Summary
In der Handschrift beschreiben wir die Verwendung eines Hefe-basierte Fluoreszenz Reporter Assays, zelluläre Komponenten des Menschenhandels beteiligt und Tötung Prozesse von der zytotoxischen eine Untereinheit der Pflanze Toxin Rizin (RTA) zu identifizieren.
Abstract
Bakterien- und Werk A / B Toxine nutzen die natürlichen Handel Wege in eukaryotischen Zellen, deren intrazellulären-Zielen in das Zytosol zu erreichen und letztlich töten. Solche A / B Toxine bestehen in der Regel von einer enzymatisch aktive Asubunit (z.B. Ricin Toxin (RTA)) und mindestens eine Zelle, die Bsubunit(s), die verantwortlich sind für Toxin Bindung an bestimmte Oberfläche Rezeptoren Zelle binden. Unseren derzeitigen Kenntnissen wie A / B-Toxine sind in der Lage, effizient berauschenden Zellen half Wissenschaftler um grundlegenden zellulären Mechanismen wie Endozytose und intrazelluläre Protein Sortierung in höhere eukaryotische Zellen zu verstehen. Aus medizinischer Sicht ist es ebenso wichtig, die großen Toxin Handelsrouten, angemessene Behandlungslösungen für Patienten zu finden oder entwickeln schließlich therapeutische Toxin-basierten Anwendungen für die Krebstherapie zu identifizieren.
Seit genomweite Analysen von A / B Toxin in Säugetierzellen Menschenhandel ist komplex, zeitaufwändig und teuer, mehrere Studien an A / B Toxin Transport bei Modellorganismus der Hefe Saccharomyces Cerevisiaedurchgeführt wurden. Obwohl Sie weniger komplex, grundlegende zelluläre Prozesse in Hefe und höhere eukaryotische Zellen sind ähnlich und sehr häufig Ergebnisse, die in der Hefe die Säugetier-Situation übertragbar auf.
Hier beschreiben wir einen schnell und einfach zu bedienen-Reporter Assay zur Analyse der intrazellulären Handel mit RTA in der Hefe. Ein wesentlicher Vorteil des neuen Tests ist die Möglichkeit, nicht nur RTA Retro-Translokation aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) in das Zytosol zu untersuchen, aber eher Endozytose und retrograde Toxin transport von der Plasmamembran in der Notaufnahme. Der Test nutzt ein Reporter Plasmid, die indirekte Messung der RTA Toxizität durch Fluoreszenzemission von das grün fluoreszierende Protein (GFP) kann nach der in-Vivo -Übersetzung. Da RTA effizient die Einleitung der Protein-Biosynthese von 28 s rRNA Depurinierung verhindert, ermöglicht dieser Assay die Identifikation von Host Zellproteinen intrazellulären RTA-Beförderung durch die Erkennung von Veränderungen in Fluoreszenzemission.
Introduction
Patienten mit Infektionen durch Toxin produzierenden Bakterien stellen eine schwere medizinische und finanzielle Belastung für jeden sozialen Gesundheitssystem, insbesondere, da effiziente therapeutische Behandlungen noch weitgehend fehlen. Entwicklung neue therapeutische Strategien, die komplexe Rausch-Mechanismen der medizinisch relevanten A / B Giftstoffe wie Cholera Toxin oder Shiga Toxin Rizin vollständig verstanden werden, auf molekularer Ebene basierend auf neuartige leistungsfähige Assays, die umgesetzt werden müssen.
In den letzten Jahren mehrere Studien versucht, analysieren, A / B Toxin Transport in Hefe und Säugerzellen mit Zeit- und kostenintensive Methoden wie radioaktive Toxin zu beschriften,1,2 sowie SiRNA-basierten Screening 3nähert. In einigen Fällen ist die Toxin Menschenhandel visualisierte in Vivo durch Fluoreszenz-Mikroskopie nach chemische und/oder genetische Kopplung der einzelnen Toxin Untereinheiten mit Fluorophore, Quantenpunkte oder fluoreszierende Proteine4,5gewesen. Leider, solche Änderungen führen oft zu inaktiv und/oder veränderten natürlichen Eigenschaften der Giftstoffe. Eine weitere elegante Möglichkeit, indirekt eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragen zu beantworten ist die Verwendung von Reporter-Systeme auf Basis von Enzymen wie LacZ, Luciferase oder fluoreszierende Proteine (z. B. GFP oder Discosoma sp. rot fluoreszierenden Proteins () DsRed)).
In diesem Manuskript ist ein einfaches Protokoll beschrieben die zelluläre Komponenten für den intrazellulären Transport von extrazellulär angewandte RTA in S. Cerevisiaeidentifiziert. Dabei fungiert ein Fluoreszenz-Reporter-Plasmid enthält eine N-terminale ER-Import-Signal gefolgt von GFP als ein Protein-Biosynthese-Sensor, der indirekt RTA-vermittelten Protein Übersetzung Hemmung von GFP Fluoreszenzemission nach in-vivo misst Übersetzung6. RTA Endozytose oder intrazellulären Handel ist negativ (oder positiv) in eine bestimmte Hefe Löschung Mutante im Vergleich zu Wildtyp betroffen, so kann dies durch eine Erhöhung (oder Verringerung) GLP Fluoreszenz Emission6erkannt werden.
Bisher beschränkten sich alle Methoden analysieren RTA Transport in Hefezellen, den ER zum Zytosol Retro-Translokation Prozess der RTA. In solch ein künstliches System drückt sich RTA mit ein ER-Import-Signal von einem induzierbaren Promoter wiederum eine selbstmörderische Phänotyp1,7. Obwohl die Zelle binden B-Untereinheit Ricin ebenfalls in der Versuchsaufbau beschrieben in dieser Handschrift fehlt ist und somit vollständig nicht die natürliche Situation von Ricin Holotoxin Rausch8, Toxin-Transport aus dem Plasma repräsentiert Membran durch den Golgi Apparat in die Notaufnahme kann eng mit dieser neuartigen Assay nachgeahmt werden. Interessanterweise zeigen die vorläufigen Ergebnisse der Pilotstudie, dass die Handel Wege von RTA verwendet auffallende Ähnlichkeiten mit den Rausch-Route von Ricin Holotoxin offenbaren.
Zusammenfassend lässt sich sagen kann das beschriebene Verfahren verwendet werden, zu bestimmen, die spezifische Rolle der ausgewählten zelluläre Proteine im RTA Endozytose und des Handels in der Hefe. Darüber hinaus könnte diese Versuchsanordnung leicht andere Ribosom Inaktivierung Toxine produziert und abgesondert von verschiedenen Hefen und Bakterien-Spezies wie Zymocin oder Shiga Toxin angepasst werden.
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Protocol
Hinweis: Eine Übersicht über die allgemeine experimentelle Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.
Achtung: RTA ist sehr giftig für den Menschen. Sicherheit Labor Erlaubnis S2 (Biosafety level 2 Äquivalent) ist erforderlich. Bitte tragen Sie Handschuhe während des gesamten Experiments.
(1) heterologen Expression von sein-tagged RTA in Escherichia coli
- E. Coli Zellen mit Ausdruck Plasmid pET24-RTA(His) 6 oder leerer Vektor pET24a(+) mit standard Elektroporation Protokolle9,10zu verwandeln. Zellen mit dem leeren Plasmid dienen als Negativkontrolle.
- Nach Auswahl des positiven Klone auf Kanamycin-haltigen (100 µg/mL) LB-Platten Zellen, in denen das RTA-Expressionsplasmid oder der leere Vektor in 5 mL LBkan Medium (LB-Medium mit 100 µg/mL Kanamycin) zu impfen und Inkubation bei 37 ° C und 220 u/min für 24 h.
- Ergänzen Sie 1 L LBkan Medium mit 5 mL Vorkultur zu und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C und 220 u/min bis Zellen eines OD600 von 0,8-1,0 (ca. 3-4 h) erreicht haben. Danach reduzieren Sie Kultur Temperatur 28 ° c und bereiten Sie eine 1 M Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) Stammlösung in H2O.
- RTA-Ausdruck von E. Coli durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM zu induzieren.
- Waschen Sie nach 3,5 h bei 28 ° C und 220 u/min, Ernte Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 x g und 4 ° C für 10 min das Pellet zweimal mit 5 mL Bindung Puffer (500 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 20 mM KH2PO4 pH = 7,4) bei 10.000 x g und 4 ° C für 10 min und Aufschwemmen Pellet in 5 mL Bindung Puffer.
Hinweis: Protokoll kann in dieser Phase angehalten werden und Zellen können für mehrere Tage bei 80 ° C gelagert werden.
2. Reinigung des sein-tagged RTA über Affinitätschromatographie
- Beschallen Sie Zellen auf Eis mit das folgende Protokoll: 15 s-Pulse (20 Mikron), 30 s Pause. Wiederholen Sie diesen Schritt fünf Mal.
- Zentrifugieren Sie Zelle lysate auf 21.000 x g und 4 ° C für 15 min und Filtern Sie überstand eine sterile Spritze-Filter-System (0,2 µm Porengröße) verwenden.
Hinweis: Zelle Pellets erfolgreich beschallten Proben zeigen transparente Ränder. - Verwenden Sie ein automatisches Reinigungssystem ausgestattet mit einer 5 mL Ni2 +-basierte Affinität Spalte um die sein-tagged RTA-Fraktion aus der steril filtriert E. Coli überstand zu reinigen. Im Allgemeinen verwenden Sie eine Elution Geschwindigkeit von 1 mL/min und kühl das ganze Reinigungssystem zur Vermeidung von nicht-effiziente Toxin Bindung und Verlust der Toxin-Aktivität.
Hinweis: Parameter für die effiziente Reinigung der RTA sind in Tabelle 1aufgeführt. Siehe auch Becker Et Al. für weitere Informationen9.- Kurz, equilibrate der Affinität Spalte mit 20 mL Bindung Puffer, Speicher-Puffer zu entfernen. Wenden Sie steril filtriert Überstand auf die Affinität Säule mit einer Spritze.
- Waschen Sie die Spalte mit 25-35 mL Bindung Puffer, die ungebundenen Proteine aus der Spalte zu entfernen. Führen Sie den Waschschritt bis UV-Absorption bei 280 nm liegt in der Nähe der UV-Anfangswert.
- Eluieren gebundene RTA Bruchteil in 20-35 mL Elution Buffer (500 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7,2) und halten Sie die Probe auf Eis (Abb. 2A und 2 b).
Hinweis: Elution der RTA-Fraktion zeichnet sich durch eine Zunahme der UV-Absorption. Hinweis: um diese Fraktion zur Vermeidung von Kontamination mit unspezifischen gebundene Proteine ausschließlich zu sammeln. - Verwenden Sie 20 µL des eluierten Proben Coomassie blaue Färbung11 oder Western-Blot Analyse12,13 (Optional) durchführen. Verwenden Sie primär Anti-His Antikörper (1:1 000) und sekundären anti-mouse-IgG-HRP (01:10, 000) zur Erkennung von RTA und überprüfen Probe Reinheit (Abbildung 3).
- Entsalzen eluierten RTA Bruchteil einer 5 mL Entsalzung Spalte und equilibrate Probe in 0,8 M Sorbit.
- Ersetzen der Affinität Spalte das Reinigungssystem der Entsalzung spaltenweise und equilibrate zuerst die Spalte mit 20 mL 0,8 M Sorbit.
- Wenden Sie den eluierten RTA-Bruch in die Spalte über eine Spritze an. Waschen Sie die Spalte mit 100 mL 0,8 M Sorbit und eluieren Sie entsalzten RTA-Bruch in der 15 mL Tube, sobald die UV-Absorption beginnt zu erhöhen (Abbildung 2).
- Speichern Sie den eluierten RTA-Bruch bei 4 ° C.
Hinweis: Hören Sie RTA Bruchteil Probenahme direkt auf, wenn Leitfähigkeit steigt auf um Salz Kontamination zu vermeiden. Parameter für die Entsalzung Verfahren sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Eluierten RTA Bruchteil bei 10.000 x g und 4 ° C für 30-180 min mit einer 10 kDa Cutoff Spin Spalte zu einem Endvolumen von ca. 1-2 mL zu konzentrieren und Probe bei 4 ° C für 3-4 Wochen aufbewahren.
Achtung: Nicht Einfrieren der Probenmaterials seit Einfrieren führt zu einem vollständigen Verlust des RTA-Aktivität. - Proteinkonzentration mit einem konventionellen Protein Entschlossenheit-Kit zu bestimmen. Proteinkonzentration sollte im Bereich von 1-1,5 mg/mL sein.
Hinweis: RTA tendenziell herbeiführen, wenn die Proteinkonzentration zu hoch ist (> 5 mg/mL).
3. Hefe-Transformation und Zellwand entfernen
- Wildtyp oder ausgewählte Hefe Löschung Mutanten mit der GFP Reporter Plasmid pRS315-K28SP- GLP6 mit standard-Lithium-Acetat Umwandlung Methoden14zu verwandeln. Inkubieren Sie Zellen auf Leucin Drop-out (d/o) Glukose-Platten (2 % Glukose, 1,5 % Agar, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % Hefe Stickstoff Basis (YNB) und 0,087 % d/o Mix ohne Leucin) bei 30 ° C für ca. 2-3 Tage für positive Klon-Auswahl.
- Wählen Sie 3 verschiedene Hefe Klone von jeder Platte und impfen die Klone in 100 mL Leucin d/o Raffinose Medium (2 % Raffinose, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % YNB und 0,087 % d/o ohne Leucin mix) bei 220 u/min und 30 ° C bis OD600 = 1,0-2,0 (2-4 x 107 Zellen/mL).
Hinweis: Zellwachstum von den verschiedenen Hefestämme Löschung unterscheidet. Monitor OD600 über einem Spektrophotometer. - Um600 OD-Werte zu berechnen, verdünnen Sie Proben auf OD600 = 0,1-0,3 (1:5 bis 01:10 Verdünnungen) und OD600 in einem Spektrophotometer zu messen. Als Referenz verwenden Sie H2O, ergänzt mit der entsprechenden Menge an Leucin d/o Raffionose Medium.
- Nach Fertigstellung Schritt 3.5, 4 µL der spheroplasted 50 mL Kultur mit 496 µL Spheroplasting-Puffer (ca. 2 × 106 Spheroplasts) mischen und für 10 min bei 400 X g zentrifugieren.
- Aufschwemmen Pellet in 10 mL H2O destilliert, Vortex Probe für 30 s und Platte aus 10 µL der Probe auf Leucin d/o Glukose Platten (2 % Glukose, 1,5 % Agar, 0,5 % Ammoniumsulfat, 0,17 % YNB und 0,087 % d/o Mix ohne Leucin).
- Inkubieren Sie Zellen für 3 Tage bei 30 ° c Zählen Sie die Gesamtzahl der Erwachsenen Zelle Kolonien auf der Platte. Zur Datenauswertung, verwenden nur Proben mit mehr als 98 % Wirkungsgrad (Gesamt Kolonie Handynummer < 40 Kolonien/Platte).
(4) GLP Reporter Assay Messung in 96-Well-Platten
- Samen aus der Hefe Zelle Spheroplasts in Schritt 3,7 in 96-Well-Platten (200 µL/Well) erhalten.
- Fügen Sie 70 µL stabilisierte Leucin d/o Raffinose-haltigem Medium Negativkontrolle (Eluat eines Ni2 +-Affinität gereinigten Zelle lysate aus IPTG induziert E. Coli Zellen mit dem Ausdruck des leere Vektors) oder RTA in einer Endkonzentration von RTA von 5 µM (gereinigt entsprechend 160 g/L RTA) in jede Vertiefung.
- Fügen Sie sofort 30 µL stabilisiert Galaktose Lösung (30 % Galaktose, 0,8 M Sorbit) induzieren GFP Ausdruck und anschließend starten Sie die Messung.
Hinweis: Führen Sie mindestens 3 Technische Wiederholungen pro Experiment und 3 biologische repliziert pro Hefestamm. - Nach Abschluss der Probenvorbereitung (Schritte 4.1-4.3), die 96-Well-Platte in einem Fluoreszenz-Reader setzen und starten Sie die Messung. Verwenden Sie die 475/509 nm Filtersatz für GLP-Fluoreszenz-Detektion erforderlich. Messungen Sie bei 30 ° C, 120 u/min, und mit einem schütteln Durchmesser von 1 mm über ein Zeitfenster von 20 h (Messung von Abständen von 10 min).
Hinweis: Die GLP-Filter-Set gibt es normalerweise in alle Lesesysteme. Temperatur, Zeitfenster, Messung von Abständen und RTA-Konzentration kann für die eigenen Bedürfnisse angepasst werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4dargestellt. - Optional: Verwenden Sie zusätzliche interne Kontrollen bei der Messung für die Qualitätskontrolle. Bereiten Sie eine Negativkontrolle durch Zugabe von 30 µL stabilisierte Leucin d/o Raffinose Medium anstatt 30 % Galaktose (keine GFP Induktion). Darüber hinaus fügen Sie 70 µL 0,8 M Sorbit stabilisiert G418 Lösung (300 µg/mL). Die Protein-Übersetzung-Inhibitor G418 dient als Positivkontrolle für Protein-Hemmung wie GFP Ausdruck in der Hefe verhindert.
- Relative GFP-Fluoreszenz in Prozent für die 20 h-Zeitpunkt nach der folgenden Gleichung berechnen (siehe Abb. 4A):
wo NC ist die negativ-Kontrolle
- Alternativ, bestimmen die relativen GFP Fluoreszenz für jeden Meßpunkt (in diesem Fall 10 min, siehe auch Schritt 4.4) unter Verwendung der obigen Gleichung. Wie in Abbildung 4 bdargestellt, erstellen Sie ein Diagramm, indem die GFP-Fluoreszenz-Intensitäten (y-Achse) im Laufe der Zeit (x-Achse) beflecken.
wo NC ist die negativ-Kontrolle
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Representative Results
Die allgemeine Workflow des Protokolls beschrieben in diesem Manuskript wird in Abbildung 1, etwa fasst die einzelnen Schritte zur erfolgreichen RTA-Reinigung und das anschließende GFP Reporter Assay Experiment veranschaulicht. Eine ausführlichere Beschreibung jedes einzelnen Schritts finden Sie im Protokoll. Abbildung 2 zeigt das erwartete Ergebnis des erfolgreichen RTA Reinigung durch Affinitätschromatographie (Abbildung 2A) und leeren Vektor-Kontrolle (Abb. 2 b). Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives Ergebnis eine Entsalzung Experiment zur Veranschaulichung der ideale Trennung von der Protein-Peak (blau) und der Salz-eluiert Peak (braun). Eine effektive Reinigung der RTA ist in Form von Coomassie gefärbt SDS-Gel in Abbildung 3dargestellt. Abbildung 4 fasst schließlich einige ursprüngliche Ergebnisse dieses einfache und robuste GFP-basierte Reporter Assay Methode6. Abbildung 4A zeigt, dass die etablierten GFP Reporter Assay in der Lage ist, zuverlässige Ergebnisse zu erzielen und schematisch das GFP-Reporter-Plasmid in dieser Studie verwendet zeigt. In der Grafik ist die relative GFP Fluoreszenz der Hefe Spheroplasts RTA-behandelten und unbehandelten Bedingungen miteinander verglichen. Wie erwartet, zeigen-induzierte sowie G418-behandelten Zellen fast keine GFP-Fluoreszenz. In den unbehandelten und negative Kontrolle behandelt (leerer Vektor) Zellen GFP Ausdruck ist nicht betroffen und signifikante Unterschiede zwischen den beiden Proben wurden nicht beobachtet. Im Gegensatz dazu führt RTA Behandlung zur erwarteten GFP Fluoreszenz Reduktion vermittelt durch seine Aktivität hemmen Ribosom. In Abbildung 4 berscheint eine Zeitkurve der GFP RTA-induzierte Fluoreszenz Hemmung. Diese Art der Darstellung der Daten enthält zusätzliche Informationen über den Zeitpunkt der GFP Expression (90 min nach Galaktose Induktion) und der Ausgangspunkt für die translationale Hemmung von RTA (210 min nach der Applikation in Wildtyp Zellen). Die Verzögerung bei der RTA-vermittelten Fluoreszenz Abnahme am ehesten spiegelt die Aufnahme Kinetik und intrazellulären Transport von RTA, die Zellflüssigkeit. Abbildung 4 zeigt die relative GFP Fluoreszenz aus ausgewählten Hefe Mutanten nach einem 20 h RTA-Behandlung und im Vergleich zu RTA-Behandlung und im Vergleich zu Wildtyp Zellen RTA behandelt. Die ERAD Komponenten Hrd1p und Der1p wurden ausgewählt, als geeignete Positive steuert, weil frühere Studien bereits gezeigt, dass ER zum Zytosol Retrotranslocation von RTA in Hefe1beide Proteine beteiligt sind. Daher zeigen beide Mutanten die erwartete Steigerung der GFP Fluoreszenz im Vergleich zu Wildtyp Zellen. Im Gegensatz dazu sind relative GFP Fluoreszenz Werte in Δyos9 und Δnup120 Zellen nicht signifikant unterschiedlich. Es wurde bereits beschrieben, dass ein Mangel an ER Qualitätskontrolle Lektin Yos9p weder ein Mangel in der Kernpore Protein Nup20p RTA Toxizität und Transport1beeinflussen. Eine Liste der spezifischen Affinität Chromatographie und Entsalzung Parameter finden in Tabelle 1.
Abbildung 1: allgemeine Workflow der RTA Reinigung und GFP-basierte Reporter Assay. Die RTA-Reinigung (links) beginnt mit der Transformation von E. Coli mit dem Ausdruck oder leerer Vektor gefolgt von Anbau und IPTG induziert RTA Ausdruck. Nach lyse der Zelle Sterilfiltration und der Überstand wird über Ni2 + Affinitätschromatographie gereinigt und Probe Reinheit überprüft per Coomassie-Färbung oder Western-Blot. Bevor der eluierten RTA-Brüche in der GFP Reporter Assay Experiment verwenden möchten, Brüche musst entsalzt und konzentriert sein und Proteinkonzentration ermittelt werden muss. Die GFP Reporter Assay Experiment (rechts) beginnt mit der Umwandlung von Wildtyp und/oder ausgewählte Hefe Löschung Mutanten mit dem GFP-Ausdruck-Konstrukt. Nach Anbau wird die Zellwand durch enzymatische Behandlung erlauben RTA in Vivo Aufnahme entfernt. Dann wird GFP Fluoreszenz der Hefe Zelle Spheroplasts Toxin-behandelten und unbehandelten Bedingungen im Laufe der Zeit in einem Fluoreszenz-Reader gemessen (475/509 nm). Zu guter Letzt relative GFP Fluoreszenz wird mit Hilfe der Gleichung im Schritt 4.6 bestimmt und wird angezeigt, wie in Abbildung 4dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Repräsentative Affinitätschromatographie und Entsalzung Ergebnisse von E. Coli Zellen mit Haustier-RTA(His) 6 oder die leere Vektorregelung. (A) typische Reinigung Graph einer E. Coli Zelle lysate Probe RTA(His) 6 vom Vektor pET24-RTA(His) 6zum Ausdruck zu bringen. Blaue Kurve stellt die UV-Absorption bei 280 nm verursacht durch die aromatischen Ringe der Aminosäuren Trp, Tyr und Cys und dient als Protein-Indikator. Während des Ladens Spalte sind ungebundene Proteine im Durchflussverfahren (0-10 mL) entdeckt. Nach dem Entfernen nicht gebundenen Proteine durch Waschen mit Bindung Puffer, Elution Buffer Konzentration steigt von 0 auf 100 % (rote Kurve) und gebundene Proteine sind sofort von der Säule eluiert. Der Höhepunkt der blauen Kurve zwischen 25 und 30 mL Bruchteil der gebunden sein-tagged RTA (Black Box). (B) typische Reinigung Diagramm von einem E. Coli lysate Zellen leer Vektorsteuerung zum Ausdruck zu bringen. Gleiche Reinigung Protokoll wie in (A). Wie in der Black Box gezeigt, sind keine Proteine aus der Spalte in der negativen Kontrolle eluiert. (C) Desalting Diagramm einer E. Coli pET24-RTA(His) 6 Probe nach Affinitätsreinigung. Das Diagramm zeigt die Trennung von RTA Proteinfraktion (Spitzenwert von 280 nm Absorption zwischen 20-30 mL) und Salz Bruch (Erhöhung der Leitfähigkeit Peak nach 30 mL).Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Vertreter Western-Analyse der verschiedenen Proben vor und nach Affinitätsreinigung. 20 µL Zelle lysate (Bahnen 2-4) oder gereinigte Probe (Bahnen 5-7) der RTA-Varianten (nur unveränderte RTA wurde in dieser Studie verwendet) von SDS-PAGE und Coomassie blaue Färbung analysiert. Bahn 1, Protein-Leiter; Bahn 2, unveränderte RTA; Bahn 3, RTAHDEL; Bahn 4, RTAKDEL; Bahn 5, unveränderte RTA; Bahn 6, RTAHDEL; Bahn 7, RTAKDEL. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: repräsentative Ergebnisse durch die Reporter Assay für RTA behandelt Wildtyp und ausgewählte Hefe Löschung Mutanten. (A) Relative GFP Fluoreszenz von Wildtyp Hefe Spheroplasts, enthält die Reporter Plasmid pRS315-K28SP- GLP (rechts) unter induziert (3 % Galaktose, GFPind.) und nicht-induzierte (2 % Raffinose, GFPrepr.) Bedingungen nach 20 h GFP Induktion. Relative GFP Fluoreszenz analysiert wurde auch in Anwesenheit von RTA (5 µM), G418 (300 µg/mL) oder der negativen Kontrolle (NC). Die Protein-Übersetzung-Inhibitor G418 dient als positive Kontrolle und verhindert GFP Ausdruck in der Hefe. Mittelwert und Standardabweichung (SD) sind angegeben. (B) Relative GFP Fluoreszenz von (A) als zeitlicher Verlauf über 20 h angezeigt. Dieses Diagramm enthält zusätzliche Informationen über den Zeitpunkt der GFP Ausdruck und Übersetzung Hemmung von RTA; die Kurve Verhalten spiegelt indirekt die Kinetik der RTA Aufnahme und intrazellulären Transport in das Zytosol. (C) repräsentatives Ergebnis der ausgewählten Hefe Mutanten Defekt in zelluläre Proteine, die als bekannt sind (Hrd1p und Der1p) oder nicht beteiligt RTA Menschenhandel Hefe1,6(Yos9p und Nup120p). Die gestrichelte Linie stellt eine Schwelle von Bedeutung basiert auf der Fluoreszenz-Emission durch die Positivkontrolle Stämme erhalten (für weitere Erklärungen siehe Referenz6). Mittelwert und Standardabweichung (SD) sind angegeben. Die Figur wurde von Becker Et Al. modifiziert. 6 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| Affinität Chromotography parameter | ||
| Messparameter | UV (280 nm), Elution Buffer Konzentration, Leitwert | |
| Einstellungen | Variable/Einheit | Wert |
| Durchflussmenge | mL/min | 1 |
| Maximale Spalte Druck | MPa | 0,35 |
| Wellenlänge | nm | 280 nm |
| Bindung-Puffer | Pumpenposition | A |
| Elution buffer | Pumpenposition | B |
| Ab Konzentration Elution buffer | % | 0 |
| System-Volumenkompensation | mL | 10 |
| Spalte Gleichgewichtherstellung | mL | 20 |
| Probeninjektion über Superloop/Spritze | mL | lysate Zellvolumen |
| Waschen Sie Schritt | mL | 20-35 |
| Elution Schritt | mL | 20-35 |
| Konzentration Elution Buffer während der elution | % | 100 |
| Rekalibrierung der Spalte mit 20 % EtOH | mL | 50 |
| Entsalzung parameter | ||
| Messparameter | UV (280 nm), Leitwert | |
| Einstellungen | Variable/Einheit | Wert |
| Durchflussmenge | mL/min | 4 |
| Maximale Spalte Druck | MPa | 0,35 |
| Wellenlänge | nm | 280 nm |
| Bindung-Puffer | Pumpenposition | A |
| Elution buffer | Pumpenposition | B |
| Ab Konzentration Elution buffer | % | 0 |
| System-Volumenkompensation | mL | 10 |
| Spalte Gleichgewichtherstellung | mL | 20 |
| Probeninjektion über Superloop/Spritze | mL | lysate Zellvolumen |
| Entsalzung Puffer Injektion (0,8 M Sorbit) | mL | 100 |
| Rekalibrierung der Spalte mit 20 % EtOH | mL | 50 |
Tabelle 1: Parameter für die Spalte-basierte Affinitätsreinigung und Entsalzung. Liste aller relevanten Spalteneinstellungen (z.B., Durchfluss, Elution Buffer Konzentration, Gleichgewichtherstellung und waschen Schritt Dauer) und gemessenen Parametern (z.B., Leitfähigkeit oder UV-Absorption).
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Discussion
Wenn Sie die oben genannten Protokoll durchführen, empfehlen wir die folgenden Vorschläge zu ein erfolgreiches Ergebnis des Experiments zu erreichen.
Für heterologe Proteinexpression ist es wichtig, die IPTG-Konzentration von 1 mM nicht überschreiten. IPTG Konzentrationen > 1 mM zu hemmen, Promotor-induzierte RTA Ausdruck und führen zu geringeren Erträgen Toxin. Darüber hinaus sollten Zellen bei Temperaturen über 28 ° C zur Verhinderung Einbeziehung Körper Bildung, ineffiziente Falten und Toxin-Inaktivierung nicht angebaut werden. RTA Ausdruck bei niedriger Temperatur (z.B. 20-28 ° C) ist möglich und führt auch zur Produktion von biologisch aktiven Toxin. Jedoch die zusätzliche Temperaturabsenkung nicht wesentlich verbessern, RTA Aktivität/Falten und führt zu niedrigeren total Toxin Renditen im Vergleich zu 28 ° C (Daten nicht gezeigt).
Reinigung-Parameter der Affinitätschromatographie (Tabelle 1) sind optimiert für die Verwendung von einem automatischen Reinigungssystem mit 5 mL Ni2 + Affinität Spalte ausgestattet und zu anderen hausgemachten oder kommerzielle Säulensysteme angepasst werden, sollte wenn RTA Reinheit und Ausbeute sind suboptimal. Bei suboptimalen RTA Reinheit (gekennzeichnet durch das Auftreten von zusätzlichen Proteinen in SDS-Gele Coomassie gefärbt), eine Erhöhung der Imidazol-Konzentration des Puffers Bindung verringert normalerweise unspezifische Bindung von positiv geladenen Proteine, die Spalte, wodurch insgesamt RTA Reinheit. Im Falle einer suboptimalen RTA Erträge, Einführung von zusätzlichen Sonifikation Schritte (4-8 Impulse), längere Inkubationszeit (5 h) oder größere Mengen der Kultur (> 1 L) kann helfen, um die Gesamtausbeute Toxin zu verbessern. Allerdings gibt es auch die Möglichkeit, erfolgreich RTA über Spin Spalte basierend Systeme (Daten nicht gezeigt) zu reinigen ist ein automatisiertes System nicht im Labor verfügbar.
Bei der Entsalzung Schritt ist es wichtig, das Stichprobenverfahren zu überspringen, sobald der Leitwert zu steigen beginnt. Kontamination mit Salz, vor allem Imidazol, beeinflusst die Protein-Konzentrationsmessung, was zu ungenauen RTA Konzentrationsbestimmung, die direkten Einfluss auf die RTA-Inhalte in der GFP Reporter Assay verwendet.
Es ist wichtig, gereinigten RTA bei 4 ° C lagern und Einfrieren zu vermeiden. Gefrorene Proben zeigen eine reduzierte Aktivität von RTA in XTT-basierte Zelle Vitalität Assays auf HeLa-Zellen (Daten nicht gezeigt). Gereinigte Proben können gehalten werden, für etwa 3 bis 4 Wochen vor ihrer biologische Aktivität kontinuierlich verringert wird. Darüber hinaus sind hohe Konzentrationen der RTA (≥5 mg/mL) nach Spin Spalte Konzentration kritischer, weil RTA eine Tendenz zeigt, in 0,8 M Sorbit auszufällen.
Ein Nachteil der Methode ist die Tatsache, die RTA von intakter Hefezellen normalerweise nicht aufgegriffen wird. Um verlässliche Ergebnisse zu erzielen, muss die Hefe Zellwand durch enzymatische Behandlung vollständig entfernt werden. Daher gilt es Spheroplast Bildung jedes Hefestamm durch in Schritten 3.4-3.5 beschriebenen Methoden zu überprüfen. Im Falle einer suboptimalen Spheroplast Vorbereitung werden Inkubationszeit und lytische Enzym Konzentration optimiert und über Phasenkontrastmikroskopie überwacht. Overdigestion (Ghost Bildung) kann verhindert werden, indem lytische Enzym Konzentration und/oder Inkubation Zeit während der umgekehrten Weg im Falle unzureichender Verdauung benötigt wird. Daten von Stämmen mit unzureichender Zellwand Entfernung sollte aus der Auswertung ausgeschlossen werden.
Es sollte auch erwähnt werden, dass der experimentelle Aufbau den natürlichen Rausch Prozess Ricin nicht vollständig nachahmen. Die Zelle Bindung B Untereinheit Ricin (RTB) fehlt die normalerweise verantwortlich für die effiziente Toxin Bindung an Galaktose Rückstände an der Zelloberfläche von Säugerzellen15ist. Theoretisch kann diese Einschränkung überwunden werden, durch die Durchführung des Experiments mit gereinigtem Ricin Holotoxin mit A und B-Untereinheit. Dennoch besitzen Hefezellen keine Galaktose Rückstände auf ihrer Zelloberfläche die Bindung des RTB8vermitteln könnte; Diese Tatsache erklärt auch, warum intakter Hefezellen sind nicht empfindlich gegen Ricin. So ist es unklar, ob RTB als verbindlicher Bestandteil der Zelle in der Hefe-Modell handeln würde. Interessanterweise, nachweislich bisheriges Studium bereits RTA Zytosol von Säugerzellen ohne seine Zelle binden B Untereinheit16erreichen kann. Um dieses Phänomen zu verstehen, haben wir beschlossen mit dem nur RTA in der Versuchsanordnung Zellbestandteile in Hefe bestimmt die Toxin Menschenhandel aus der Plasmamembran in das Zytosol zu erleichtern. Überraschenderweise zeigen Komponenten RTA Menschenhandel Hefe auffallende Ähnlichkeiten, die erforderlichen Komponenten für effiziente Ricin Holotoxin Transport in Säugerzellen6. Basierend auf diesen Ergebnissen kann spekuliert werden, dass RTB eine untergeordnete Rolle im intrazellulären Ricin Verkehr spielt als bisher angenommen und nur für den Erstkontakt zu den Säugetier-Zellenoberfläche wichtig ist.
Im Gegensatz dazu SiRNA-basierten Systemen in Säugetierzellen perfekt spiegeln die natürliche Toxin-Lage, sondern sind aufwendig und teuer3. Darüber hinaus trägt die Verwendung von Hefe Löschung Mutanten dem wichtigen Vorteil, dass die Mutanten zeigen einen komplette Knock-out-Proteins des Interesses, während SiRNA-basierten Systemen in der Regel zu einer Verringerung der Proteinebene führen. In einigen Fällen können verbleibende Proteingehalte ausreichen für Toxin Transport wobei keine veränderten Phänotyp wird beobachtet und die Einbeziehung der spezifischen Proteins ist also nicht sichtbar in SiRNA-basierten Systemen.
Obwohl nur unwesentliche Hefestämme Löschung im Original verwendet wurden Studie6, Temperatur-Sensitive Stämme sowie verminderte Fülle von mRNA Störung (feucht) Sammlung Stämme17 (reduzierte Ausdruck Ebene der ätherischen Proteine) eignen sich ebenfalls für diese Art der Methode in der Zukunft. Im Allgemeinen kann nicht die Rolle der wesentlichen Proteine werden wegen ihrer mangelnden Rentabilität mit dieser Assay untersucht, also eine Einschränkung des Assay Systems darstellen.
Der neue Reporter Assay stellt jedoch eine elegante und alternative Strategie zu bestehenden Methoden die RTA-Transport in der Modellorganismus S. Cerevisiaezu analysieren versuchen. Die vorliegenden Studien verwendet intrazellulären Plasmid-driven RTA Expressionssysteme und beschränken sich auf die Analyse der Retro-Translokation von der Notaufnahme in die Zellflüssigkeit1,7. Erfolgreiche Umsetzung der extrazellulären RTA Anwendung jetzt eröffnet die Möglichkeit, nicht nur ER Retrotranslocation zu studieren, sondern auch indirekt RTA Transport vom PM aber die Golgi, die ER analysiert.Als die Zellfunktion und Lokalisierung der Mehrheit der Hefe wird heute Gene entdeckt und in Datenbanken zur Verfügung, die identifizierten Kandidaten Proteine direkt auf bestimmte Fächer verteilt werden können und/oder Wege zu transportieren.
Insgesamt stellt die eingeführten Reporter Assay Methode einen einfachen und robusten Ansatz identifizieren Kandidaten Proteine, die intrazellulären Handel mit Giften oder Toxin-Untereinheiten (z. B.RTA) die Protein Übersetzung in Vivozu blockieren. Relativ geringe Standardabweichungen (1-10 %) sowie die hohe Reproduzierbarkeit in der ursprünglichen Studie bestätigt diese Aussagen. Aufgrund des Formats 96-Well-Platte ist eine schnelle Screening von verschiedenen Hefe durch Mutation entstehende Variationen innerhalb eines Tages nach Toxin Reinigung möglich.
In Zukunft gibt es die Möglichkeit, die Methode für Hochdurchsatz-Screening von Hefe-Löschung-Bibliotheken verwenden. In das aktuelle Setup ist die angewandte RTA-Konzentration (5 µM) in der Lage, die relative GFP Fluoreszenz auf 50 % zu verringern. Unter diesen Bedingungen bietet die Methode den Vorteil um Löschung Mutanten mit negativen (erhöhte GFP Fluoreszenz) und positiv (reduzierte GLP Fluoreszenz) Auswirkungen auf die RTA Transport zu identifizieren. Für Hochdurchsatz-Screenings ist ein stärkerer Unterschied zwischen behandelten und unbehandelten Proben manchmal vorteilhaft. Mit höheren Konzentrationen von RTA und/oder Erhöhung der Maßnahme Intervall (z.B. 48 h), sollte ein noch ausgeprägter Block der GFP Ausdruck erreichbar sein.
Es soll betont werden, dass diese Methode sich nicht nur beschränkt um den Rausch-Prozess der extrazellulären angewandte RTA in der Hefe zu analysieren, aber es auch die Möglichkeit gibt, den ER Import von RTA analysieren, indem Sie mit dem Ausdruck RTA über ein Plasmid in diesem GFP-Reporter-Stamm (Daten nicht angezeigt). Darüber hinaus kann der Screening-Ansatz ebenfalls angepasst werden um intrazelluläre Transportwege von anderen Protein-Biosynthese hemmen Proteine wie Zymocin18 in der Zukunft zu studieren. Im Gegensatz zu den gut charakterisierten Tötung-Modus des Zymocin ist relativ wenig über die Handel Wege verantwortlich für effiziente Toxin Transport in die Zellflüssigkeit19,20bekannt. Dabei stellt Zymocin eine optimale Kandidat für zukünftige Studien wie Zymocin natürlich von Hefezellen aufgegriffen wird. So kann die Entfernung der Zellwand weggelassen werden, das verbessert die Gesamtleistung des GFP-Reporter-Assay (in Bezug auf Zeit und Kosten). Mit Hilfe dieser mächtigen Reporter Assay wäre es möglich, die intrazellulären Transport Strecke(n) von Zymocin in der Hefe zu sezieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Teile dieser Studie wurden freundlicherweise unterstützt durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
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