Summary
La scissione sotto bersagli e tagmentazione (CUT&Tag) è un'efficiente strategia di profilazione epigenomica della cromatina. Questo protocollo presenta una raffinata strategia CUT&Tag per la profilazione delle modificazioni istoniche negli impianti.
Abstract
La regolazione epigenomica a livello cromatico, comprese le modificazioni del DNA e degli istoni, i comportamenti dei fattori di trascrizione e gli RNA non codificanti con le loro proteine reclutate, portano al controllo temporale e spaziale dell'espressione genica. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&Tag) è un metodo di legame enzimatico in cui la proteina cromatina specifica viene prima riconosciuta dal suo anticorpo specifico, e quindi l'anticorpo lega una proteina di fusione A-transposasi (pA-Tn5), che scinde la cromatina mirata in situ dall'attivazione degli ioni magnesio. Qui, forniamo il nostro protocollo CUT&Tag precedentemente pubblicato utilizzando nuclei intatti isolati da foglie di cotone allortetraploid con modifica. Questo protocollo passo-passo può essere utilizzato per la ricerca epigenomica nelle piante. Inoltre, le modifiche sostanziali per l'isolamento dei nuclei vegetali sono fornite con commenti critici.
Introduction
I siti del DNA legante il fattore di trascrizione e la cromatina aperta associata ai segni di modificazione degli istoni svolgono ruoli funzionali critici nella regolazione dell'espressione genica e sono i principali obiettivi della ricerca epigenetica1. Convenzionalmente, il saggio di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) accoppiato con il sequenziamento profondo (ChIP-seq) è stato utilizzato per l'identificazione a livello di genoma di specifici bersagli dell'istone della cromatina o del DNA con proteine specifiche ed è ampiamente adottato nel campo dell'epigenetica2. La tecnologia CUT&Tag (Cleavage under targets and tagmentation) è stata originariamente sviluppata dall'Henikoff Lab per catturare i frammenti di DNA affiliati alle proteine in tutto il genoma5. Rispetto a ChIP, CUT&Tagcan genera librerie di DNA ad alta risoluzione e sfondo eccezionalmente basso utilizzando un piccolo numero di cellule con una procedura semplificata3. Ad oggi, metodi per l'analisi delle regioni della cromatina con specifiche modificazioni istoniche utilizzando CUT&Tag sono stati stabiliti in cellule animali4,5. In particolare, CUT&Tag a singola cellula (scCUT&Tag) è stato sviluppato con successo anche per tessuti e cellule umani6. Tuttavia, a causa della complessità della parete cellulare e dei metaboliti secondari, CUT&Tag è ancora tecnicamente impegnativo per i tessuti vegetali.
In precedenza, abbiamo riportato un protocollo CUT&Tag che utilizza nuclei intatti isolati da foglie di cotone allotetraploidi4. Per dimostrare l'efficienza dell'isolamento dei nuclei e della cattura del DNA utilizzando il tessuto vegetale, la procedura di profilazione è presentata qui. I passaggi principali includono l'isolamento dei nuclei intatti, l'incubazione in situ con l'anticorpo per la modifica della cromatina, l'incubazione della transposasi, l'integrazione dell'adattatore e la preparazione della libreria del DNA. La risoluzione dei problemi si concentra sulla preparazione della libreria CUT&Tag per l'isolamento dei nuclei dell'impianto e il controllo qualità.
In questo studio, presentiamo una raffinata strategia CUT&Tag per le piante. Non solo forniamo un protocollo passo-passo per la profilazione H3K4me3 nelle foglie di cotone, ma forniamo anche una metodologia ottimizzata per l'isolamento dei nuclei vegetali, compresa la strategia per selezionare la concentrazione di detergente per una corretta lisi cellulare e la strategia per filtrare i nuclei. In questo protocollo aggiornato sono inclusi anche passaggi dettagliati con commenti critici.
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Protocol
1. Preparare la trasposasi e le soluzioni stock (Giorno 1)
NOTA: In questa parte, gli adattatori oligonucleotidici sono complessati con trasposasi Tn5 per rendere attiva la transposasi.
- Primer diluiti (primer A, primer B e primer C) a 100 μM di concentrazione utilizzando il tampone di ricottura (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (fare riferimento alla Tabella 1 per le informazioni sulla sequenza dei primer e alla Tabella 2 per le ricette per le soluzioni di lavoro). Conservare a -20 °C fino all'uso.
- Impostare le seguenti due reazioni in tubi PCR: Reazione 1 (adattatore AB), 10 μL di primer A da 100 μM, 10 μL da 100 μM primer B; Reazione 2 (adattatore AC), 10 μL di primer A da 100 μM, 10 di primer C da μL 100 μM.
- Ricottura degli adattatori nella macchina PCR utilizzando il seguente programma: coperchio termico (102 °C), 75 °C per 15 min, 60 °C per 10 min, 50 °C per 10 min, 40 °C per 10 min, 25 °C per 30 min.
NOTA: Gli adattatori sono molecole di DNA parzialmente a doppio filamento (concentrazione = 50 pmol/μL). - Impostare la seguente reazione in un tubo centrifuga da 1,5 mL: 10 μL di trasposasi pA-Tn5 (500 ng/μL o 7,5 pmol/μL), 0,75 μL di adattatore AB (50 pmol/μL), 0,75 μL di adattatore AC (50 pmol/μL), 7 μL di buffer di accoppiamento. Pipettare 20x delicatamente per mescolare bene e incubare a 30 °C a bagnomaria per 1 ora. Concentrazione finale di transposasi = 4 pmol/μL. Conservare a -20 °C fino all'uso.
NOTA: Rapporto molare dell'adattatore AB: adattatore AC: transposasi = 0,5:0,5:1. - Preparare le soluzioni stock secondo le ricette fornite nella Tabella 2 e in autoclave o filtrare le soluzioni stock per sterilizzare.
- Autoclave e sterilizzare forbici, carta da filtro, un setaccio in acciaio inossidabile, un mortaio, pestelli, ecc.
2. Isolamento dei nuclei (Giorno 2)
- Pre-raffreddare la centrifuga a 4 °C. Per ogni 1 g di materia prima (foglie di cotone), preparare 25 mL di tampone di isolamento nucleare A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL di tampone di isolamento nucleare B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL di tampone di lavaggio nucleare (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidina, cocktail inibitore della proteasi 0,1%), 1 mL di tampone anticorpale (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidina, 1 mg/mL BSA, cocktail inibitore della proteasi 0,1%, 0,05% p/v digitonina). Lasciare riposare i tubi sul ghiaccio fino all'uso.
- Macinare le foglie fresche (~1 g) in azoto liquido in polvere fine e trasferirle in un tubo da 50 ml contenente 25 mL di tampone di isolamento nucleare refrigerato A.
- Mescolare delicatamente la soluzione tampone e incubare il tubo su ghiaccio per 5 minuti con un leggero scuotimento per disperdere il materiale in modo uniforme.
- Centrifugare per 5 min a 500 rcf a 4 °C per formare il pellet cellulare.
- Decantare il surnatante e risospesare il pellet con 20 ml di tampone di isolamento nucleare refrigerato B integrato con 0,5% Triton X-100. Capovolgere delicatamente il tubo per risospescere completamente il pellet.
NOTA: il tampone di isolamento nucleare B da 20 ml è applicabile per 1 g di materiale di partenza e questo volume può essere scalato di conseguenza.- Eseguire un test pilota per testare l'effetto della concentrazione in serie di Triton X-100 (ad esempio, 2 mL di tampone di isolamento nucleare B, ciascuno con 0,1%, 0,25%, 0,5% e 1% Triton X-100 per 100 mg di tessuti macinati). La concentrazione appropriata di Triton X-100 è indicata da un accumulo di nuclei bianchi/grigi nella parte inferiore e da un surnatante verde scuro dopo lisi e centrifugazione a bassa velocità (< 500 rcf per 4 min).
- Filtrare il lisato cellulare risultante con una combinazione di due setacci: un setaccio a 500 maglie sulla parte superiore per rimuovere i detriti di tessuto più grandi e un setaccio a 1000 maglie sul fondo per raccogliere i nuclei.
NOTA: scegliere una dimensione di maglia appropriata per i setacci in base alla dimensione dei nuclei delle piante. - Utilizzare carta da filtro sterile sul retro del setaccio per assorbire i detriti di piccole cellule nel lisato.
- Trasferire i restanti nuclei contenenti lisato sul lato superiore del setaccio a 1000 maglie in quattro tubi centrifughi freschi da 1,5 ml.
- Centrifugare per 4 min a 300 rcf a 4 °C per raccogliere i nuclei.
- Rimuovere il più possibile il surnatante usando una punta a pipetta e lavare il pellet con tampone di lavaggio nucleare.
- Aggiungere 800 μL del tampone di lavaggio nucleare e invertire delicatamente i tubi per risospescere il pellet. Ruotare nuovamente il tubo per 4 minuti a 300 rcf a 4 °C.
- Eseguire un totale di 3 lavaggi.
- (Facoltativo) Immagine dei nuclei al microscopio per la colorazione DAPI.
- Trasferire 100 μL di sospensione di nuclei nel tampone di lavaggio nucleare dalla fase 2.11. ad un nuovo tubo da 1,5 ml. Aggiungere 900 μL di tampone di lavaggio nucleare e 2 μL di soluzione madre DAPI (1 mg/mL) per ottenere una concentrazione finale di lavoro di 2 μg/mL per DAPI. Incubare il tubo al buio per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo la colorazione, centrifugare per 4 minuti a 300 rcf a 4 °C per raccogliere i nuclei.
- Rimuovere il più possibile il surnatante usando una punta della pipetta. Lavare 3 volte con 800 μL del tampone di lavaggio nucleare.
- Rimuovere il più possibile il surnatante e risospescere i nuclei con 100 μL di tampone di lavaggio nucleare.
- Immagine dei nuclei al microscopio a fluorescenza utilizzando il canale DAPI.
- Combinare i nuclei di due tubi (~ 50 μL di nuclei in volume in ciascun tubo da 1,5 ml). Centrifuga per 4 min a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il più possibile il buffer rimanente utilizzando una punta della pipetta.
3. Incubazione degli anticorpi
- Risospesso ogni 50 μL di nuclei in un tubo da 1,5 mL con 1 mL di tampone anticorpale.
- Impostare le seguenti reazioni in tubi da 1,5 mL: due repliche biologiche di gruppi di controllo IgG con 150 μL di nuclei (~ 1 μg di cromatina) e 2 μL di IgG (1 mg/mL) in ciascun tubo, due repliche biologiche di gruppi di saggio H3K4me3 con 150 μL di nuclei e 2 μL di anticorpo anti-H3K4me3 (1 mg/mL) in ciascun tubo.
- Mescolare delicatamente la soluzione e lasciare i tubi su uno shaker orizzontale per l'ibridazione durante la notte a 4 °C e 12 giri/min.
- Pre-raffreddare la centrifuga a 4 °C. Preparare 50 mL di tampone di lavaggio immunoprecipitazione (IP) fresco (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidina, cocktail inibitore della proteasi 0,1%, 0,05% p/v digitonina) in un tubo centrifugo da 50 mL. Lasciare che il tubo si sieda sul ghiaccio.
- Centrifugare i tubi per 4 min a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il tampone anticorpale da ciascun tubo.
- Aggiungere 800 μL di tampone di lavaggio IP a ciascun tubo e mescolare delicatamente. Lasciare i tubi su uno shaker orizzontale per 5 minuti a temperatura ambiente e 12 giri / min.
- Dopo il lavaggio, centrifugare i tubi per 4 minuti a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il surnatante usando una punta della pipetta.
NOTA: Per evitare qualsiasi disturbo del pellet di nuclei, lasciare ~ 50-80 μL del tampone con i nuclei. - Ripetere i passaggi 3.6.-3.7. altre due volte.
- Dopo il terzo lavaggio, centrifugare per 2 minuti a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il buffer rimanente il più possibile.
4. Incubazione della trasposasi
- Produrre fresco 1 mL di tampone di incubazione della transposasi (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidina, cocktail inibitore della proteasi 0,1%, 0,05% p/v digitonina) mescolando 1 mL del tampone di lavaggio IP con 30 μL di 5 M NaCl.
- Per preparare la miscela di trasposasi Tn5 per l'incubazione, aggiungere 1 μL di transposasi a ciascun 150 μL del tampone di incubazione della transposasi.
NOTA: Preparare prima la miscela di soluzione di transposasi in base al numero di reazioni, quindi aggiungere un'aliquota di 150 μL a ciascun tubo. - Risospese i nuclei con 150 μL di soluzione di trasposasi.
- Lasciare i tubi su uno shaker orizzontale a 12 giri / min per 2-3 ore a temperatura ambiente e mescolare ogni 10-15 minuti.
- Dopo l'incubazione della trasposasi, centrifugare i tubi per 4 minuti a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il tampone di incubazione della transposasi in ogni tubo.
- Lavare i tubi con tampone di lavaggio IP. Per fare ciò, aggiungere 800 μL di tampone di lavaggio IP a ciascun tubo, mescolare delicatamente e lasciare i tubi su uno shaker orizzontale a 12 giri / min per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifuga per 4 min a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il surnatante usando una punta della pipetta.
- Ripetere i passaggi 4.6.-4.7. altre due volte.
- Dopo il terzo lavaggio, centrifugare per 2 minuti a 300 rcf a 4 °C. Rimuovere il buffer rimanente il più possibile.
5. Tagmentazione
- Preparare appena 2 mL del tampone di tagmentazione (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidina, cocktail inibitore della proteasi 0,1%, 10 mM MgCl2, 0,05% p/v digitonina) mescolando 2 mL di tampone di lavaggio IP con 60 μL di 5 M NaCl e 20 μL di 1 M MgCl2.
- Risospendare i nuclei con 300 μL di tampone di tagmentazione.
- Mescolare la soluzione e incubare a bagnomaria a 37 °C per 1 ora per la tagmentazione.
- Interrompere la tagmentazione con 10 μL di 0,5 M EDTA (concentrazione finale ~15 mM) e 30 μL di SDS al 10% (concentrazione finale 1%).
6. Estrazione del DNA e costruzione della libreria NGS
- Aggiungere 300 μL di tampone di estrazione del DNA CTAB come descritto7. Incubare i tubi a bagnomaria a 65 °C per 30 min. Invertire per mescolare ogni ~ 10 min.
- Aggiungere 600 μL di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1) a ciascun tubo. Mescolare accuratamente.
- Pre-centrifugare i tubi gel di blocco di fase per 2 minuti a 13.000 rcf a 4 °C. Trasferire la soluzione di cui sopra in tubi gel a blocco di fase.
- Centrifuga per 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.
- Trasferire il surnatante (~600 μL) in un nuovo tubo da 1,5 mL.
- Aggiungere 600 μL di cloroformio a ciascun tubo. Mescolare accuratamente.
- Centrifuga per 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.
- Trasferire il surnatante (~600 μL) in un nuovo tubo da 1,5 ml.
- Aggiungere 12 μL di etanolo al 100% e 2 μL di GlycoBlue Coprecipitant. Mescolare accuratamente e conservare a -20 °C per 1 ora.
- Centrifuga per 10 min a 13.000 rcf a 4 °C.
- Decantare il surnatante. Lavare il pellet di DNA utilizzando etanolo al 75% (v/v) e centrifugare per 5 minuti a 13.000 rcf a 4 °C.
- Decantare il surnatante. Asciugare all'aria il pellet di DNA e risospesciare il DNA in 25 μL di ddH2O.
- Impostare la reazione PCR come segue. Per un totale di 50 μL di reazione, aggiungere 24 μL di DNA, 11 μL di ddH2O, 10 μL di 5x tampone TAE, 2 μL di primer P5 (10 μM), 2 μL di primer P7 (10 μM) e 1 μL di Enzima TruePrep Amplify. Programma PCR: 72 °C per 3 min, 98 °C per 30 s; poi 14 cicli di 98 °C per 30 s, 60 °C per 30 s e 72 °C per 30 s, seguiti da 72 °C per 5 min.
NOTA: i primi 72 °C per 3 minuti per estensione non possono essere saltati. La sovraesplorazione della libreria porterà ad un alto livello di duplicati PCR nell'NGS. Iniziare da 12-14 cicli di PCR nella reazione PCR per H3K4me3 quando si utilizza ~ 1 μg di cromatina in ogni reazione. - Caricare 2 μL dei prodotti PCR su gel di agarosio all'1,5% per elettroforesi.
- Purificare i prodotti PCR utilizzando perline magnetiche commerciali per la purificazione del DNA.
- Quantificare la libreria con un fluorometro e l'elettroforesi su gel di agarosio.
NOTA: la concentrazione effettiva della libreria deve essere >2 nM da qPCR per garantire una buona qualità. - Esegui il sequenziamento di nuova generazione (NGS) e l'analisi dei dati.
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Representative Results
Nella Figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro CUT&Tag. La Figura 2 mostra la colorazione DAPI dei nuclei intatti. L'obiettivo della fase di "isolamento dei nuclei" era quello di ottenere i nuclei intatti in una quantità sufficiente per la successiva reazione CUT&Tag. La Figura 3 mostra l'elettroforesi su gel di agarosio dei prodotti PCR. Il controllo negativo IgG è richiesto in parallelo durante la configurazione dell'esperimento. Rispetto al gruppo di controllo IgG, la maggior parte dei frammenti di DNA estratti con il campione di anticorpi H3K4me3 variava da ~ 280 a 500 coppie di basi. La Figura 4 mostra il sequenziamento di nuova generazione risultante per l'anticorpo anti-H3K4me3 rispetto ai gruppi di controllo IgG negativi.
Figura 1: Il flusso di lavoro di CUT&Tag. Questa cifra è modificata da Tao et al.4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Colorazione DAPI di nuclei intatti isolati da foglie di cotone. Barra della scala = 20 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Elettroforesi su gel di agarosio di 2 μL di prodotti PCR. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Screenshot IGV rappresentativo per i segnali H3K4me3. (A) Panoramica IGV rappresentativa dei segnali CUT&Tag in una vasta regione del genoma. ~ 1500 kb le regioni del genoma sono state selezionate in modo casuale. (B) Lo screenshot IGV rappresentativo per geni con vari livelli di espressione ha mostrato un'alta risoluzione dei segnali CUT&Tag. Sono stati utilizzati i file bigWig normalizzati generati da bamCompare confrontando il file bam di trattamento (reazione CUT&Tag anti-H3K4me3) e il file bam di controllo (IgG). TPM, trascrizioni per kilobase di modello esone per milione di letture mappate. Questa figura è modificata da Tao et al.4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Sequenze di primer. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Buffer e ricette di soluzione. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Qui abbiamo descritto CUT&Tag, una tecnologia per la generazione di librerie di DNA ad alta risoluzione e background eccezionalmente basso utilizzando un piccolo numero di cellule con una procedura semplificata rispetto all'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Il nostro successo con la profilatura H3K4me3 nelle foglie di cotone suggerisce che CUT&Tag, che è stato inizialmente progettato per le cellule animali, può essere utilizzato anche per le cellule vegetali. Sia il sistema tampone Tris comunemente usato per il test ChIP8 che il sistema tampone HEPES utilizzato per cut&Tag animale funzionano per CUT&Tag utilizzando nuclei vegetali4,9. L'isolamento dei nuclei vegetali intatti è il passo fondamentale per il successo dell'applicazione di CUT&Tag negli impianti. Nella metodologia precedentemente riportata per l'isolamento dei nuclei4, la soluzione di tessuti macinati è stata filtrata attraverso due strati di Miracloth prima della lisi cellulare. Abbiamo trovato l'efficienza di ottenere nuclei adeguati ridotti quando si utilizzano foglie relativamente invecchiate (ad esempio, foglie di piante di cotone di 2 mesi) e fibre di cotone (ad esempio, fibra 20-DPA) perché Miracloth conserva la maggior parte dei tessuti macinati. In questo protocollo video, l'isolamento dei nuclei vegetali è stato ottimizzato filtrando il lisato cellulare attraverso un setaccio in acciaio inossidabile a 500 maglie (20 μM di dimensioni dei pori). Questa operazione alterata ha migliorato significativamente l'efficienza della rimozione di detriti tissutali più grandi e dell'ottenimento di nuclei adeguati per la reazione successiva.
Dopo la PCR per la costruzione della libreria (Step 6.13.), i frammenti di DNA possono essere purificati e quindi profilati da NGS. Tuttavia, se il gruppo di controllo IgG raffigura anche un arricchimento in piccoli frammenti, indica un forte background di taglio casuale del DNA mediante transposasi, che può essere causato da nuclei danneggiati o lavaggio insufficiente per la rimozione di anticorpi non legati o transposasi. In questo caso, i campioni paralleli per anticorpi specifici non sono stati raccomandati per ulteriori NGS.
Recentemente, CUT&Tag a singola cellula adattando la piattaforma ATAC-seq a singola cellula 10x Genomics basata su goccioline è stata sviluppata e applicata nella profilazione delle modificazioni istoniche H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac e H3K36me3. In uno studio sull'occupazione della cromatina del fattore di trascrizione OLIG2, il componente complesso della coesina RAD21 nel cervello del topo ha fornito informazioni uniche sui paesaggi epigenomici nel sistema nervoso centrale6. Pertanto, CUT&Tag può essere applicato per esaminare i paesaggi epigenomici sia per la modifica degli istoni di massa che per i TF specifici con bassi requisiti di input9, anche a livello di singola cella6. Queste applicazioni di CUT&Tag indicano che lo studio della regolazione epigenetica delle piante nel coordinare le reti funzionali geniche durante le dinamiche di sviluppo e le risposte ambientali può essere preciso nel modello temporale e spaziale.
CUT&Tag è un metodo ancora in fase di sviluppo con problemi che devono essere affrontati. Per i fattori di trascrizione che non sono espressi in abbondanza o sono debolmente, transitoriamente o indirettamente legati alla cromatina10, le differenze tra nuclei reticolati e nativi in CUT&Tag devono essere confrontate. La strategia CUT&Tag per la profilazione con fattori di trascrizione a bassa abbondanza è ancora tecnicamente impegnativa. Inoltre, a causa della limitata disponibilità di epitopi proteici, la maggior parte degli anticorpi ChIP convalidati per funzionare con condizioni di reticolazione potrebbero non funzionare bene con le condizioni native in CUT&Tag; la sensibilità e la specificità degli anticorpi devono essere convalidate. Inoltre, la trasposasi Tn5 utilizzata in CUT&Tag ha un'elevata affinità con le regioni a cromatina aperta11, quindi CUT&Tag potrebbe introdurre pregiudizi, che devono anche essere affrontati in studi futuri.
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Disclosures
Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse con alcuna società che commercia uno dei prodotti sopra menzionati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente in parte da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) e Fundamental Research Funds for the Central Universities, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) e JCIC-MCP project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
References
- Abascal, F., et al.
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
