Summary
Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.
Abstract
A demanda por células dendríticas (DCs) está aumentando gradualmente à medida que a pesquisa em imunologia avança. No entanto, os DCs são raros em todos os tecidos. O método tradicional de isolação de DCs envolve principalmente induzir a diferenciação de medula óssea (MT) em DCs, injetando grandes doses (>10 ng/mL) de fator estimulante da colônia granulocito-macrófago/interleucina-4 (GM-CSF/IL-4), tornando o procedimento complexo e caro. Neste protocolo, utilizando todas as células BM cultivadas em 10 ng/mL GM-CSF/IL-4, após 3-4 trocas de meia cultura, até 2,7 x 107 células CD11c+ (DCs) por rato (dois fêmures) foram colhidas com uma pureza de 80%-95%. Após 10 dias na cultura, a expressão de CD11c, CD80 e MHC II aumentou, enquanto o número de células diminuiu. O número de células atingiu o pico após 7 dias de cultura. Além disso, este método levou apenas 10 minutos para colher todas as células de medula óssea, e um alto número de DCs foram obtidos após 1 semana de cultura.
Introduction
As células dendríticas (DCs) são as células mais poderosas que apresentam antígeno (APCs) para ativar células T ingênuas e induzir respostas específicas de linfócitos T citotóxicos específicos (CTL) contra doenças infecciosas, doenças alérgicas e células tumorais 1,2,3. Os DCs são o principal elo entre imunidade inata e imunidade adaptativa e desempenham um papel essencial na defesa imunológica e na manutenção da tolerância imunológica. Nos últimos 40 anos, muitos pesquisadores têm procurado definir os subconjuntos dos DCs e suas funções em inflamação e imunidade. De acordo com esses estudos, os DCs desenvolvem-se ao longo das linhagens mieloide e linfoides a partir de células de medula óssea. As vacinas tumorais ganharam marcos significativos nos últimos anos e têm um futuro promissor. Mecanicamente, as vacinas tumorais modulam a resposta imune e previnem o crescimento do tumor ativando linfócitos T citotóxicos usando antígenos tumorais. A vacina baseada em DCs desempenha um papel importante na imunoterapia tumoral e foi identificada como uma das terapias anti-tumores mais promissoras 1,4. Além disso, os DCs têm sido amplamente utilizados nos testes de novas drogas de alvo molecular e inibidores de ponto de verificação imunológico5.
Os pesquisadores precisam urgentemente de um alto número de DCs de alta pureza para estudar melhor o papel dos DCs. No entanto, os DCs são raros em vários tecidos e sangue, representando apenas 1% das células sanguíneas em humanos e animais. A cultura in vitro de células dendríticas de medula óssea (BMDC) é um método importante para a obtenção de grandes quantidades de células DC. Enquanto isso, o protocolo Lutz para geração de DCs a partir da medula óssea tem sido amplamente utilizado pelos pesquisadores6. Embora o protocolo seja eficaz na obtenção de células DC, é complexo e caro, envolvendo a adição de altas concentrações de citocinas e a lise dos glóbulos vermelhos.
Neste estudo, relatamos um método para isolar quase todas as células de medula óssea da medula óssea do camundongo (MMO) e induzir a diferenciação em BMDC após 7-9 dias de incubação in vitro, com menor concentração de GM-CSF e IL-4. Este procedimento leva apenas 10 minutos para colher quase todas as células de medula óssea e suspendê-las em um meio completo. Em suma, fornecemos um método de cultivo eficiente e econômico para o BMDC nesta pesquisa.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Nanjing.
1. Isolamento da medula óssea e preparação de células BM
- Sacrifício C57BL/6 camundongos (18-22 g, 6-8 semanas de idade) via asfixia de CO2 . Conserte o mouse na mesa de operação do mouse. Desinfete as superfícies com 70% de etanol.
- Corte a pele da perna para expor os músculos e a artéria femoral. Grampo e rasgue a artéria femoral usando dois fórceps, em seguida, puxe a extremidade proximal em direção ao abdômen.
NOTA: Não corte diretamente a artéria femoral. Caso contrário, causará sangramento excessivo e contaminará o campo de visão. - Corte todos os músculos ao redor do fêmur.
- Estique lentamente os membros inferiores do rato para fora até que o som da luxação da articulação do quadril seja ouvido e o prolapso da cabeça femoral seja visível.
- Separe os membros inferiores do corpo usando uma tesoura ao longo do interior da cabeça femoral.
- Corte as pernas traseiras da extremidade da articulação do joelho para obter um fêmur livre e completo.
- Remova os músculos ligados ao fêmur usando gaze.
NOTA: Não rasgue os músculos diretamente. O fêmur de camundongos é delicado, sua integridade deve ser mantida. - Mergulhe o fêmur em 75% de álcool por 2-5 min.
2. Cultura de indução do BMDC
- Enxágüe o álcool residual com PBS. Use fórceps hemostáticos para fixar a parte média e inferior do fêmur e outro conjunto para fixar a extremidade inferior do fêmur. As fórceps hemostáticas são aplicadas lateralmente ao fêmur, e o fêmur é separado da linha epífise.
NOTA: A linha epífise não é facilmente visível até que o fêmur se escaia. Este e os próximos passos são todos realizados em um ambiente estéril. - Use uma seringa de 1 mL (agulha: 0,6 mm x 25 mm) para penetrar a cavidade da medula óssea a partir da quebra da linha epífise e gire a agulha para penetrar na cabeça femoral e através da cavidade da medula óssea. Pulso e lave a cavidade da medula óssea usando 1 mL do meio completo contendo GM-CSF/IL-4 até que o osso fique branco.
NOTA: Ensino médio completo: 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina, 55 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng/mL GM-CSF e 10 ng/mL IL-4. - Resuspenda todas as células em 24 mL de meio de cultura completa (~5 x 105 células/mL). Após a mistura, todo o meio foi semeado em uma placa de 6 poços com 4 mL/bem, depois incubado a 37 °C com 5% de CO2 por 2 dias.
NOTA: Não é necessário lise eritrócitos. - Substitua todo o meio após 2 dias por médio contendo GM-CSF/IL-47. No quarto, sexto e oitavo dias, substitua metade do meio pelo meio completo contendo 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.
NOTA: Nesta etapa, são removidas células suspensas, como eritrócitos e linfócitos. - Tire fotos todos os dias para registrar o crescimento celular. A partir do sexto dia, colher um poço de células por dia para contar o número do celular e detectar a expressão CD11c, CD80 e MHC II 6,7.
3. Detecção citométrica de fluxo da expressão de CD11c, CD80 e MHC II
- Depois de lavar os DCs com PBS, resuspenque 1 x 106 células em 100 μL de tampão FACS, adicione 0,5 μg de anticorpo cd16/32 anti-rato e incubar por 10 minutos no gelo para bloquear locais de antígeno não específicos.
- Adicione 1 μg de Percp/cy5.5-CD11c, 0,5 μg de PE-CD80 e 0,04 μg de anticorpos APC-MHC II, e incubar no gelo por 30 min.
- Centrifugar a 1.000 x g por 3 min a 4 °C, remover o supernascedor, adicionar 1 mL de paraformaldeído de 4%, fixar por 30 min a 4 °C e suspender em 300 μL de tampão FACS.
- Realize a citometria de fluxo.
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Representative Results
As células 1 x 10 7-1,7 x 107 foram extraídas de dois fêmures e foram restequecidas em 24 mL de médio antes de serem plantadas em uma placa de 6 poços (Figura 1A). Após 2 dias, as células não aderentes foram removidas mudando completamente o meio cultural. Antes de mudar o meio, observou-se um número significativo de células suspensas (Figura 1B). Após 3 dias de cultura, pequenas colônias de células começaram a se formar. No sexto dia, o tamanho e o número de colônias aumentaram significativamente. No sétimo dia, o número de células atingiu o pico (22 x 106-27 x 106) e depois caiu gradualmente (Figura 2A). A superfície das células DC tornou-se áspera com pseudopodia mais longa, exibindo morfologia típica de células DC maduras (Figura 2B). A análise citométrica do fluxo mostrou que a razão do CD11c positivo para o total das células foi de 71% no sexto dia, enquanto a razão aumentou para 96,1% no décimo dia (Figura 2C,2D).
Para avaliar a expressão de moléculas co-estimulatórias, CD11c, CD80 e MHC II foram co-manchados8. Como mostra a Figura 3A, a expressão de CD11c, CD80 e MHC II aumentou gradualmente com o aumento do tempo de cultivo do dia 6 ao dia 10. Além disso, a análise citométrica de fluxo mostrou um aumento gradual nas proporções de CÉLULAS CD11c e CD80 duplamente positiva, CD11c e MHCII duplo-positiva (Figura 3B,3D) e células triplamente positivas (Figura 3C,3D).
Figura 1: Imagens representativas de DCs em diferentes épocas de cultura. (A) Fluxograma de BMDC de cultivo. (B) Imagens representativas de DCs em diferentes épocas de cultura. As células de medula óssea foram suspensas em 24 mL de meio de cultura com 10 ng/mL GM-CSF e IL-4 e semeadas em uma placa de 6 poços. BF, antes de mudar o meio da cultura; AF, depois de mudar o meio da cultura. Flecha vermelha, colônia de DC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O número e a pureza dos DCs em diferentes épocas de cultura. (A) Número total de células em todos os meios de cultura. (B) Imagens representativas de DCs. (C,D) Representação citométrica e gráfica de fluxo da análise da proporção de DCs. As células positivas foram classificadas por CD11c. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A expressão de moléculas co-estimulantes em DCs. (A) A expressão de CD11c, CD80 e MHC ΙΙ em DCs. (B) Análise citométrica de fluxo da proporção de células CD11c e CD80 duplo-positiva, CD11c e MHC ΙΙ duplo-positiva, e células triplamente positivas. (C, D) Análise citométrica de fluxo do dia 6- Dia 10 e representação gráfica para mostrar a análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Humanos e camundongos têm diferentes subconjuntos dc, incluindo DCs clássicos (cDCs, incluindo cDC1s e cDC2s) DCs plasmacitóides (pDCs) e DCs derivados de monócitos (MoDCs)9,10,11. É geralmente aceito que os cDC1s regulam as respostas citotóxicas de Linfocito T (CTL) a patógenos intracelulares e câncer, e os cDC2s regulam respostas imunes a patógenos extracelulares, parasitas e alérgenos12. Um número significativo de DCs pode ser produzido in vitro a partir de células progenitoras BM em camundongos na presença de GM-CSF e IL-4 6,13,14. A pureza e a quantidade de DCs desempenham papéis-chave na imunoterapia de DC bem sucedida. Pesquisadores mostraram que duas doses de 1 x 105 a 1 x 106 DCs poderiam provocar respostas eficientes de linfócito t citotóxico eficiente (CTL) em um modelo de xenoenxerto 15,16,17,18. Isso implica que um alto número de DCs de alta pureza precisam ser cultivados para investigar melhor o papel dos DCs na imunoterapia tumoral.
O método tradicional de obtenção de células de medula óssea é cortar as duas extremidades do fêmur e enxaguar com o meio 6,7. Neste estudo, utilizamos inovadoramente estruturas anatômicas fisiológicas para cortar o fêmur. Fórceps hemostáticos foram usados para prender a extremidade inferior do fêmur e movê-lo lateralmente. A linha epífise é fisiologicamente fraca, tornando-as suscetíveis a fraturas quando estressadas19. Depois que o fêmur é separado da linha epífise, uma pequena quantidade de osso permanece na cavidade da medula. A agulha pode facilmente penetrar o osso na cavidade da medula óssea. O método é simples de operar, protege células preciosas da medula óssea e fornece uma base celular para a cultura de um alto número de DCs. Nós cultuamos os DCs usando uma combinação de 10 ng/mL GM-CSF e 10 ng/mL IL-4, o que contribui mais para o amadurecimento dos DCs do que apenas gm-CSF. Labeur e Son relataram que o uso combinado de GM-CSF e IL-4 no meio de DCs induziu maior expressão de marcadores de maturação, como IFN-ɣ, TNF-α e IL-6, e capacidade aprimorada de apresentação de antígenos 7,20,21. Son et al. também propuseram que a combinação de GM-CSF e IL-4 promove o amadurecimento dos DCs 7,21.
Neste estudo, nós apenas culturalizamos as células de medula óssea coletadas sem lise os eritrócitos e as separamos por centrifugação gradiente, o que pode resultar em perda celular e, em última instância, redução dos DCs colhidos. Antes do meio ser alterado, havia várias células suspensas no sistema de cultura, incluindo eritrócitos, células T, células B e granulócitos. Durante a cocultura, essas células podem produzir citocinas para promover o amadurecimento dos DCs.
Em termos de limitações, este protocolo só utilizou dois fêmures do camundongo, excluindo as tíbias menores, resultando na perda de algumas células-tronco mesenquimais. Em suma, desenvolvemos um protocolo econômico e eficiente para o isolamento e geração de células dendríticas derivadas da medula óssea a partir de camundongos, que leva apenas 10 minutos para separar as células da medula óssea. Um grande número de DCs de alta pureza foram colhidos após 6 dias a 7 dias de incubação com 10 ng/mL de GM-CSF e IL-4.
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Disclosures
Todos os autores declaram que não têm conflitos de interesse e que não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa do Plano de Ciência e Tecnologia de Tianjin (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 e TJWJ202021QN034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
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