Summary
यहां, हम 10 एनजी / एमएल जीएम-सीएसएफ / आईएल -4 के साथ संस्कृति के 7 दिनों के बाद चूहों से उच्च-शुद्धता अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं को अलग करने और उत्पन्न करने के लिए एक किफायती और कुशल विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) की मांग धीरे-धीरे बढ़ रही है क्योंकि इम्यूनोलॉजी अनुसंधान प्रगति करता है। हालांकि, डीसी सभी ऊतकों में दुर्लभ हैं। डीसी को अलग करने के लिए पारंपरिक विधि में मुख्य रूप से ग्रैनुलोसाइट्स-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक / इंटरल्यूकिन -4 (जीएम-सीएसएफ / आईएल -4) की बड़ी खुराक (>10 एनजी / एमएल) को इंजेक्ट करके डीसी में अस्थि मज्जा (बीएम) भेदभाव को प्रेरित करना शामिल है, जिससे प्रक्रिया जटिल और महंगी हो जाती है। इस प्रोटोकॉल में, 10 एनजी / एमएल जीएम-सीएसएफ / आईएल -4 माध्यम में सुसंस्कृत सभी बीएम कोशिकाओं का उपयोग करके, 3-4 अर्ध-संस्कृति एक्सचेंजों के बाद, 2.7 x 107 सीडी 11 सी + कोशिकाओं (डीसी) प्रति माउस (दो फीमर) तक 80% -95% की शुद्धता के साथ काटा गया था। संस्कृति में 10 दिनों के बाद, CD11c, CD80 और MHC II की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई, जबकि कोशिकाओं की संख्या में कमी आई। 7 दिनों की संस्कृति के बाद कोशिकाओं की संख्या चरम पर पहुंच गई। इसके अलावा, इस विधि को सभी अस्थि मज्जा कोशिकाओं की कटाई के लिए केवल 10 मिनट लगे, और संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद डीसी की एक उच्च संख्या प्राप्त की गई।
Introduction
डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी) भोले टी कोशिकाओं को सक्रिय करने और संक्रामक रोगों, एलर्जी रोगों और ट्यूमर कोशिकाओंके खिलाफ विशिष्ट साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए सबसे शक्तिशाली एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाएं (एपीसी) हैं। डीसी जन्मजात प्रतिरक्षा और अनुकूली प्रतिरक्षा के बीच प्राथमिक कड़ी हैं और प्रतिरक्षाविज्ञानी रक्षा और प्रतिरक्षा सहिष्णुता के रखरखाव में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। पिछले 40 वर्षों में, कई शोधकर्ताओं ने डीसी के सबसेट और सूजन और प्रतिरक्षा में उनके कार्यों को परिभाषित करने की मांग की है। उन अध्ययनों के अनुसार, डीसी अस्थि मज्जा कोशिकाओं से माइलॉयड और लिम्फोइड वंशों के साथ विकसित होते हैं। ट्यूमर के टीकों ने हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण मील के पत्थर हासिल किए हैं और एक आशाजनक भविष्य है। यंत्रवत् रूप से, ट्यूमर के टीके प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करते हैं और ट्यूमर एंटीजन का उपयोग करके साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट्स को सक्रिय करके ट्यूमर के विकास को रोकते हैं। डीसी पर आधारित टीका ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और इसे सबसे आशाजनक एंटी-ट्यूमर थेरेपी 1,4 में से एक के रूप में पहचाना गया है। इसके अलावा, डीसी का व्यापक रूप से उपयोग नई आणविक-लक्षित दवाओं और प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधकों के परीक्षण में किया गयाहै।
शोधकर्ताओं को डीसी की भूमिका का आगे अध्ययन करने के लिए उच्च-शुद्धता डीसी की एक उच्च संख्या की तत्काल आवश्यकता होती है। हालांकि, डीसी विभिन्न ऊतकों और रक्त में दुर्लभ हैं, जो मनुष्यों और जानवरों में रक्त कोशिकाओं के केवल 1% के लिए लेखांकन करते हैं। अस्थि मज्जा डेंड्राइटिक कोशिकाओं (बीएमडीसी) की इन विट्रो संस्कृति डीसी कोशिकाओं की बड़ी मात्रा प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण विधि है। इस बीच, अस्थि मज्जा से डीसी उत्पन्न करने के लिए लुत्ज़प्रोटोकॉल का व्यापक रूप से शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया गया है। यद्यपि प्रोटोकॉल डीसी कोशिकाओं को प्राप्त करने में प्रभावी है, यह जटिल और महंगा है, जिसमें साइटोकिन्स की उच्च सांद्रता और लाल रक्त कोशिकाओं के लाइसिस के अलावा शामिल है।
इस अध्ययन में, हम माउस अस्थि मज्जा (बीएम) से लगभग सभी अस्थि मज्जा कोशिकाओं को अलग करने और जीएम-सीएसएफ और आईएल -4 की कम एकाग्रता के साथ विट्रो में इनक्यूबेशन के 7-9 दिनों के बाद बीएमडीसी में भेदभाव को प्रेरित करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं। इस प्रक्रिया में लगभग सभी अस्थि मज्जा कोशिकाओं को काटने और उन्हें एक पूर्ण माध्यम में निलंबित करने के लिए केवल 10 मिनट लगते हैं। संक्षेप में, हम इस शोध में बीएमडीसी के लिए एक कुशल और लागत प्रभावी खेती विधि प्रदान करते हैं।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं को नानजिंग मेडिकल यूनिवर्सिटी एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. अस्थि मज्जा का अलगाव और बीएम कोशिकाओं की तैयारी
- बलिदान C57BL / 6 चूहों (18-22 ग्राम, 6-8 सप्ताह पुराने) सीओ2 श्वासावरोध के माध्यम से। माउस ऑपरेटिंग टेबल पर माउस ठीक करें। 70% इथेनॉल के साथ सतहों कीटाणुरहित.
- मांसपेशियों और ऊरु धमनी को उजागर करने के लिए पैर की त्वचा को काटें। दो संदंश का उपयोग करके ऊरु धमनी को क्लैंप और फाड़ दें, फिर समीपस्थ छोर को पेट की ओर खींचें।
नोट: सीधे ऊरु धमनी में कटौती न करें। अन्यथा, यह अत्यधिक रक्तस्राव का कारण बनेगा और दृष्टि के क्षेत्र को दूषित कर देगा। - फीमर के आसपास की सभी मांसपेशियों को काट लें।
- धीरे-धीरे माउस के निचले अंगों को बाहर की ओर खींचें जब तक कि कूल्हे के संयुक्त विस्थापन की आवाज नहीं सुनी जाती है और ऊरु सिर प्रोलैप्स दिखाई देता है।
- ऊरु सिर के अंदर कैंची का उपयोग करके शरीर से निचले अंगों को अलग करें।
- एक मुक्त और पूर्ण फीमर प्राप्त करने के लिए घुटने के जोड़ के अंत से पिछले पैरों को काटें।
- धुंध का उपयोग करके फीमर से जुड़ी मांसपेशियों को हटा दें।
नोट: मांसपेशियों को सीधे न फाड़ें। चूहों की फीमर नाजुक है, इसकी अखंडता को बनाए रखा जाना चाहिए। - 2-5 मिनट के लिए 75% अल्कोहल में फीमर विसर्जित करें।
2. BMDC की प्रेरण संस्कृति
- पीबीएस के साथ अवशिष्ट शराब कुल्ला। फीमर के मध्य और निचले हिस्से को क्लैंप करने के लिए हेमोस्टैटिक संदंश का उपयोग करें और फीमर के निचले छोर को क्लैंप करने के लिए एक और सेट करें। हेमोस्टेटिक संदंश को फीमर पर पार्श्व रूप से लागू किया जाता है, और फीमर को एपिफिसियल लाइन से अलग किया जाता है।
नोट: epiphyseal लाइन आसानी से दिखाई नहीं देता है जब तक कि फीमर फ्रैक्चर। यह और अगले चरण सभी एक बाँझ वातावरण में किए जाते हैं। - एपिफिज़ल लाइन ब्रेक से अस्थि मज्जा गुहा में प्रवेश करने के लिए 1 एमएल सिरिंज (सुई: 0.6 मिमी x 25 मिमी) का उपयोग करें और ऊरु सिर और अस्थि मज्जा गुहा के माध्यम से प्रवेश करने के लिए सुई को घुमाएं। नाड़ी और जीएम-सीएसएफ / आईएल -4 युक्त पूर्ण माध्यम के 1 मिलीलीटर का उपयोग करके अस्थि मज्जा गुहा को फ्लश करें जब तक कि हड्डी सफेद न हो जाए।
नोट: पूर्ण संस्कृति माध्यम: 10% FBS, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 55 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng / mL GM-CSF, और 10 ng / mL IL-4। - पूर्ण संस्कृति माध्यम (~ 5 x 105 कोशिकाओं / एमएल) के 24 एमएल में सभी कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। मिश्रण के बाद, सभी माध्यम को 4 एमएल / अच्छी तरह से 6-अच्छी तरह से प्लेट पर बीज दिया गया था, फिर 2 दिनों के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था।
नोट: एरिथ्रोसाइट्स को लाइस करना आवश्यक नहीं है। - 2 दिनों के बाद सभी माध्यमों को जीएम-सीएसएफ / आईएल -47 युक्त माध्यम के साथ बदलें। चौथे, छठे और आठवें दिन, माध्यम के आधे हिस्से को 10 एनजी / एमएल जीएम-सीएसएफ / आईएल -4 युक्त पूर्ण माध्यम के साथ बदलें।
नोट: इस चरण में, एरिथ्रोसाइट्स और लिम्फोसाइट्स जैसे निलंबित कोशिकाओं को हटा दिया जाता है। - सेल वृद्धि रिकॉर्ड करने के लिए हर दिन तस्वीरें लें. दिन छह से शुरू करते हुए, सेल संख्या की गणना करने और CD11c, CD80, और MHC II अभिव्यक्ति 6,7 का पता लगाने के लिए प्रति दिन कोशिकाओं का एक कुआं काट लें।
3. CD11c, CD80, और MHC द्वितीय की अभिव्यक्ति का प्रवाह cytometric पता लगाने
- पीबीएस के साथ डीसी को धोने के बाद, एफएसीएस बफर के 100 μL में 1 x 106 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, एंटी-माउस CD16/32 एंटीबॉडी के 0.5 μg जोड़ें, और गैर-विशिष्ट एंटीजन साइटों को अवरुद्ध करने के लिए बर्फ पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- Percp/ cy5.5-CD11c के 1 μg, PE-CD80 के 0.5 μg, और APC-MHC II एंटीबॉडी के 0.04 μg जोड़ें, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज, supernatant को हटा दें, 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 1 mL जोड़ें, 4 °C पर 30 मिनट के लिए ठीक करें, और FACS बफर के 300 μL में फिर से निलंबित करें।
- प्रवाह cytometry प्रदर्शन करें।
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Representative Results
1 x 10 7-1.7 x 107 कोशिकाओं को दो फीमर से निकाला गया था और 6-अच्छी तरह से प्लेट (चित्रा 1 ए) में लगाए जाने से पहले 24 मिलीलीटर माध्यम में फिर से निलंबित कर दिया गया था। 2 दिनों के बाद, गैर-अनुयायी कोशिकाओं को पूरी तरह से संस्कृति माध्यम को बदलकर हटा दिया गया था। माध्यम को बदलने से पहले, निलंबित कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या देखी गई (चित्रा 1 बी)। संस्कृति के 3 दिनों के बाद, छोटे सेल उपनिवेशों का निर्माण शुरू हुआ। छठे दिन कॉलोनियों का आकार और संख्या काफी बढ़ गई। सातवें दिन, कोशिकाओं की संख्या चरम पर पहुंच गई (22 x 106-27 x 106) और फिर धीरे-धीरे गिर गई (चित्रा 2 ए)। डीसी कोशिकाओं की सतह लंबे समय तक स्यूडोपोडिया के साथ खुरदरी हो गई, जो विशिष्ट परिपक्व डीसी सेल आकृति विज्ञान (चित्रा 2 बी) का प्रदर्शन करती है। फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला है कि कुल कोशिकाओं के लिए सीडी 11 सी सकारात्मक का अनुपात छठे दिन 71% था, जबकि दसवें दिन अनुपात 96.1% तक बढ़ गया (चित्रा 2 सी, 2 डी)।
सह-उत्तेजक अणुओं की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए, CD11c, CD80, और MHC II को सह-दाग8 किया गया था। जैसा कि चित्रा 3 ए के रूप में दिखाया गया है, CD11c, CD80 और MHC II की अभिव्यक्ति धीरे-धीरे दिन 6 से दिन 10 तक बढ़ती खेती के समय के साथ बढ़ी। इसके अतिरिक्त, प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण ने CD11c और CD80 डबल-पॉजिटिव, CD11c और MHCII डबल-पॉजिटिव (चित्रा 3B, 3D), और ट्रिपल-पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा 3C, 3D) के अनुपात में क्रमिक वृद्धि दिखाई।
चित्रा 1: विभिन्न संस्कृति समय पर डीसी की प्रतिनिधि छवियां( ए) बीएमडीसी की खेती का फ्लो-चार्ट। (बी) विभिन्न संस्कृति समय पर डीसी की प्रतिनिधि छवियां। अस्थि मज्जा कोशिकाओं को 10 एनजी / एमएल जीएम-सीएसएफ और आईएल -4 के साथ 24 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम में निलंबित कर दिया गया था और 6-अच्छी तरह से प्लेट में बीज दिया गया था। बीएफ, संस्कृति माध्यम बदलने से पहले; AF, संस्कृति माध्यम बदलने के बाद। लाल तीर, डीसी कॉलोनी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: विभिन्न संस्कृति समय पर डीसी की संख्या और शुद्धता। (A) सभी संस्कृति माध्यमों में कोशिकाओं की कुल संख्या। (B) DC की प्रतिनिधि छवियाँ (C,D) प्रवाह साइटोमेट्रिक और DC के अनुपात के विश्लेषण का आरेखीय निरूपण। CD11c द्वारा धनात्मक कोशिकाओं को क्रमबद्ध किया गया था। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
चित्रा 3: डीसी में सह-उत्तेजक अणुओं की अभिव्यक्ति। (A) DC में CD11c, CD80, और MHC की अभिव्यक्ति (B) CD11c और CD80 डबल-पॉजिटिव, CD11c और MHC के अनुपात का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण, और ट्रिपल-पॉजिटिव कोशिकाएं। (C, D) दिन 6 से प्रवाह cytometric विश्लेषण- दिन 10 और सांख्यिकीय विश्लेषण दिखाने के लिए आरेखीय प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
मनुष्यों और चूहों में शास्त्रीय डीसी (सीडीसी, सीडीसी 1 और सीडीसी 2 एस सहित) प्लाज्मासाइटोइड डीसी (पीडीसी) और मोनोसाइट-व्युत्पन्न डीसी (एमओडीसी) 9,10,11 सहित विभिन्न डीसी सबसेट होते हैं। यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि cDC1s इंट्रासेल्युलर रोगजनकों और कैंसर के लिए साइटोटॉक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) प्रतिक्रियाओं को विनियमित करता है, और cDC2s बाह्य कोशिकीय रोगजनकों, परजीवी और एलर्जीन12 के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करता है। जीएम-सीएसएफ और आईएल -4 6,13,14 की उपस्थिति में चूहों में बीएम पूर्वज कोशिकाओं से विट्रो में डीसी की एक महत्वपूर्ण संख्या का उत्पादन किया जा सकता है। डीसी की शुद्धता और मात्रा सफल डीसी इम्यूनोथेरेपी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि 1 x 105 से 1 x 10 6 डीसी की दो खुराक 15,16,17,18 मॉडल में कुशल साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) प्रतिक्रियाओं को प्राप्त कर सकती है। इसका तात्पर्य यह है कि ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी में डीसी की भूमिका की आगे की जांच करने के लिए उच्च-शुद्धता डीसी की एक उच्च संख्या की खेती करने की आवश्यकता है।
अस्थि मज्जा कोशिकाओं को प्राप्त करने का पारंपरिक तरीका फीमर के दो सिरों को काटना और मध्यम 6,7 के साथ कुल्ला करना है। इस अध्ययन में, हमने फीमर को तोड़ने के लिए अभिनव रूप से शारीरिक शारीरिक संरचनात्मक संरचनाओं का उपयोग किया। हेमोस्टेटिक संदंश का उपयोग फीमर के निचले छोर को दबाने और इसे पार्श्व रूप से स्थानांतरित करने के लिए किया जाता था। एपिफिसियल लाइन शारीरिक रूप से कमजोर है, जिससे उन्हें तनावग्रस्त होने पर फ्रैक्चर के लिए अतिसंवेदनशील बना दियाजाता है 19। फीमर को एपिफिसियल लाइन से अलग करने के बाद, मज्जा गुहा में हड्डी की एक छोटी मात्रा बनी रहती है। सुई आसानी से अस्थि मज्जा गुहा में हड्डी को भेद सकती है। विधि संचालित करने के लिए सरल है, कीमती अस्थि मज्जा कोशिकाओं की रक्षा करती है, और डीसी की एक उच्च संख्या की संस्कृति के लिए एक सेलुलर आधार प्रदान करती है। हमने 10 एनजी / एमएल जीएम-सीएसएफ और 10 एनजी / एमएल आईएल -4 के संयोजन का उपयोग करके डीसी को सुसंस्कृत किया, जो अकेले जीएम-सीएसएफ की तुलना में डीसी की परिपक्वता में अधिक योगदान देता है। Labeur और Son ने बताया कि डीसी के माध्यम में जीएम-सीएसएफ और आईएल -4 के संयुक्त उपयोग ने परिपक्वता मार्करों की उच्च अभिव्यक्ति को प्रेरित किया, जैसे कि आईएफएन-π, टीएनएफ-α, और आईएल -6, और बढ़ी हुई एंटीजन-प्रस्तुत करने की क्षमता 7,20,21। सोन एट अल ने यह भी प्रस्तावित किया कि जीएम-सीएसएफ और आईएल -4 का संयोजन डीसी 7,21 की परिपक्वता को बढ़ावा देता है।
इस अध्ययन में, हमने एरिथ्रोसाइट्स को झूठ बोलने के बिना सीधे एकत्र अस्थि मज्जा कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया और उन्हें ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग कर दिया, जिसके परिणामस्वरूप सेल हानि हो सकती है और अंततः, काटे गए डीसी में कमी हो सकती है। माध्यम बदलने से पहले, संस्कृति प्रणाली में कई निलंबित कोशिकाएं थीं, जिनमें एरिथ्रोसाइट्स, टी कोशिकाएं, बी कोशिकाएं और ग्रैनुलोसाइट्स शामिल थे। सह-संस्कृति के दौरान, ये कोशिकाएं डीसी की परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए साइटोकिन्स का उत्पादन कर सकती हैं।
सीमाओं के संदर्भ में, इस प्रोटोकॉल ने केवल माउस के दो फीमर का उपयोग किया, छोटे टिबिया को छोड़कर, जिसके परिणामस्वरूप कुछ मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का नुकसान हुआ। संक्षेप में, हमने चूहों से अस्थि-मज्जा-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं के अलगाव और पीढ़ी के लिए एक लागत प्रभावी और कुशल प्रोटोकॉल विकसित किया, जिसमें अस्थि मज्जा कोशिकाओं को अलग करने में केवल 10 मिनट लगते हैं। जीएम-सीएसएफ और आईएल -4 के 10 एनजी / एमएल के साथ इनक्यूबेशन के 6 दिनों से 7 दिनों के बाद बड़ी संख्या में उच्च-शुद्धता वाले डीसी की कटाई की गई थी।
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Disclosures
सभी लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास हितों का कोई संघर्ष नहीं है और उनके पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को तियानजिन विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (20JCQNJC00550), तियानजिन स्वास्थ्य विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना (TJWJ202021QN033 और TJWJ20202021QN034) के कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
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