Summary
O objetivo deste protocolo é mostrar como usar microscopia de folha de luz de rede para visualizar quatro dimensões a dinâmica do receptor de superfície em células vivas. Aqui são mostrados receptores de células T em células CD4+ T primárias.
Abstract
A sinalização e a função de uma célula são ditadas pelas estruturas dinâmicas e interações de seus receptores de superfície. Para realmente entender a relação estrutura-função desses receptores in situ, precisamos visualizá-los e rastreá-los na superfície das células vivas com resolução suficiente spatiotemporal. Aqui mostramos como usar microscopia de folha de luz de rede recém-desenvolvida (LLSM) para imagem de receptores de células T (TCRs) quatro dimensionalmente (4D, espaço e tempo) na membrana celular ao vivo. As células T são uma das principais células effectoras do sistema imunológico adaptativo, e aqui usamos as células T como exemplo para mostrar que a sinalização e a função dessas células são impulsionadas pela dinâmica e interações dos TCRs. O LLSM permite imagens 4D com resolução sem precedentes. Esta técnica de microscopia, portanto, pode ser geralmente aplicada a uma ampla gama de moléculas superficiais ou intracelulares de diferentes células na biologia.
Introduction
A dinâmica precisa do tráfico de moléculas e difusão na superfície celular tridimensional em tempo real têm sido um enigma para resolver. A microscopia sempre foi um equilíbrio de velocidade, sensibilidade e resolução; se qualquer um ou dois forem maximizados, o terceiro é minimizado. Portanto, devido ao pequeno tamanho e imensa velocidade com que os receptores de superfície se movem, o rastreamento de sua dinâmica tem permanecido um grande desafio tecnológico para o campo da biologia celular. Por exemplo, muitos estudos têm sido realizados utilizando a microscopia total de fluorescência interna (TIRF)1,2,3, que tem alta resolução temporal, mas só pode imaginar uma fatia muito fina da membrana t-cell (~100 nm), e, portanto, perde eventos acontecendo mais longe na célula. Essas imagens tirf também mostram apenas uma seção bidimensional da célula. Em contrapartida, técnicas de superresolução, como microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM)4,microscopia de localização fotoativada (PALM)5e microscopia de esgotamento de emissões estimuladas (STED)6, podem superar o limite de difração de luz abbe. Essas técnicas têm alta resolução espacial (~20 nm resolução)4,5,6,7,mas muitas vezes levam muitos minutos para adquirir uma imagem bidimensional completa (2D) ou tridimensional (3D) e, portanto, a resolução temporal é perdida. Além disso, técnicas como STORM e PALM que dependem de sinais piscando podem ter imprecisões na contagemde 8,9. A microscopia eletrônica tem de longe a mais alta resolução (até 50 pm resolução)10; ele pode até ser conduzido tridimensionalmente com microscopia eletrônica de varredura de feixe de íon focada (FIB-SEM), resultando em até 3 nm XY e resolução de 500 nm Z11. No entanto, qualquer forma de microscopia eletrônica requer preparação de amostra gemida severa e só pode ser conduzida com células ou tecidos fixos, eliminando a possibilidade de imagens de amostras vivas ao longo do tempo.
Técnicas para obter a alta resolução spatiotemporal necessária para identificar a dinâmica das moléculas superficiais e intracelulares em células vivas em sua verdadeira natureza 3D fisiológica só estão sendo desenvolvidas recentemente. Uma dessas técnicas é a Microscopia de Folha de Luz de Retta (LLSM)12,que utiliza uma folha de luz estruturada para diminuir drasticamente o fotobranqueamento. Desenvolvido em 2014 pelo ganhador do Nobel Eric Betzig, a alta resolução axial, o baixo fotobranqueamento e o ruído de fundo, e a capacidade de imagem simultânea de centenas de aviões por campo de visão tornam microscópios LLS superiores aos microscópios widefield, TIRF e confocals12,13,14,15,16,17,18,19. Esta técnica de imagem de quatro dimensões (x, y, z e tempo), embora ainda limitada (resolução XYZ de ~200 nm), tem uma incrível resolução temporal (alcançamos uma taxa de quadros de cerca de 100 fps, resultando em uma imagem celular reconstruída em 3D com 0,85 segundos por quadro) para aquisição espacial 3D.
LlSM pode ser geralmente usado para rastrear dinâmicas em tempo real de quaisquer moléculas dentro de qualquer célula no nível de única molécula e unicelular, particularmente aquelas em células altamente mois, como células imunes. Por exemplo, mostramos aqui como usar llsm para visualizar a dinâmica do receptor de células T (TCR). As células T são as células effector do sistema imunológico adaptativo. Os TCRs são responsáveis pelo reconhecimento de ligantes peptídeos-MHC (pMHC) exibidos na superfície das células presentes a antígenos (APC), que determina a seleção, desenvolvimento, diferenciação, destino e função de uma célula T. Esse reconhecimento ocorre na interface entre células T e APCs, resultando em agrupamento de receptores localizados para formar o que é chamado de sinapse imunológica. Embora se saiba que os TCRs na sinapse imunológica são imperativos para a função de efeito t-células, ainda desconhecidos são os mecanismos subjacentes do tráfico de TCR em tempo real para a sinapse. A LLSM nos permitiu visualizar em tempo real a dinâmica dos TCRs antes e depois do tráfico para a sinapse com a interação pMHC-TCR resultante (Figura 1). O LLSM pode, portanto, ser usado para resolver questões atuais da dinâmica formativa dos TCRs e fornecer insights para entender como uma célula distingue entre antígenos eu e estrangeiros.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
5C. C7 TCR-transgênico RAG2 ratos knockout em B10. Um pano de fundo foi utilizado neste estudo de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Chicago.
1. Colher e Ativar células T
NOTA: Esta parte do protocolo é baseada em protocolos anteriores. Veja citações para mais detalhes20,21.
- Eutanize um 5C de 10 a 12 semanas. C7 mouse transgênico de ambos os sexos (~20-25 g) de acordo com o protocolo iACUC aprovado (ou seja, câmara de CO2 seguida de luxação cervical).
- Pulverizar a carcaça do rato com 70% de etanol para absorver a pele e trazer para um armário de segurança BSL-2.
- Vire o rato para o lado direito e faça uma pequena incisão na cavidade corporal com tesoura cirúrgica. Remova o baço usando fórceps cirúrgicos. Corte o tecido conjuntivo conforme necessário com uma tesoura cirúrgica.
- Coloque o baço em um filtro de célula de malha de 70 μm-pore e misture com a parte de trás de um êmbolo de seringa de 1 mL. Lave o filtro com RPMI completo (RPMI com 10% de soro bovino fetal [FBS], 2 mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina, 50 μM 2-mercaptoetanol).
- Centrífuga a suspensão de uma única célula de splenocytes em 300 x g por 5 min. Descarte o supernatante.
NOTA: A pelota neste momento será vermelha. - Resuspender os splenocytes em 5 mL RBC lysis buffer. Incubar por 5 min, depois saciar com 5 mL de RPMI completo.
- Centrífuga a suspensão de uma única célula de splenocytes em 300 x g por 5 min. Descarte o supernatante.
NOTA: A pelota neste momento deve ser branca, não vermelha. - Resuspender a pelota em 5 mL de RPMI completo.
- Transfira para um frasco T-25 e adicione 10 μM de citocromo-C (MCC, sequência ANERADLIAYLKQATK). Coloque as células em uma incubadora de cultura celular a 37 °C, 5% DE CO2 durante a noite.
- No dia seguinte, adicione o mouse recombinante IL-2 a uma concentração final de 100 U/mL.
- Observe para os dias seguintes, adicionando novas mídias à medida que a mídia atual fica amarela. As células T morrerão se deixadas na mídia amarela sem vigilância por mais de 48 h. As células estiverem prontas para usar de 6 a 10 dias após a colheita.
2. Preparar células
- Incubar 5 mm de cobertura redonda com 0,1% poli-L-lysine por 10 min. Aspirar e deixar secar naturalmente.
- Use um reagente gradiente de densidade (ver a Tabela de Materiais) para separar células mortas e obter 1 x 106 células T e 1 x 106 APCs (células CH2721,22 transinduzidas com citosólicom mCherry) separadamente.
NOTA: As células são contadas usando um hemocímetro.- Adicione 3 mL de reagente gradiente de densidade a um tubo cônico de 15 mL e adicione as células em sentido lento à borda do tubo cuidadosamente. Não misture. Centrífuga a 930 x g por 10 min a 4 °C; usar aceleração/desaceleração: LENTO/LENTO. Remova cuidadosamente a fina camada média das células entre a mídia completa e o reagente gradiente de densidade cuidadosamente, colocando cada tipo de célula em tubos cônicos separados.
NOTA: É necessário preparar mais células do que o necessário para a imagem, pois descobrimos que 50% são perdidos em média durante o processo. Quanto mais células usadas para o processo, mais fácil é colhê-las do gradiente de densidade. Usamos 4-8 mL de ambos os tipos de células para garantir o excesso de células. Se desejar, as células podem ser contadas antes desta etapa para garantir o volume necessário. Todas as células extras são colocadas de volta em seus respectivos frascos. - Lave os dois tubos de células T e células CH27 três vezes com 5 mL rpmi completo (300 x g por 5 min). Descarte o supernatante cada vez durante a lavagem. Resuspender cada tubo em 1 mL completo RPMI e contar células por um hemocímetro.
- Adicione 3 mL de reagente gradiente de densidade a um tubo cônico de 15 mL e adicione as células em sentido lento à borda do tubo cuidadosamente. Não misture. Centrífuga a 930 x g por 10 min a 4 °C; usar aceleração/desaceleração: LENTO/LENTO. Remova cuidadosamente a fina camada média das células entre a mídia completa e o reagente gradiente de densidade cuidadosamente, colocando cada tipo de célula em tubos cônicos separados.
- Resuspender 1 x 106 APCs em 500 μL rpmI completo e adicionar 10 μM MCC. Incubar por 3h a 37 °C, 5% CO2. Lave células três vezes com 500 μL rpmi completo (300 x g por 5 min). Descarte os supernatantes.
- Resuspender 1 x 106 células T em 500 μL rpmI completo. Adicione 2 μg de Fab anti-TCRβ Alexa488 rotulado (clone H57) a 500 μL de células. Incubar por 30 min a 37 °C, 5% CO2. Lave células três vezes com 500 μL de RPMI completo (300 x g por 5 min). Descarte supernatant depois de cada lavagem.
NOTA: O anticorpo anti-TCR divalente foi cortado em Fab monovalente usando um kit de preparação fab (veja a Tabela de Materiais) para evitar cruzar os receptores de células T pelo anticorpo divalente (este passo é opcional). - Resuspender ambos os tipos de células em 500 μL de mídia de imagem (fenol vermelho-free Leibovitz's L-15 médio com 10% FBS, 1% penicilina/estreptomia, 2 mM L-glutamina).
3. Conduzindo o alinhamento diário llsm
NOTA: (Importante) Este protocolo de alinhamento é baseado no instrumento LLSM utilizado (consulte a Tabela de Materiais). Cada LLSM pode ser diferente e exigir diferentes estratégias de alinhamento, especialmente aquelas que são construídas em casa. Realize o alinhamento de rotina adequado e continue seção 4.
- Adicione 10 mL de água mais 30 μL fluoresceína (1 mg/mL estoque) ao banho LLSM (~10 mL volume), pressione Image (Home) para mover o objetivo para a posição de imagem e olhar para um único padrão de feixe laser Bessel. Alinhar o raio laser usando as guias e a região de interesse pré-definido (ROI) para tornar o feixe um padrão fino equilibrado em todas as direções.
- O feixe também deve aparecer focado na câmera do localizador. Use dois ajustadores de inclinação do espelho, micrometro superior, foco e coleira objetiva de emissão para ajustar. Veja a Figura 2A,B para vigas corretamente alinhadas.
- Lave o banho e os objetivos com pelo menos 200 mL de água para remover completamente a fluoresceína.
- Contas fluorescentes padrão de imagem na mídia de imagem (preparadas aderindo contas a um deslizamento de cobertura de 5 mm com poli-L-lysine, consulte a Tabela de Materiais; isso pode ser pré-preparado e reutilizado) para a função de propagação de pontos físicos (PSF) em mídia de imagem.
NOTA: Só pode haver uma peça em vista para processamento posterior, então tente encontrar uma peça que esteja sozinha no espectador ou possa ser facilmente cortada para obter uma única peça.- Ligue o dither definindo para 3 na caixa 'X Galvo'. Pressione ao vivo para ver o campo atual. Mova-se ao longo da direção Z para encontrar o deslizamento de tampa e contas. Encontre o centro de uma peça movendo-se ao longo de Z, pressione Pare para pausar o laser. Verifique 3D,pressione o Centro e, em seguida, pressione execute. Isso coletará os dados.
- Ajuste manualmente o espelho de inclinação, a coleira objetiva e o micrometro de foco para os mais altos valores cinzentos, ajuste conforme necessário para obter padrões adequados para varredura objetiva, z galvo, z+objetivo (totPSF) e modos de captura de amostra (samplePSF). Consulte a Figura 2C-F para projeções de intensidade máxima devidamente ajustadas (MIPs).
NOTA: Os vários modos de captura (varredura objetiva, z galvo, z+objetivo e amostragem) alteram a forma como a folha de luz se move através da amostra. Todos os modos de varredura devem ser usados para alinhamento. - A varredura da amostra mostra como os dados serão coletados durante o experimento. Colete a amostra PSF pressionando Execute no modo de varredura de amostras para desdistorção e desconvolução (ver seção 5). Mude os lasers para três modos de cores (488, 560, 647) e pressione execute novamente.
NOTA: Desde as imagens do LLSM em um ângulo (57,2°), as imagens capturadas no modo "varredura de amostra" são coletadas neste ângulo e, portanto, são "distorcidas". Desdistorção é o processo de correção para este ângulo e "realinhar" a imagem a uma verdadeira pilha z. Esses dados devem ser coletados em mídia de imagem e em todos os canais que serão imagens durante o experimento. Se isso não for coletado corretamente, os dados não serão devidamente desviados. Da mesma forma, certifique-se de que a mídia foi aquecida a 37 °C (ou temperatura experimental desejada).
4. Configuração de células com LLSM
- Adicione 100.000 APCs (50 μL) da etapa 2,5 a um deslizamento circular de 5 mm de diâmetro da etapa 2.1 e permita que eles se contentem com 10 min.
- Unte o suporte da amostra e adicione o lado da célula de deslizamento de cobertura a ele. Adicione uma gota de mídia de imagem na parte de trás do deslizamento de cobertura para evitar bolhas antes de colocar no banho. Dane-se o suporte da amostra no piezo e pressione Image (Home).
- Encontre um APC para imagem para garantir que o LLSM e o software de imagem (ver Tabela de Materiais) estejam funcionando corretamente.
NOTA: Nós imagem em 0,4 μm tamanho passo com 60 passos e exposição de 10 ms para duas cores com dither definido para 3, o que resulta em 1,54 s por quadro de imagem 3D com ~200 nm XY e resolução de 400 nm Z. Essas configurações podem precisar ser ajustadas com base no tamanho da célula, resolução z desejada e força de sinal da técnica de rotulagem fluorescente usada. O uso de energia a laser também variará com base na técnica de rotulagem fluorescente usada.- Pressione ao vivo para ver a imagem atual. Mova-se ao longo de Z para encontrar o deslizamento de tampa e células.
- Encontre o centro de um APC movendo-se na direção Z, em seguida, pressione Pare para pausar o laser. Verifique 3D e insira as configurações desejadas (ver passo 4.3.1), pressione o Centro e, em seguida, pressione execute. Isso coletará os dados.
- Abaixe o estágio para carregar a posição e adicione 50 μL de células T em mídia de imagem (100.000 células, a partir da etapa 2.5) em sentido de gota diretamente sobre o deslizamento de cobertura. É melhor deixar uma forma de gota na extremidade da ponta da pipeta e, em seguida, tocar a ponta para o líquido do banho. Levante o palco para trás clicando "Imagem (Retorno)".
- Comece a imagem. Certifique-se de definir o tamanho da pilha desejado e o comprimento do lapso de tempo. Por exemplo, a imagem de 60 z-stacks a um tamanho de passo de 0,4 μm e os prazos de entrada 500. (Normalmente) pare de gravar antes que 500 quadros sejam alcançados para evitar fotobranqueamento. Use o modo Live para procurar pares de células e, quando as configurações prontas e desejadas forem inseridas, pressione execute para coletar dados. Veja o Filme 1 e a Figura 1 por exemplo.
5. Track Surface Dynamics
- Exporte os dados do software de imagem (veja a Tabela de Materiais). Isso criará arquivos TIF z-stack para cada ponto de cada vez em cada cor.
- Primeiro desdistore e desconve os dados.
NOTA: Usamos o gasoduto LLSpy licença pelo Campus18de Pesquisa Janelia da HHMI, mas desdistorção e desconvolução também estão disponíveis dentro de vários softwares de imagem (ver Tabela de Materiais). - Desabranque os dados.
NOTA: Usamos o recurso debleach de Fiji com correspondência de histograma (Fiji Pathway: Image | Ajuste | Correção de Alvejante | Correspondência do Histograma | OK). - Importe no software de rastreamento (veja a Tabela de Materiais). Rastreie clusters de acordo com as especificações do software. Veja o Filme 2 como exemplo.
NOTA: O rastreamento dos resultados dependerá do software de rastreamento usado, algoritmo escolhido, parâmetros de saída desejados selecionados, etc. Por exemplo, no software de rastreamento que utilizamos (veja a Tabela de Materiais),optamos por permitir que o software rastreie formas irregulares, em vez de atribuir cada recurso um único ponto, uma vez que os clusters TCR não são organizados em esferas perfeitas. Além disso, optamos por coletar 35 parâmetros, incluindo velocidade, direção, volume, intensidade, área, localização e informações de duração da faixa. No entanto, diferentes métodos ou parâmetros serão benéficos para responder a diferentes perguntas.- Se o rastreamento não for desejado, use o plugin ClearVolume para Fiji para visualizar e criar filmes a partir de dados de hiperstack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aqui, descrevemos o isolamento, preparação e imagem do mouse primário 5C. Células C7 T usando um microscópio de folha de luz de rede. Durante a seção 3, é imprescindível alinhar o microscópio corretamente, e coletar PSF diariamente com o qual desconvolve os dados após a coleta. Na Figura 2,mostramos as imagens de alinhamento corretas que serão vistas ao alinhar o microscópio. A Figura 2A e a Figura 2B mostram o caminho correto do feixe e o alinhamento do feixe, respectivamente, quando imagens em fluoresceína. O exame objetivo deve mostrar uma grande forma X nas projeções XZ e YZ que é o mais simétrico possível; isso também deve ser ajustado para ser o menor de um X possível (Figura 2C). Isso é conseguido principalmente ajustando a coleira objetiva de emissão. O z galvo scan deve mostrar um oval em XZ e XY com um único ponto em ambos os lados (acima e abaixo para XZ e para a esquerda e para a direita para YZ) (Figura 2D). Isso é conseguido principalmente ajustando a inclinação do espelho galvo, manualmente ou com o ajuste motorizado no software. Por fim, tanto o z+objective scan quanto o escaneado de amostra devem mostrar os indicadores que parecem o mais redondos possível (Figura 2E e Figura 2F, respectivamente). Estes podem ter um Pequeno X, mas isso deve ser o mais escurecido possível. Estes devem estar bem alinhados se o objetivo e z galvo forem bem definidos, mas se forem necessários ajustes, eles serão realizados principalmente com o espelho galvo. É importante ressaltar que durante esse alinhamento, sempre que a coleira e o galvo forem ajustados, o foco (micômetro acima do objetivo de emissão) também precisará ser ajustado.
Usando este protocolo, podemos ver a dinâmica quadridimensional dos TCRs em uma superfície de célula T(Figura 1, Filme 1). A principal vantagem deste microscópio está na capacidade de rastrear as unidades de superfície visualizadas dos TCRs, e obter dados quantificados de seu tamanho, movimento, intensidade de sinal, etc. (ver Tabela de Materiais). O filme 2 mostra um exemplo das faixas obtidas.
Figura 1: imagem 4dimensional da célula T-APC Synapse. (A)Um exemplo representativo de imagens LLSM de lapso de tempo 3D mostrando uma célula T interagindo com um APC. Mostrada estão a dinâmica TCR (verde, rotulada por anti-TCR-AF488) no reconhecimento de antígenos apresentados na superfície de um APC (vermelho, citosolico). Barra de escala = 5 μm. Veja também o Filme 1. (B)Fatia Orthogonal XY de (A). O inset é um quadro de referência de uma célula inteira. Barra de escala = 5 μm. (C)Fatia orthogonal YZ de (A). O inset é um quadro de referência de uma célula inteira. Barra de escala = 5 μm. (D) Fatia dupla ortogonal de (A). O inset é quadro de referência de célula inteira. Barra de escala = 5 μm. Veja também o Filme 3. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Alinhamento LLSM. (A)Padrão de feixe desejado para experimento de imagem LLSM. (B) Captura de tela do processo de alinhamento de feixes; à esquerda é a janela de foco mostrando o feixe estreito e focado; no canto superior direito é um gráfico mostrando que o feixe está centrado dentro da janela; na parte inferior direita está a câmera do localizador, que também deve ser um feixe fino e focado. (C) Projeções de intensidade máxima (MIPs) de uma bead por varredura objetiva. (D) Projeções de intensidade máxima (MIPs) de uma bead por z-galvo scan. (E) Projeções de intensidade máxima (MIPs) de uma bead por z+objective scan. (F) Projeções de intensidade máxima (MIPs) de uma bead por amostragem. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Filme 1: Formação de sinapse de células T. Renderização de volume de duas cores da interação de uma célula T rotulada com αTCR-AF488 (verde) com um APC alvo expressando mCherry citosolic (vermelho) acima de 70 pontos de tempo no intervalo de 1,54 s. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito de baixar.)
Filme 2: Rastreando o movimento dinâmico tcr. Compare com o Filme 1. Clusters correspondentes a estruturas visíveis de TCR foram rastreados em 3D ao longo do tempo com software de imagem. Caudas de dragão mostrando posições de cluster sobre os quatro quadros anteriores são codificadas por cores pelo comprimento de deslocamento. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito de baixar.)
Filme 3: Fatias ortogonais de sinapse de células T. Compare com o Filme 1 e Figura 1B-D. Fatia dupla ortogonal do Filme 1,mostrando que αTCRβ-AF488 Fab está de fato rotulando a superfície celular TCRs. O inset é um quadro de referência de célula inteira. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito de baixar.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O protocolo apresentado foi otimizado para o uso de células CD4+ T isoladas de 5C. Camundongos transgênicos C7 no instrumento LLSM usados e, portanto, outros sistemas celulares e LLSMs podem precisar ser otimizados de forma diferente. No entanto, este protocolo mostra o poder da imagem 4D, pois pode ser usado para quantificar a dinâmica de um receptor de superfície em uma célula inteira com a menor distorção em condições fisiológicas. Portanto, existem muitas aplicações futuras possíveis desta técnica.
Um passo crítico é permitir que as células se instalem em uma concentração apropriada. Se muitos APCs se acomodam no deslizamento de cobertura e se tornam muito densos, é difícil encontrar uma célula T que esteja interagindo com apenas um Único APC. Quando uma célula T tem múltiplas sinapses, o rastreamento e a interpretação dos dados podem se tornar muito complicados. Da mesma forma, se poucos APCs estiverem presentes, encontrar uma célula T formando uma sinapse também é difícil. Em nossas mãos, permitir que 50.000 células se contentem com 10 min alcança uma densidade ideal. No entanto, esse problema pode ser evitado se usar um sistema com células aderentes. As células podem ser cultivadas na incubadora com os coverslips para uma confluência desejada.
Da mesma forma, o número de células T lançadas no sistema depende do tamanho do banho e da distância que podem dispersar. No sistema LLSM utilizado aqui, há um banho de 12 mL e um banho de 2,5 mL, ao contrário da versão anterior do sistema que só tinha um banho de 10 mL disponível. Usamos o banho de 12 mL para a imagem original de fluoresceína e mudamos para o banho de 2,5 mL para imagem das células. Isso permite uma lavagem menos completa do banho após a etapa de visualização do feixe, e também reduz o número de células T necessárias para cada sessão de imagem. Por sua vez, isso permitiria que os usuários utilizassem menos células.
Encontrar células no ponto correto de interação também é um desafio. Em nossas mãos, as células T levam cerca de 2 min para se estabelecer em relação aos APCs no deslizamento de cobertura, por isso é importante começar a procurar o deslizamento de cobertura para células T dinâmicas perto de APCs. Uma grande melhoria disso tem sido a recente adição da luz LED na câmera do localizador. Se usar um sistema caseiro, recomendamos muito incluir esse recurso no design.
Finalmente, estratégias fluorescentes de rotulagem são outra consideração importante. Cada proteína fluorescente ou corante tem um rendimento quântico diferente e taxa de fotobranqueamento. Corantes fluorescentes são tipicamente mais brilhantes, mas se as células foram stabadamente transinduzidas com uma molécula rotulada de proteína fluorescente, o rótulo é reabastecido à medida que a célula continua a produzir a molécula. Portanto, a estratégia de rotulagem é um fator importante a ser considerado ao projetar experimentos.
Gostaríamos de concluir com uma discussão sobre direções futuras para a tecnologia. LlSM também é capaz de microscopia de iluminação estruturada (SIM), que resulta em resolução XY de 150 nm e resolução de 280 nm Z, e é pelo menos 10 vezes mais rápido que o SIM12. Portanto, enquanto a LLSM fornece velocidade sem precedentes de imagem 4D, não pode alcançar a resolução espacial das técnicas atuais de superresolução4,5,6. No entanto, essa resolução poderia ser melhorada se um LLSM STED pudesse ser criado. Foram utilizadas folhas leves STED e esgotamento estimulado de emissões com microscopia de iluminação plana seletiva (STED-SPIM), mas não têm a resolução temporal do LLSM21,22,23,24. Se o STED-SPIM fosse adaptado para incorporar uma rede, poderíamos potencialmente obter resolução axial de 50 nm com muito menos fotobranqueamento e imagem mais rápido do que as técnicas disponíveis atualmente. No entanto, com as tecnologias disponíveis atuais, a LLSM nos dá a resolução temporal mais rápida com alta resolução axial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de reconhecer o conselho e a orientação do Dr. Vytas Bindokas na Universidade de Chicago. Agradecemos ao Centro Integrado de Microscopia Leve da Universidade de Chicago por apoiar e manter o microscópio de folha de luz de rede. Este trabalho foi apoiado pelo NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 e pelo NSF Career Award 1653782 (To J.H.). J.R. é apoiado pelo Programa de Bolsas de Pesquisa de Pós-Graduação da NSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, Chapter 7 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. , Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), New York, N.Y. 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), New York, N.Y. 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
