Summary
Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.
Abstract
De vraag naar dendritische cellen (DC's) neemt geleidelijk toe naarmate het immunologisch onderzoek vordert. DC's zijn echter zeldzaam in alle weefsels. De traditionele methode voor het isoleren van DC's omvat voornamelijk het induceren van beenmerg (BM) differentiatie in DC's door het injecteren van grote doses (>10 ng / ml) granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor / interleukine-4 (GM-CSF / IL-4), waardoor de procedure complex en duur wordt. In dit protocol werden, met behulp van alle BM-cellen gekweekt in 10 ng / ml GM-CSF / IL-4 medium, na 3-4 halve cultuuruitwisselingen, tot 2,7 x 107 CD11c + cellen (DC's) per muis (twee dijbenen) geoogst met een zuiverheid van 80% -95%. Na 10 dagen in cultuur nam de expressie van CD11c, CD80 en MHC II toe, terwijl het aantal cellen afnam. Het aantal cellen piekte na 7 dagen kweek. Bovendien duurde deze methode slechts 10 minuten om alle beenmergcellen te oogsten en werd een groot aantal DC's verkregen na 1 week cultuur.
Introduction
Dendritische cellen (DC's) zijn de krachtigste antigeen-presenterende cellen (APC's) voor het activeren van naïeve T-cellen en het induceren van specifieke cytotoxische T-lymfocyten (CTL) reacties tegen infectieziekten, allergieziekten en tumorcellen 1,2,3. DC's zijn de primaire schakel tussen aangeboren immuniteit en adaptieve immuniteit en spelen een essentiële rol in immunologische afweer en het behoud van immuuntolerantie. In de afgelopen 40 jaar hebben veel onderzoekers geprobeerd de subsets van DC's en hun functies in ontsteking en immuniteit te definiëren. Volgens die studies ontwikkelen DC's zich langs de myeloïde en lymfoïde afstammingslijnen van beenmergcellen. Tumorvaccins hebben de afgelopen jaren belangrijke mijlpalen bereikt en hebben een veelbelovende toekomst. Mechanisch moduleren tumorvaccins de immuunrespons en voorkomen tumorgroei door cytotoxische T-lymfocyten te activeren met behulp van tumorantigenen. Het vaccin op basis van DC's speelt een belangrijke rol in tumorimmunotherapie en is geïdentificeerd als een van de meest veelbelovende antitumortherapieën 1,4. Bovendien zijn DC's op grote schaal gebruikt bij het testen van nieuwe moleculair gerichte geneesmiddelen en immuuncheckpointremmers5.
Onderzoekers hebben dringend een groot aantal zeer zuivere DC's nodig om de rol van DC's verder te bestuderen. DC's zijn echter zeldzaam in verschillende weefsels en bloed, goed voor slechts 1% van de bloedcellen bij mens en dier. In vitro kweek van beenmerg dendritische cellen (BMDC) is een belangrijke methode voor het verkrijgen van grote hoeveelheden DC-cellen. Ondertussen is het Lutz-protocol voor het genereren van DC's uit beenmerg veel gebruikt door onderzoekers6. Hoewel het protocol effectief is bij het verkrijgen van DC-cellen, is het complex en duur, waarbij hoge concentraties cytokines en de lysis van rode bloedcellen worden toegevoegd.
In deze studie rapporteren we een methode voor het isoleren van bijna alle beenmergcellen uit het beenmerg van muizen (BM) en het induceren van differentiatie in BMDC na 7-9 dagen incubatie in vitro, met een lagere concentratie GM-CSF en IL-4. Deze procedure duurt slechts 10 minuten om bijna alle beenmergcellen te oogsten en in een volledig medium op te hangen. Kortom, we bieden in dit onderzoek een efficiënte en kosteneffectieve kweekmethode voor BMDC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de Nanjing Medical University Animal Care and Use Committee.
1. Isolatie van beenmerg en bereiding van BM-cellen
- Offer C57BL/6 muizen (18-22 g, 6-8 weken oud) op via CO2 verstikking. Bevestig de muis op de bedieningstafel van de muis. Desinfecteer de oppervlakken met 70% ethanol.
- Snijd de huid van het been om de spieren en de dijbeenslagader bloot te leggen. Klem en scheur de dijbeenslagader af met behulp van twee tangen en trek vervolgens het proximale uiteinde naar de buik.
OPMERKING: Snijd de dijbeenslagader niet direct door. Anders zal het overmatig bloeden veroorzaken en het gezichtsveld besmetten. - Snijd alle spieren rond het dijbeen.
- Rek langzaam de onderste ledematen van de muis naar buiten totdat het geluid van heupgewrichtdislocatie wordt gehoord en de verzakking van de heupkop zichtbaar is.
- Scheid de onderste ledematen van het lichaam met behulp van een schaar langs de binnenkant van de heupkop.
- Snijd de achterpoten van het uiteinde van het kniegewricht om een vrij en volledig dijbeen te verkrijgen.
- Verwijder de spieren die aan het dijbeen zijn bevestigd met gaas.
OPMERKING: Scheur de spieren niet direct. Het dijbeen van muizen is delicaat, de integriteit ervan moet worden gehandhaafd. - Dompel het dijbeen onder in 75% alcohol gedurende 2-5 minuten.
2. Inductiecultuur van BMDC
- Spoel de restalcohol af met PBS. Gebruik een hemostatische tang om het middelste en onderste deel van het dijbeen vast te klemmen en een andere set om het onderste uiteinde van het dijbeen te klemmen. De hemostatische tang wordt zijdelings op het dijbeen aangebracht en het dijbeen wordt gescheiden van de epifysaire lijn.
OPMERKING: De epifysaire lijn is niet gemakkelijk zichtbaar totdat het dijbeenfracturen. Deze en de volgende stappen worden allemaal uitgevoerd in een steriele omgeving. - Gebruik een spuit van 1 ml (naald: 0,6 mm x 25 mm) om de beenmergholte van de epifysaire lijnbreuk binnen te dringen en draai de naald om de heupkop en door de beenmergholte te penetreren. Pulseer en spoel de beenmergholte met behulp van 1 ml van het volledige medium dat GM-CSF / IL-4 bevat totdat het bot wit wordt.
OPMERKING: Volledig kweekmedium: 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine, 55 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng / ml GM-CSF en 10 ng / ml IL-4. - Resuspend alle cellen in 24 ml volledig kweekmedium (~ 5 x 105 cellen / ml). Na het mengen werd al het medium gezaaid op een 6-well plaat met 4 ml/put en vervolgens geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 2 dagen.
OPMERKING: Het is niet nodig om erytrocyten te lyseren. - Vervang al het medium na 2 dagen door medium met GM-CSF/IL-47. Vervang op de vierde, zesde en achtste dag de helft van het medium door het volledige medium met 10 ng/ml GM-CSF/IL-4.
OPMERKING: In deze stap worden gesuspendeerde cellen zoals erytrocyten en lymfocyten verwijderd. - Maak elke dag foto's om de celgroei vast te leggen. Oogst vanaf dag zes één put cellen per dag om het celnummer te tellen en CD11c-, CD80- en MHC II-expressie 6,7 te detecteren.
3. Flowcytometrische detectie van de expressie van CD11c, CD80 en MHC II
- Na het wassen van de DC's met PBS, resuspend 1 x 106 cellen in 100 μL FACS-buffer, voeg 0,5 μg anti-muis CD16/32 antilichaam toe en incubeer gedurende 10 minuten op ijs om niet-specifieke antigeenplaatsen te blokkeren.
- Voeg 1 μg Percp/cy5.5-CD11c, 0,5 μg PE-CD80 en 0,04 μg APC-MHC II-antilichamen toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant, voeg 1 ml 4% paraformaldehyde toe, fixeer gedurende 30 minuten bij 4 °C en suspensie opnieuw in 300 μL FACS-buffer.
- Voer flowcytometrie uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De 1 x 10 7-1,7 x 107 cellen werden geëxtraheerd uit twee dijbenen en werden opnieuw gesuspendeerd in 24 ml medium voordat ze in een 6-well plaat werden geplant (figuur 1A). Na 2 dagen werden niet-hechtende cellen verwijderd door het kweekmedium volledig te veranderen. Voordat het medium werd gewijzigd, werd een aanzienlijk aantal gesuspendeerde cellen waargenomen (figuur 1B). Na 3 dagen cultuur begonnen zich kleine celkolonies te vormen. Op de zesde dag namen de grootte en het aantal kolonies aanzienlijk toe. Op de zevende dag piekte het aantal cellen (22 x 10 6-27 x 106) en daalde vervolgens geleidelijk (figuur 2A). Het oppervlak van de DC-cellen werd ruw met langere pseudopodia, die typische volwassen DC-celmorfologie vertoonden (figuur 2B). Flowcytometrische analyse toonde aan dat de verhouding van CD11c-positieve tot totale cellen 71% was op de zesde dag, terwijl de verhouding steeg tot 96,1% op de tiende dag (figuur 2C,2D).
Om de expressie van costimulerende moleculen te evalueren, werden CD11c, CD80 en MHC II samen gekleurd8. Zoals weergegeven in figuur 3A, nam de expressie van CD11c, CD80 en MHC II geleidelijk toe met toenemende teelttijd van dag 6 tot dag 10. Bovendien toonde flowcytometrische analyse een geleidelijke toename van de verhoudingen van CD11c en CD80 dubbelpositieve, CD11c en MHCII dubbelpositieve (figuur 3B,3D) en drievoudig-positieve cellen (figuur 3C,3D).
Figuur 1: Representatieve beelden van DC's op verschillende cultuurtijden. (A) Stroomschema van het kweken van BMDC. (B) Representatieve beelden van DC's op verschillende cultuurmomenten. Beenmergcellen werden gesuspendeerd in 24 ml kweekmedium met 10 ng / ml GM-CSF en IL-4 en gezaaid in een 6-well plaat. BF, voordat het cultuurmedium verandert; AF, na het veranderen van cultuurmedium. Rode pijl, DC kolonie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het aantal en de zuiverheid van DC's op verschillende kweektijden. (A) Totaal aantal cellen in alle kweekmedia. (B) Representatieve afbeeldingen van DC's. (C,D) Flowcytometrische en grafische weergave van de analyse van het aandeel DC's. Positieve cellen werden gesorteerd op CD11c. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De expressie van costimulerende moleculen in DC's. (A) De expressie van CD11c, CD80 en MHC ΙΙ in DC's. (B) Flowcytometrische analyse van het aandeel CD11c en CD80 dubbelpositieve, CD11c en MHC ΙΙ dubbelpositieve en drievoudig-positieve cellen. (C, D) Flowcytometrische analyse vanaf dag 6- dag 10 en grafische weergave om de statistische analyse weer te geven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mensen en muizen hebben verschillende DC-subsets, waaronder klassieke DC's (cDC's, inclusief cDC1's en cDC2's), plasmacytoïde DC's (pDC's) en monocyten-afgeleide DC's (MoDC's)9,10,11. Het is algemeen aanvaard dat cDC1's cytotoxische T-lymfocyten (CTL) -reacties op intracellulaire pathogenen en kanker reguleren, en cDC2's reguleren immuunresponsen op extracellulaire pathogenen, parasieten en allergenen12. Een aanzienlijk aantal DC's kan in vitro worden geproduceerd uit BM-voorlopercellen in muizen in aanwezigheid van GM-CSF en IL-4 6,13,14. De zuiverheid en hoeveelheid DC's spelen een sleutelrol bij succesvolle DC-immunotherapie. Onderzoekers hebben aangetoond dat twee doses van 1 x 105 tot 1 x 106 DC's efficiënte cytotoxische T-lymfocyten (CTL) responsen kunnen uitlokken in een xenograftmodel 15,16,17,18. Dit impliceert dat een groot aantal zeer zuivere DC's moet worden gekweekt om de rol van DC's in tumorimmunotherapie verder te onderzoeken.
De traditionele methode voor het verkrijgen van beenmergcellen is om de twee uiteinden van het dijbeen te snijden en te spoelen met het medium 6,7. In deze studie hebben we op innovatieve wijze fysiologische anatomische structuren gebruikt om het dijbeen te verbreken. Hemostatische tang werd gebruikt om het onderste uiteinde van het dijbeen vast te klemmen en zijdelings te bewegen. De epifysaire lijn is fysiologisch zwak, waardoor ze gevoelig zijn voor fracturen bij stress19. Nadat het dijbeen is gescheiden van de epifysaire lijn, blijft er een kleine hoeveelheid bot over in de mergholte. De naald kan gemakkelijk het bot in de beenmergholte binnendringen. De methode is eenvoudig te bedienen, beschermt kostbare beenmergcellen en biedt een cellulaire basis voor de kweek van een groot aantal DC's. We kweekten de DC's met behulp van een combinatie van 10 ng / ml GM-CSF en 10 ng / ml IL-4, wat meer bijdraagt aan de rijping van DC's dan GM-CSF alleen. Labeur en Son meldden dat het gecombineerde gebruik van GM-CSF en IL-4 in het medium van DC's een hogere expressie van rijpingsmarkers veroorzaakte, zoals IFN-ɣ, TNF-α en IL-6, en een verbeterd antigeenpresentatief vermogen 7,20,21. Son et al. stelden ook voor dat de combinatie van GM-CSF en IL-4 de rijping van DC's 7,21 bevordert.
In deze studie hebben we de verzamelde beenmergcellen direct gekweekt zonder de erytrocyten te liegen en ze gescheiden door gradiëntcentrifugatie, wat kan resulteren in celverlies en uiteindelijk tot een vermindering van geoogste DC's. Voordat het medium werd veranderd, waren er verschillende suspenserende cellen in het kweeksysteem, waaronder erytrocyten, T-cellen, B-cellen en granulocyten. Tijdens de co-kweek kunnen deze cellen cytokines produceren om de rijping van DC's te bevorderen.
In termen van beperkingen gebruikte dit protocol slechts twee dijbenen van de muis, exclusief de kleinere tibia's, wat resulteerde in het verlies van enkele mesenchymale stamcellen. Kortom, we hebben een kosteneffectief en efficiënt protocol ontwikkeld voor de isolatie en generatie van beenmerg afgeleide dendritische cellen van muizen, dat slechts 10 minuten nodig heeft om beenmergcellen te scheiden. Een groot aantal zeer zuivere DC's werd geoogst na 6 dagen tot 7 dagen incubatie met 10 ng / ml GM-CSF en IL-4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben en dat ze niets te onthullen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 en TJWJ202021QN034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
