरू होता है और/या चयनित GFP अभिव्यक्ति के साथ खमीर विलोपन म्यूटेंट का निर्माण । खेती के बाद सेल की दीवार को एंजाइमी इलाज द्वारा हटा दिया जाता है जिससे वीवो में आरटीए की अनुमति लेनी पड़ती है । फिर, GFP प्रतिदीप्ति खमीर सेल spheroplasts के तहत एक प्रतिदीप्ति रीडर में समय पर विष का इलाज किया और गैर इलाज शर्तों के तहत मापा जाता है (475/509 एनएम) । अंत में, सापेक्ष GFP प्रतिदीप्ति चरण ४.६ में दिखाए गए समीकरण का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है और आरेख 4में illustrated के रूप में प्रदर्शित होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: प्रतिनिधि संबध क्रोमैटोग्राफी और ई. कोलाई कोशिकाओं पीईटी-आरटीए(अपने) 6 या खाली वेक्टर नियंत्रण से युक्त परिणाम । (क) एक ई. कोलाई सेल lysate नमूना व्यक्त आरटीए(अपने) 6 वेक्टर pET24 से-आरटीए(अपने) 6के ठेठ शोधन ग्राफ । ब्लू वक्र २८० अमीनो एसिड टीआरपी, Tyr, और Cys के खुशबूदार छल्ले की वजह से एनएम में यूवी अवशोषण का प्रतिनिधित्व करता है और प्रोटीन संकेतक के रूप में कार्य करता है । स्तंभ लोडिंग के दौरान, असीमित प्रोटीन प्रवाह के माध्यम से (0-10 मिलीलीटर) में पाए जाते हैं । बाध्यकारी बफर के साथ धुलाई द्वारा असीम प्रोटीन को हटाने के बाद, रेफरेंस बफर एकाग्रता 0 से १००% (लाल वक्र) से बढ़ जाती है और बंधे प्रोटीन तुरंत कॉलम से eluted हैं । 25 और 30 मिलीलीटर के बीच नीले वक्र के शिखर उसकी-टैग आरटीए (ब्लैक बॉक्स) बाध्य के अंश का प्रतिनिधित्व करता है । (ख) एक ई. कोलाई lysate के विशिष्ट शुद्धि ग्राफ कोशिकाओं से खाली वेक्टर नियंत्रण व्यक्त । में (क) के रूप में एक ही शुद्धि प्रोटोकॉल । के रूप में ब्लैक बॉक्स में दिखाया गया है, कोई प्रोटीन नकारात्मक नियंत्रण में कॉलम से eluted हैं । (ग) एक ई. कोलाई pET24-आरटीए(उसकी) 6 नमूना के संबंध शुद्धि के बाद चित्र लवण । चित्र आरटीए प्रोटीन भिंन (20-30 एमएल के बीच २८० एनएम अवशोषण के पीक) और नमक अंश (30 एमएल के बाद बढ़ती कंडक्टर पीक) के विभाजन से पता चलता है ।कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: पहले और अपनत्व शुद्धि के बाद विभिंन नमूनों के प्रतिनिधि पश्चिमी विश्लेषण । 20 µ l cell lysate (गलियाँ 2-4) या शुद्ध नमूना (गलियाँ 5-7) विभिन्न आरटीए वेरिएंट की (केवल अनसंशोधित आरटीए इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था) एसडीएस द्वारा विश्लेषण-पृष्ठ और Coomassie नीले दाग । लेन 1, प्रोटीन सीढ़ी; लेन २, अनसंशोधित आरटीए; लेन 3, आरटीएHDEL; लेन 4, ्तKDEL; लेन ५, अनसंशोधित आरटीए; लेन 6, ्तHDEL; लेन 7, आरटीएKDEL। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: प्रतिनिधि आरटीए के लिए रिपोर्टर परख द्वारा प्राप्त परिणामों का इलाज जंगली-प्रकार और चयनित खमीर विलोपन म्यूटेंट । (क) वन्य-प्रकार खमीर spheroplasts के सापेक्ष GFP प्रतिदीप्ति रिपोर्टर प्लाज्मिड pRS315-K28एसपी-GFP (दाएँ) के अधीन प्रेरित (३% गैलेक्टोज, GFPind.) और गैर-उत्प्रेरण (२% raffinose, GFPrepr.) शर्तों के बाद २० ज GFP प्रेरण. रिश्तेदार GFP प्रतिदीप्ति भी आरटीए (5 µ एम), G418 (३०० µ जी/एमएल) या नकारात्मक नियंत्रण (नेकां) की उपस्थिति में विश्लेषण किया गया था । प्रोटीन अनुवाद अवरोधक G418 सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है और खमीर में GFP अभिव्यक्ति रोकता है । मतलब मूल्यों और मानक विचलन (एसडी) संकेत कर रहे हैं । (ख) सापेक्ष GFP प्रतिदीप्ति से (क) 20 ज से अधिक समय पाठ्यक्रम के रूप में प्रदर्शित । यह आरेख आरटीए द्वारा GFP अभिव्यक्ति और अनुवाद निषेध के समय के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है; वक्र व्यवहार परोक्ष रूप से आरटीए कैनेटीक्स और intracellular परिवहन के cytosol को दर्शाता है । (ग) सेलुलर प्रोटीन में चयनित खमीर म्यूटेंट दोषपूर्ण के प्रतिनिधि परिणाम है कि शामिल करने के लिए जाना जाता है (Hrd1p और Der1p) या शामिल नहीं (Yos9p और Nup120p) में आरटीए तस्करी में खमीर1,6। बिंदीदार रेखा के महत्व की दहलीज जो प्रतिदीप्ति सकारात्मक नियंत्रण उपभेदों द्वारा प्राप्त उत्सर्जन पर आधारित है का प्रतिनिधित्व करता है (आगे विवरण के लिए संदर्भ देखें6) । मतलब मूल्यों और मानक विचलन (एसडी) संकेत कर रहे हैं । यह आंकड़ा बेकर एट अल से संशोधित किया गया था । 6 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| अपनत्व chromotography पैरामीटर | ||
| मापन पैरामीटर | यूवी (२८० एनएम), रेफरेंस बफर एकाग्रता, कंडक्टर | |
| सेटिंग्स | चर इकाई/ | मान |
| प्रवाह दर | एमएल/ | 1 |
| अधिकतम स्तंभ दबाव | mpa | ०.३५ |
| तरंगदैर्ध्य | एनएम | २८० एनएम |
| बाइंडिंग बफ़र | पंप की स्थिति | एक |
| रेफरेंस बफर | पंप की स्थिति | बी |
| एकाग्रता रेफरेंस बफर शुरू | % | 0 |
| सिस्टम वॉल्यूम मुआवजा | एमएल | 10 |
| स्तंभ equilibration | एमएल | 20 |
| superloop/सिरिंज पर नमूना इंजेक्शन | एमएल | कक्ष lysate वॉल्यूम |
| धुलाई कदम | एमएल | 20-35 |
| रेफरेंस स्टेप | एमएल | 20-35 |
| एकाग्रता रेफरेंस के दौरान बफर | % | १०० |
| 20% ेतोः के साथ कॉलम का अंशांकन | एमएल | ५० |
| साल्टिंग पैरामीटर | ||
| मापन पैरामीटर | यूवी (२८० एनएम), कंडक्टर | |
| सेटिंग्स | चर इकाई/ | मान |
| प्रवाह दर | एमएल/ | 4 |
| अधिकतम स्तंभ दबाव | mpa | ०.३५ |
| तरंगदैर्ध्य | एनएम | २८० एनएम |
| बाइंडिंग बफ़र | पंप की स्थिति | एक |
| रेफरेंस बफर | पंप की स्थिति | बी |
| एकाग्रता रेफरेंस बफर शुरू | % | 0 |
| सिस्टम वॉल्यूम मुआवजा | एमएल | 10 |
| स्तंभ equilibration | एमएल | 20 |
| superloop/सिरिंज पर नमूना इंजेक्शन | एमएल | कक्ष lysate वॉल्यूम |
| साल्टिंग बफर इंजेक्शन (०.८ मी सोर्बिटोल) | एमएल | १०० |
| 20% ेतोः के साथ कॉलम का अंशांकन | एमएल | ५० |
तालिका 1: स्तंभ-आधारित समानता शुद्धि और लवण के लिए उपयोग किए गए पैरामीटर्स. सभी प्रासंगिक कॉलम सेटिंग्स की सूची (उदा., प्रवाह दर, रेफरेंस बफर एकाग्रता, equilibration और धुलाई चरण की अवधि) और मापा मापदंडों (जैसे, कंडक्टर या यूवी अवशोषण) ।
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Discussion
उपरोक्त प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय, हम प्रयोग के सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित सुझावों की अनुशंसा करते हैं.
heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए, यह 1 मिमी की IPTG एकाग्रता से अधिक नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है । IPTG सांद्रता & #62; 1 मिमी प्रमोटर प्रेरित आरटीए अभिव्यक्ति को बाधित और कम विष पैदावार के लिए सीसा । इसके अलावा, कोशिकाओं को 28 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर नहीं खेती की जानी चाहिए शामिल शरीर गठन, अक्षम तह, और विष निष्क्रियता को रोकने के लिए । कम तापमान पर आरटीए अभिव्यक्ति (जैसे, 20-28 डिग्री सेल्सियस) संभव है और भी जैविक सक्रिय विष के उत्पादन की ओर जाता है । हालांकि, अतिरिक्त तापमान में कमी महत्वपूर्ण 28 डिग्री सेल्सियस (डेटा नहीं दिखाया गया है) की तुलना में कम कुल विष उपज में आरटीए गतिविधि/तह और परिणाम में सुधार नहीं है ।
संबध क्रोमैटोग्राफी के शुद्धिकरण मापदंडों (तालिका 1) एक स्वचालित शुद्धि 5 एमएल एनआई2 + संबध कॉलम के साथ सुसज्जित प्रणाली के उपयोग के लिए अनुकूलित कर रहे है और अंय घर बनाया या वाणिज्यिक कॉलम प्रणालियों के लिए समायोजित किया जाना चाहिए अगर आरटीए पवित्रता और उपज उप इष्टतम हैं । उप-इष्टतम आरटीए शुद्धता के मामले में (Coomassie-सना हुआ एसडीएस-जैल में अतिरिक्त प्रोटीन की उपस्थिति द्वारा संकेत), बाध्यकारी बफर के imidazole एकाग्रता में वृद्धि आम तौर पर सकारात्मक आरोप लगाया प्रोटीन के लिए विशिष्ट बाध्यकारी कम कर देता है स्तंभ, जिससे समग्र आरटीए शुद्धता में वृद्धि । उप-इष्टतम आरटीए पैदावार के मामले में, अतिरिक्त sonification कदम (4-8 दालें) की शुरूआत, अब मशीनीकरण बार (5 ज) या बड़ा संस्कृति खंड (& #62; 1 एल) समग्र विष उपज में सुधार करने में मदद कर सकते हैं । हालांकि, वहां भी है सफलतापूर्वक स्पिन कॉलम आधारित सिस्टम के माध्यम से आरटीए शुद्ध करने का अवसर (डेटा नहीं दिखाया गया है) अगर एक स्वचालित प्रणाली लैब में उपलब्ध नहीं है ।
इस के दौरान, यह नमूना प्रक्रिया को छोड़ करने के लिए जैसे ही कंडक्टर वृद्धि करने के लिए शुरू होता है छोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है । नमक के साथ संदूषण, विशेष रूप से imidazole, प्रोटीन एकाग्रता माप प्रभावित, गलत आरटीए एकाग्रता निर्धारण जो सीधे GFP रिपोर्टर परख में इस्तेमाल किया आरटीए सामग्री को प्रभावित करता है जिसके परिणामस्वरूप ।
यह 4 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध आरटीए की दुकान और ठंड से बचने के लिए आवश्यक है । जमे हुए नमूनों XTT में आरटीए के एक कम गतिविधि दिखाने के हेला कोशिकाओं पर सेल जीवन परख आधारित (डेटा नहीं दिखाया गया है) । शुद्ध नमूनों के लिए रखा जा सकता है के आसपास 3-4 सप्ताह पहले उनकी जैविक गतिविधि लगातार कम है । इसके अलावा, उच्च आरटीए सांद्रता (≥ 5 मिलीग्राम/स्पिन कॉलम एकाग्रता के बाद महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि आरटीए ०.८ एम सोर्बिटोल में हाला की प्रवृत्ति दिखाता है ।
विधि का एक दोष तथ्य यह है कि आरटीए सामान्य रूप से बरकरार खमीर कोशिकाओं द्वारा नहीं लिया जाता है । विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, खमीर सेल दीवार एंजाइमी उपचार द्वारा पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए । इसलिए, यह कदम 3.4-3.5 में वर्णित विधियों द्वारा प्रत्येक खमीर तनाव के spheroplast गठन दक्षता की जांच करने के लिए आवश्यक है । उप के मामले में इष्टतम spheroplast तैयारी, मशीन समय और lytic एंजाइम एकाग्रता अनुकूलित और चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से निगरानी की जानी चाहिए. अपच (भूत गठन) lytic एंजाइम एकाग्रता को कम करने से रोका जा सकता है और/या मशीन समय विपरीत दृष्टिकोण अपर्याप्त पाचन के मामले में जरूरत है, जबकि । अपर्याप्त सेल दीवार हटाने के साथ उपभेदों से डेटा डेटा मूल्यांकन से बाहर रखा जाना चाहिए ।
यह भी प्रयोगात्मक सेटअप पूरी तरह से ricin की प्राकृतिक नशे की प्रक्रिया की नकल नहीं करता है कि उल्लेख किया जाना चाहिए । ricin (RTB) के सेल बाइंडिंग बी यूनिट याद आ रही है जो सामांय रूप से कुशल विष स्तनधारी कोशिकाओं के सेल सतह पर गैलेक्टोज अवशेषों को बाध्यकारी के लिए जिंमेदार है15। सैद्धांतिक रूप से, इस सीमा को अपनी ए और बी उपइकाई युक्त शुद्ध ricin holotoxin के साथ प्रयोग प्रदर्शन से दूर किया जा सकता है. फिर भी, खमीर कोशिकाओं गैलेक्टोज अवशेषों के पास नहीं है उनके सेल सतह पर जो RTB की बाध्यकारी मध्यस्थता सकता है8; यह तथ्य भी क्यों बरकरार खमीर कोशिकाओं ricin के खिलाफ संवेदनशील नहीं है बताते हैं । इस प्रकार, यह अगर RTB खमीर मॉडल में सेल बाइंडिंग घटक के रूप में कार्य करेगा स्पष्ट नहीं है । दिलचस्प है, पूर्व अध्ययनों से पहले ही प्रदर्शन किया है कि आरटीए अपने सेल बाध्यकारी बी उपइकाई16के बिना स्तनधारी कोशिकाओं के cytosol तक पहुंचने में सक्षम है । इस घटना को समझने के लिए, हम cytosol में प्लाज्मा झिल्ली से विष तस्करी की सुविधा जो खमीर में सेलुलर घटकों की पहचान करने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप में केवल आरटीए का उपयोग करने का फैसला किया । हैरत की बात है, खमीर में आरटीए तस्करी में शामिल घटक स्तनधारी कोशिकाओं में कुशल ricin holotoxin परिवहन के लिए आवश्यक घटकों के लिए हड़ताली समानताएं दिखाएं6। इन परिणामों के आधार पर, यह अनुमान लगाया जा सकता है कि RTB intracellular ricin परिवहन में एक छोटी सी भूमिका निभाता है पहले से चाहिए और स्तनधारी सेल सतह के लिए प्रारंभिक संपर्क के लिए ही महत्वपूर्ण है ।
इसके विपरीत, स्तनधारी कोशिकाओं में सिरना आधारित सिस्टम पूरी तरह से प्राकृतिक विष स्थिति को प्रतिबिंबित, लेकिन समय लेने वाली और महंगी3। इसके अलावा, खमीर विलोपन म्यूटेंट का उपयोग महत्वपूर्ण लाभ है कि म्यूटेंट एक पूरा दस्तक दिखाने के हित के प्रोटीन से बाहर भालू, जबकि सिरना आधारित सिस्टम आम तौर पर प्रोटीन स्तर की कमी के लिए सीसा । कुछ मामलों में, अवशिष्ट प्रोटीन का स्तर विष परिवहन के लिए पर्याप्त हो सकता है जिससे कोई बदल phenotype और मनाया जाता है, इस प्रकार, विशिष्ट प्रोटीन की भागीदारी सिरना-आधारित सिस्टम में दिखाई नहीं देता है ।
हालांकि केवल गैर आवश्यक खमीर विलोपन उपभेदों मूल अध्ययन में इस्तेमाल किया गया6, तापमान के प्रति संवेदनशील उपभेदों के रूप में अच्छी तरह के रूप में mRNA गड़बड़ी (नम) संग्रह उपभेदों द्वारा कम बहुतायत (आवश्यक की अभिव्यक्ति के स्तर में कमी प्रोटीन) भविष्य में इस प्रकार की विधि के लिए इसी तरह उपयुक्त हैं । सामांय में, आवश्यक प्रोटीन की भूमिका व्यवहार्यता की कमी के कारण इस परख के साथ जांच नहीं की जा सकती है, इसलिए परख प्रणाली की एक सीमा का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
हालांकि, नए रिपोर्टर परख मौजूदा तरीकों को मॉडल जीव एस cerevisiaeमें आरटीए परिवहन का विश्लेषण करने की कोशिश करने के लिए एक सुरुचिपूर्ण और वैकल्पिक रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है । मौजूदा अध्ययन intracellular प्लाज्मिड-संचालित आरटीए अभिव्यक्ति प्रणाली का इस्तेमाल किया और cytosol1,7में ईआर से रेट्रो-translocation के विश्लेषण के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं । extracellular आरटीए आवेदन के सफल कार्यांवयन अब न केवल एर retrotranslocation अध्ययन करने की संभावना को खोलता है, लेकिन यह भी परोक्ष रूप से प्रधानमंत्री से आरटीए परिवहन का विश्लेषण करने के लिए हालांकि Golgi एर ।के रूप में सेलुलर समारोह और खमीर जीन के बहुमत के स्थानीयकरण आजकल की खोज की है और डेटाबेस में उपलब्ध है, की पहचान की उंमीदवार प्रोटीन सीधे विशिष्ट डिब्बों और/
कुल मिलाकर, पेश रिपोर्टर परख विधि एक आसान और मजबूत दृष्टिकोण को उंमीदवार विषाक्त पदार्थों या विष उपयूनिटों (जैसे, आरटीए) जो vivo मेंप्रोटीन अनुवाद ब्लॉक के intracellular तस्करी में शामिल प्रोटीन की पहचान का प्रतिनिधित्व करता है । अपेक्षाकृत कम मानक विचलन (1-10%) साथ ही मूल अध्ययन में उच्च डाटा reproducibility इन बयानों की पुष्टि करता है । ९६-खैर प्लेट स्वरूप होने के कारण विष शोधन के बाद एक दिन के भीतर विभिन्न खमीर म्यूटेंट की एक तेज स्क्रीनिंग संभव है ।
भविष्य में, खमीर विलोपन पुस्तकालयों के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए विधि का उपयोग करने के लिए संभावना है । वर्तमान सेटअप में, एप्लाइड आरटीए एकाग्रता (5 µ एम) ५०% करने के लिए रिश्तेदार GFP प्रतिदीप्ति कम करने में सक्षम है । इन शर्तों के तहत, विधि को हटाने म्यूटेंट के साथ ऋणात्मक (increased GFP प्रतिदीप्ति) और आरटीए परिवहन पर धनात्मक (कम GFP प्रतिदीप्ति) प्रभाव की पहचान करने के लिए लाभ प्रदान करता है । उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए, इलाज और गैर इलाज नमूनों के बीच एक मजबूत अंतर कभी-कभार फायदेमंद होता है । उच्च आरटीए सांद्रता और/या बढ़ाने के उपाय के अंतराल का उपयोग करके (उदा., ४८ ज), GFP अभिव्यक्ति का एक और भी स्पष्ट ब्लॉक प्राप्त किया जाना चाहिए ।
इस पर बल दिया जाना है कि इस विधि खमीर में extracellular एप्लाइड आरटीए के नशे की प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए ही प्रतिबंधित नहीं है, लेकिन वहां भी इस GFP रिपोर्टर तनाव में एक प्लाज्मिड के माध्यम से आरटीए व्यक्त द्वारा आरटीए के ईआर आयात का विश्लेषण करने का अवसर है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इसके अलावा, स्क्रीनिंग दृष्टिकोण इसी तरह भविष्य में zymocin18 जैसे प्रोटीन को बाधित अंय प्रोटीन के intracellular परिवहन रास्ते का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । zymocin की अच्छी तरह से हत्या मोड के विपरीत, अपेक्षाकृत कम cytosol19,20में कुशल विष परिवहन के लिए जिंमेदार तस्करी रास्ते के बारे में जाना जाता है । इस प्रकार, zymocin भविष्य के अध्ययन के लिए एक इष्टतम उंमीदवार का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में zymocin स्वाभाविक रूप से खमीर कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है । इस प्रकार, सेल दीवार को हटाने का लोप किया जा सकता है जो GFP रिपोर्टर परख के समग्र प्रदर्शन में सुधार (समय और लागत के संबंध में) । इस शक्तिशाली संवाददाता परख की मदद से, यह खमीर में zymocin के intracellular परिवहन मार्ग (ओं) टुकड़े करने के लिए संभव होगा ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन के कुछ हिस्सों को कृपया ड्यूश Forschungsgemeinschaft (SFB १०२७, A6) से अनुदान द्वारा समर्थित थे ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
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