Summary
Qui, presentiamo un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo ad alta purezza dai topi dopo 7 giorni di coltura con 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.
Abstract
La domanda di cellule dendritiche (DC) sta gradualmente aumentando con l'avanzare della ricerca immunologica. Tuttavia, le DC sono rare in tutti i tessuti. Il metodo tradizionale per isolare le DC prevede principalmente l'induzione della differenziazione del midollo osseo (BM) nelle DC iniettando grandi dosi (>10 ng / mL) di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi / interleuchina-4 (GM-CSF / IL-4), rendendo la procedura complessa e costosa. In questo protocollo, utilizzando tutte le cellule BM coltivate in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4, dopo 3-4 scambi di semicoltura, sono state raccolte fino a 2,7 x 107 cellule CD11c+ (DC) per topo (due femori) con una purezza dell'80%-95%. Dopo 10 giorni in coltura, l'espressione di CD11c, CD80 e MHC II è aumentata, mentre il numero di cellule è diminuito. Il numero di cellule ha raggiunto il picco dopo 7 giorni di coltura. Inoltre, questo metodo ha richiesto solo 10 minuti per raccogliere tutte le cellule del midollo osseo e un numero elevato di DC è stato ottenuto dopo 1 settimana di coltura.
Introduction
Le cellule dendritiche (DC) sono le più potenti cellule che presentano l'antigene (APC) per attivare le cellule T naïve e indurre risposte specifiche dei linfociti T citotossici (CTL) contro malattie infettive, malattie allergiche e cellule tumorali 1,2,3. Le DC sono il collegamento primario tra immunità innata e immunità adattativa e svolgono un ruolo essenziale nella difesa immunologica e nel mantenimento della tolleranza immunitaria. Negli ultimi 40 anni, molti ricercatori hanno cercato di definire i sottoinsiemi di DC e le loro funzioni nell'infiammazione e nell'immunità. Secondo questi studi, le DC si sviluppano lungo le linee mieloidi e linfoidi dalle cellule del midollo osseo. I vaccini contro i tumori hanno raggiunto traguardi significativi negli ultimi anni e hanno un futuro promettente. Meccanicamente, i vaccini tumorali modulano la risposta immunitaria e prevengono la crescita tumorale attivando i linfociti T citotossici utilizzando antigeni tumorali. Il vaccino a base di DC svolge un ruolo importante nell'immunoterapia tumorale ed è stato identificato come una delle terapie antitumorali più promettenti 1,4. Inoltre, i DC sono stati ampiamente utilizzati nella sperimentazione di nuovi farmaci a bersaglio molecolare e inibitori del checkpoint immunitario5.
I ricercatori hanno urgente bisogno di un numero elevato di DC ad alta purezza per studiare ulteriormente il ruolo dei DC. Tuttavia, le DC sono rare in vari tessuti e sangue, rappresentando solo l'1% delle cellule del sangue negli esseri umani e negli animali. La coltura in vitro di cellule dendritiche del midollo osseo (BMDC) è un metodo importante per ottenere grandi quantità di cellule DC. Nel frattempo, il protocollo Lutz per la generazione di DC dal midollo osseo è stato ampiamente utilizzato dai ricercatori6. Sebbene il protocollo sia efficace nell'ottenere cellule DC, è complesso e costoso, comportando l'aggiunta di alte concentrazioni di citochine e la lisi dei globuli rossi.
In questo studio, riportiamo un metodo per isolare quasi tutte le cellule del midollo osseo dal midollo osseo di topo (BM) e indurre la differenziazione in BMDC dopo 7-9 giorni di incubazione in vitro, con una concentrazione inferiore di GM-CSF e IL-4. Questa procedura richiede solo 10 minuti per raccogliere quasi tutte le cellule del midollo osseo e per sospenderle in un mezzo completo. In breve, forniamo un metodo di coltivazione efficiente ed economico per BMDC in questa ricerca.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università medica di Nanchino.
1. Isolamento del midollo osseo e preparazione delle cellule BM
- Sacrificare topi C57BL/6 (18-22 g, 6-8 settimane) tramite asfissia di CO2 . Fissare il mouse sul tavolo operatorio del mouse. Disinfettare le superfici con il 70% di etanolo.
- Tagliare la pelle della gamba per esporre i muscoli e l'arteria femorale. Blocca e strappa l'arteria femorale usando due pinze, quindi tira l'estremità prossimale verso l'addome.
NOTA: Non tagliare direttamente l'arteria femorale. Altrimenti, causerà sanguinamento eccessivo e contaminerà il campo visivo. - Taglia tutti i muscoli intorno al femore.
- Allungare lentamente gli arti inferiori del topo verso l'esterno fino a quando non si sente il suono della lussazione dell'articolazione dell'anca e il prolasso della testa del femore è visibile.
- Separare gli arti inferiori dal corpo usando le forbici lungo l'interno della testa del femore.
- Tagliare le zampe posteriori dall'estremità dell'articolazione del ginocchio per ottenere un femore libero e completo.
- Rimuovere i muscoli attaccati al femore usando una garza.
NOTA: Non strappare direttamente i muscoli. Il femore dei topi è delicato, la sua integrità deve essere mantenuta. - Immergere il femore in alcool al 75% per 2-5 minuti.
2. Cultura di induzione della BMDC
- Risciacquare l'alcol residuo con PBS. Utilizzare una pinza emostatica per bloccare la parte centrale e inferiore del femore e un altro set per bloccare l'estremità inferiore del femore. Le pinze emostatiche vengono applicate lateralmente al femore e il femore viene separato dalla linea epifisaria.
NOTA: La linea epifisaria non è facilmente visibile fino a quando il femore non si frattura. Questo e i passaggi successivi vengono tutti eseguiti in un ambiente sterile. - Utilizzare una siringa da 1 mL (ago: 0,6 mm x 25 mm) per penetrare nella cavità del midollo osseo dalla rottura della linea epifisaria e ruotare l'ago per penetrare nella testa del femore e attraverso la cavità del midollo osseo. Pulsare e lavare la cavità del midollo osseo utilizzando 1 mL del mezzo completo contenente GM-CSF / IL-4 fino a quando l'osso diventa bianco.
NOTA: terreno di coltura completo: 10% FBS, 1% penicillina-streptomicina, 55 μM β-mercaptoetanolo, 10 ng/ mL GM-CSF e 10 ng / mL IL-4. - Sospendere tutte le cellule in 24 mL di terreno di coltura completo (~5 x 105 cellule/mL). Dopo la miscelazione, tutto il mezzo è stato seminato su una piastra a 6 pozzetti con 4 ml / pozzetto, quindi incubato a 37 ° C con il 5% di CO2 per 2 giorni.
NOTA: Non è necessario lisare gli eritrociti. - Sostituire tutto il mezzo dopo 2 giorni con un mezzo contenente GM-CSF/IL-47. Al quarto, sesto e ottavo giorno, sostituire metà del mezzo con il mezzo completo contenente 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.
NOTA: In questa fase, le cellule sospese come eritrociti e linfociti vengono rimosse. - Scatta foto ogni giorno per registrare la crescita cellulare. A partire dal sesto giorno, raccogliere un pozzetto di cellule al giorno per contare il numero di cellule e rilevare l'espressione di CD11c, CD80 e MHC II 6,7.
3. Rilevazione citometrica a flusso dell'espressione di CD11c, CD80 e MHC II
- Dopo aver lavato i DC con PBS, risospendere 1 x 106 cellule in 100 μL di tampone FACS, aggiungere 0,5 μg di anticorpo CD16/32 anti-topo e incubare per 10 minuti sul ghiaccio per bloccare siti di antigene non specifici.
- Aggiungere 1 μg di Percp/cy5.5-CD11c, 0,5 μg di PE-CD80 e 0,04 μg di anticorpi APC-MHC II e incubare sul ghiaccio per 30 min.
- Centrifugare a 1.000 x g per 3 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4%, fissare per 30 minuti a 4 °C e sospendere in 300 μL di tampone FACS.
- Eseguire la citometria a flusso.
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Representative Results
Le cellule 1 x 10 7-1,7 x 107 sono state estratte da due femori e sono state nuovamente sospese in 24 ml di terreno prima di essere piantate in una piastra a 6 pozzetti (Figura 1A). Dopo 2 giorni, le cellule non aderenti sono state rimosse cambiando completamente il terreno di coltura. Prima di cambiare il mezzo, è stato osservato un numero significativo di cellule sospese (Figura 1B). Dopo 3 giorni di coltura, iniziarono a formarsi colonie di piccole cellule. Il sesto giorno, le dimensioni e il numero di colonie sono aumentati in modo significativo. Il settimo giorno, il numero di cellule ha raggiunto il picco (22 x 106-27 x 106) e poi è diminuito gradualmente (Figura 2A). La superficie delle cellule DC è diventata ruvida con pseudopodi più lunghi, mostrando la tipica morfologia delle cellule DC mature (Figura 2B). L'analisi citometrica a flusso ha mostrato che il rapporto tra CD11c positive e cellule totali era del 71% il sesto giorno, mentre il rapporto è aumentato al 96,1% il decimo giorno (Figura 2C,2D).
Per valutare l'espressione di molecole co-stimolatorie, CD11c, CD80 e MHC II sono stati co-colorati8. Come mostrato nella Figura 3A, l'espressione di CD11c, CD80 e MHC II è aumentata gradualmente con l'aumentare del tempo di coltivazione dal giorno 6 al giorno 10. Inoltre, l'analisi citometrica a flusso ha mostrato un graduale aumento delle proporzioni di cellule CD11c e CD80 double-positive, CD11c e MHCII double-positive (Figura 3B,3D) e triple-positive (Figura 3C,3D).
Figura 1: Immagini rappresentative di DC in diversi momenti di coltura. (A) Diagramma di flusso della coltivazione di BMDC. (B) Immagini rappresentative di DC in diversi momenti di cultura. Le cellule del midollo osseo sono state sospese in 24 mL di terreno di coltura con 10 ng/mL GM-CSF e IL-4 e seminate in una piastra a 6 pozzetti. BF, prima di cambiare terreno di coltura; AF, dopo aver cambiato mezzo di coltura. Freccia rossa, colonia DC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il numero e la purezza delle DC in diversi momenti di coltura. (A) Numero totale di cellule in tutti i terreni di coltura. (B) Immagini rappresentative dei DC. (C,D) Rappresentazione citometrica e grafica a flusso dell'analisi della proporzione di DC. Le cellule positive sono state ordinate per CD11c. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'espressione di molecole co-stimolatorie nelle DC. (A) L'espressione di CD11c, CD80 e MHC ΙΙ nelle DC. (B) Analisi citometrica a flusso della proporzione di cellule CD11c e CD80 double-positive, CD11c e MHC ΙΙ double-positive e triple-positive. (C, D) Analisi citometrica a flusso dal giorno 6 al giorno 10 e rappresentazione grafica per mostrare l'analisi statistica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli esseri umani e i topi hanno diversi sottoinsiemi dc, tra cui DC classici (cDC, inclusi cDC1 e cDC2s), DC plasmacitoidi (pDC) e DC derivati da monociti (MoDC)9,10,11. È generalmente accettato che i cDC1 regolano le risposte dei linfociti T citotossici (CTL) ai patogeni intracellulari e al cancro e i cDC2 regolano le risposte immunitarie a patogeni extracellulari, parassiti e allergeni12. Un numero significativo di DC può essere prodotto in vitro da cellule progenitrici BM in topi in presenza di GM-CSF e IL-4 6,13,14. La purezza e la quantità di DC svolgono un ruolo chiave nel successo dell'immunoterapia DC. I ricercatori hanno dimostrato che due dosi di 1 x 105 a 1 x 106 DC potrebbero suscitare risposte citotossiche efficienti dei linfociti T (CTL) in un modello di xenotrapianto 15,16,17,18. Ciò implica che è necessario coltivare un numero elevato di DC ad alta purezza per studiare ulteriormente il ruolo dei DC nell'immunoterapia tumorale.
Il metodo tradizionale per ottenere le cellule del midollo osseo è quello di tagliare le due estremità del femore e risciacquare con il mezzo 6,7. In questo studio, abbiamo utilizzato in modo innovativo strutture anatomiche fisiologiche per recidere il femore. Le pinze emostatiche sono state utilizzate per bloccare l'estremità inferiore del femore e spostarla lateralmente. La linea epifisaria è fisiologicamente debole, rendendoli suscettibili alle fratture quando stressati19. Dopo che il femore è stato separato dalla linea epifisaria, una piccola quantità di osso rimane nella cavità del midollo. L'ago può facilmente penetrare l'osso nella cavità del midollo osseo. Il metodo è semplice da usare, protegge preziose cellule del midollo osseo e fornisce una base cellulare per la coltura di un numero elevato di DC. Abbiamo coltivato i DC utilizzando una combinazione di 10 ng /mL GM-CSF e 10 ng/mL IL-4, che contribuisce maggiormente alla maturazione dei DC rispetto al solo GM-CSF. Labeur e Son hanno riferito che l'uso combinato di GM-CSF e IL-4 nel mezzo delle DC ha indotto una maggiore espressione di marcatori di maturazione, come IFN-ɣ, TNF-α e IL-6, e una maggiore capacità di presentazione dell'antigene 7,20,21. Son et al. hanno anche proposto che la combinazione di GM-CSF e IL-4 promuova la maturazione delle DC 7,21.
In questo studio, abbiamo coltivato direttamente le cellule del midollo osseo raccolte senza lisare gli eritrociti e le abbiamo separate mediante centrifugazione a gradiente, che può comportare la perdita di cellule e, in definitiva, una riduzione delle DC raccolte. Prima che il mezzo fosse cambiato, c'erano diverse cellule sospese nel sistema di coltura, tra cui eritrociti, cellule T, cellule B e granulociti. Durante la co-coltura, queste cellule possono produrre citochine per promuovere la maturazione delle DC.
In termini di limitazioni, questo protocollo ha utilizzato solo due femori del topo, escluse le tibie più piccole, con conseguente perdita di alcune cellule staminali mesenchimali. In breve, abbiamo sviluppato un protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la generazione di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo dai topi, che richiede solo 10 minuti per separare le cellule del midollo osseo. Un gran numero di DC ad alta purezza sono stati raccolti dopo 6 giorni a 7 giorni di incubazione con 10 ng / mL di GM-CSF e IL-4.
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Disclosures
Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse e di non avere nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 e TJWJ202021QN034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
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