Summary
Her presenterer vi en økonomisk og effektiv metode for å isolere og generere benmarg-avledede dendrittiske celler med høy renhet fra mus etter 7 dager med kultur med 10 ng/ml GM-CSF/IL-4.
Abstract
Etterspørselen etter dendrittiske celler (DCs) øker gradvis etter hvert som immunologiforskningen utvikler seg. Imidlertid er domenekontrollere sjeldne i alle vev. Den tradisjonelle metoden for å isolere domenekontrollere innebærer først og fremst å indusere benmarg (BM) differensiering i domenekontrollere ved å injisere store doser (>10 ng/ml) granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), noe som gjør prosedyren kompleks og dyr. I denne protokollen ble bruk av alle BM-celler dyrket i 10 ng/ml GM-CSF/IL-4 medium, etter 3-4 halvkulturelle utvekslinger, opptil 2,7 x 107 CD11c+ celler (DCer) per mus (to lårben) høstet med en renhet på 80%-95%. Etter 10 dager i kulturen økte uttrykket for CD11c, CD80 og MHC II, mens antall celler gikk ned. Antall celler toppet seg etter 7 dager med kultur. Videre tok denne metoden bare 10 minutter å høste alle benmargsceller, og et høyt antall domenekontrollere ble oppnådd etter 1 uke med kultur.
Introduction
Dendrittiske celler (DCs) er de kraftigste antigen-presenterende cellene (APCer) for å aktivere naive T-celler og indusere spesifikke cytotoksiske T-lymfocytt (CTL) responser mot smittsomme sykdommer, allergisykdommer og tumorceller 1,2,3. Domenekontrollere er den primære koblingen mellom medfødt immunitet og adaptiv immunitet og spiller en viktig rolle i immunologisk forsvar og vedlikehold av immuntoleranse. I løpet av de siste 40 årene har mange forskere forsøkt å definere undergruppene av domenekontrollere og deres funksjoner i betennelse og immunitet. I henhold til disse studiene utvikler DCs langs myeloid og lymfoid avledninger fra benmargsceller. Tumorvaksiner har fått betydelige milepæler de siste årene og har en lovende fremtid. Mekanisk modulerer tumorvaksiner immunresponsen og forhindrer tumorvekst ved å aktivere cytotoksiske T-lymfocytter ved hjelp av tumorantigener. Vaksinen basert på domenekontrollere spiller en viktig rolle i tumorimmunoterapi og har blitt identifisert som en av de mest lovende anti-tumorterapiene 1,4. I tillegg har domenekontrollere blitt mye brukt i testingen av nye molekylær-målrettede legemidler og immunkontrollpunkthemmere5.
Forskere trenger raskt et høyt antall DCer med høy renhet for å studere DCs rolle ytterligere. Imidlertid er domenekontrollere sjeldne i ulike vev og blod, og står for bare 1% av blodcellene hos mennesker og dyr. In vitro kultur av benmarg dendritiske celler (BMDC) er en viktig metode for å oppnå store mengder DC-celler. I mellomtiden har Lutz-protokollen for å generere domenekontrollere fra benmarg blitt mye brukt av forskere6. Selv om protokollen er effektiv for å skaffe DC-celler, er den kompleks og dyr, som involverer tilsetning av høye konsentrasjoner av cytokiner og lysis av røde blodlegemer.
I denne studien rapporterer vi en metode for å isolere nesten alle benmargsceller fra musbenmarg (BM) og indusere differensiering i BMDC etter 7-9 dager med inkubasjon in vitro, med en lavere konsentrasjon av GM-CSF og IL-4. Denne prosedyren tar bare 10 min å høste nesten alle benmargsceller og å suspendere dem i et komplett medium. Kort fortalt tilbyr vi en effektiv og kostnadseffektiv kultiveringsmetode for BMDC i denne forskningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av Nanjing Medical University Animal Care and Use Committee.
1. Isolering av benmarg og tilberedning av BM-celler
- Ofre C57BL/6 mus (18-22 g, 6-8 uker gammel) via CO 2-kvelning. Fest musen på musens operasjonsbord. Desinfiser overflatene med 70% etanol.
- Klipp huden på beinet for å eksponere musklene og lårarterien. Klem og riv av lårarterien ved hjelp av to tang, og trekk deretter den proksimale enden mot magen.
MERK: Ikke skjær lårbensarterien direkte. Ellers vil det forårsake overdreven blødning og forurense synsfeltet. - Klipp alle musklene rundt lårbenet.
- Strekk sakte underekstremitetene på musen utover til lyden av hofteledddislokasjon høres og femoralhodets prolaps er synlig.
- Skill underekstremitetene fra kroppen ved hjelp av saks langs innsiden av lårhodet.
- Klipp bakbenene fra enden av kneleddet for å få en fri og komplett lårben.
- Fjern musklene festet til lårbenet ved hjelp av gasbind.
MERK: Ikke riv musklene direkte. Musens lårben er delikat, dens integritet må opprettholdes. - Senk lårbenet i 75% alkohol i 2-5 min.
2. Induksjonskultur av BMDC
- Skyll restalkoholen med PBS. Bruk hemostatiske tang til å klemme den midtre og nederste delen av lårbenet og et annet sett for å klemme den nedre enden av lårbenet. De hemostatiske tangene påføres lateralt på lårbenet, og lårbenet er skilt fra epifyseallinjen.
MERK: Epifyseallinjen er ikke lett synlig før lårbenet sprekker. Dette og de neste trinnene utføres alle i et sterilt miljø. - Bruk en 1 ml sprøyte (nål: 0,6 mm x 25 mm) for å trenge inn i benmargshulen fra epifyseal linjebruddet og roter nålen for å trenge inn i lårhodet og gjennom benmargshulen. Pulser og skyll benmargshulen med 1 ml av hele mediet som inneholder GM-CSF/IL-4 til benet blir hvitt.
MERK: Komplett kulturmedium: 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 55 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng/ml GM-CSF og 10 ng/ml IL-4. - Resuspend alle cellene i 24 ml komplett kulturmedium (~ 5 x 105 celler / ml). Etter blanding ble hele mediet sådd på en 6-brønns plate med 4 ml / brønn, deretter inkubert ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 dager.
MERK: Det er ikke nødvendig å lyse erytrocytter. - Skift ut hele mediet etter 2 dager med medium som inneholder GM-CSF/IL-47. På fjerde, sjette og åttende dag erstatter du halvparten av mediet med det komplette mediet som inneholder 10 ng/ml GM-CSF/IL-4.
MERK: I dette trinnet fjernes suspenderte celler som erytrocytter og lymfocytter. - Ta bilder hver dag for å registrere cellevekst. Fra dag seks høster du en brønn med celler per dag for å telle cellenummeret og oppdage CD11c-, CD80- og MHC II-uttrykk 6,7.
3. Strømningscytometrisk deteksjon av uttrykket av CD11c, CD80 og MHC II
- Etter å ha vasket domenekontrollerne med PBS, resuspend 1 x 106 celler i 100 μL FACS buffer, tilsett 0,5 μg anti-mus CD16/32 antistoff, og inkubere i 10 min på is for å blokkere ikke-spesifikke antigensteder.
- Tilsett 1 μg Percp/cy5,5-CD11c, 0,5 μg PE-CD80 og 0,04 μg APC-MHC II antistoffer, og inkuber på is i 30 minutter.
- Sentrifuge ved 1000 x g i 3 min ved 4 °C, fjern supernatanten, tilsett 1 ml 4 % paraformaldehyd, fest i 30 minutter ved 4 °C, og re-suspender i 300 μL FACS-buffer.
- Utfør strømningscytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellene 1 x 10 7-1,7 x 107 ble ekstrahert fra to lårben og ble suspendert i 24 ml medium før de ble plantet i en 6-brønns plate (figur 1A). Etter 2 dager ble ikke-tilhengerceller fjernet ved å endre kulturmediet helt. Før du endret mediet, ble det observert et betydelig antall suspenderte celler (figur 1B). Etter 3 dager med kultur begynte småcellekolonier å danne seg. På den sjette dagen økte størrelsen og antall kolonier betydelig. På den syvende dagen nådde antall celler (22 x 106-27 x 106) og falt deretter gradvis (figur 2A). Overflaten på DC-cellene ble grov med lengre pseudopodia, og viste typisk moden DC-cellemorfologi (figur 2B). Flow cytometrisk analyse viste at forholdet mellom CD11c positive og totale celler var 71% på den sjette dagen, mens forholdet økte til 96,1% på den tiende dagen (figur 2C,2D).
For å evaluere uttrykket av kostimulatoriske molekyler ble CD11c, CD80 og MHC II co-farget8. Som vist som figur 3A økte uttrykket for CD11c, CD80 og MHC II gradvis med økende dyrkingstid fra dag 6 til dag 10. I tillegg viste strømningscytometrisk analyse en gradvis økning i andelen CD11c- og CD80-dobbeltpositive, CD11c- og MHCII-dobbeltpositive (figur 3B,3D) og trippelpositive celler (figur 3C,3D).
Figur 1: Representative bilder av domenekontrollere på ulike kulturtider. (A) Flytskjema for dyrking av BMDC. (B) Representative bilder av domenekontrollere på ulike kulturtider. Benmargsceller ble suspendert i 24 ml kulturmedium med 10 ng/ml GM-CSF og IL-4 og frø i en 6-brønns plate. BF, før du endrer kulturmedium; AF, etter å ha endret kulturmediet. Rød pil, DC-koloni. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Antall og renhet for domenekontrollere på ulike kulturtider. (A) Totalt antall celler i alle kulturmedier. (B) Representative bilder av DCs. (C,D) Flow cytometrisk og grafisk representasjon av analysen av andelen DCs. Positive celler ble sortert etter CD11c. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Uttrykket av kostimulatoriske molekyler i domenekontrollere. (A) Uttrykket av CD11c, CD80 og MHC ΙΙ i DCs. (B) Flow cytometrisk analyse av andelen av CD11c og CD80 dobbeltpositive, CD11c og MHC ΙΙ dobbeltpositive og trippelpositive celler. (C, D) Flow cytometrisk analyse fra dag 6- dag 10 og grafisk representasjon for å vise den statistiske analysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mennesker og mus har forskjellige DC-delsett, inkludert klassiske domenekontrollere (CDCC-er, inkludert cDC1s og cDC2s) plasmacytoid-domenekontrollere (PDC-er) og monocytt-avledede domenekontrollere (MoDC)9,10,11. Det er generelt akseptert at cDC1s regulerer cytotoksisk T-lymfocytt (CTL) respons på intracellulære patogener og kreft, og cDC2s regulerer immunresponsen på ekstracellulære patogener, parasitter og allergener12. Et betydelig antall domenekontrollere kan produseres in vitro fra BM-stamceller hos mus i nærvær av GM-CSF og IL-4 6,13,14. Renheten og mengden domenekontrollere spiller nøkkelroller i vellykket DC-immunterapi. Forskere har vist at to doser på 1 x 105 til 1 x 106 DCer kan fremkalle effektive cytotoksiske T-lymfocytt (CTL) svar i en xenograftmodell 15,16,17,18. Dette innebærer at et høyt antall DCer med høy renhet må dyrkes for å undersøke DCs rolle i tumorimmunoterapi ytterligere.
Den tradisjonelle metoden for å skaffe benmargsceller er å kutte de to endene av lårbenet og skylle med mediet 6,7. I denne studien brukte vi innovativt fysiologiske anatomiske strukturer for å kutte lårbenet. Hemostatiske tang ble brukt til å klemme den nedre enden av lårbenet og flytte den lateralt. Epifyseallinjen er fysiologisk svak, noe som gjør dem utsatt for brudd når de er stresset19. Etter at lårbenet er skilt fra epifyseallinjen, forblir en liten mengde bein i marghulen. Nålen kan lett trenge inn i beinet i benmargshulen. Metoden er enkel å betjene, beskytter dyrebare benmargsceller, og gir et cellulært grunnlag for kulturen til et høyt antall domenekontrollere. Vi dyrket domenekontrollerne ved hjelp av en kombinasjon av 10 ng/ml GM-CSF og 10 ng/ml IL-4, noe som bidrar mer til modning av domenekontrollere enn GM-CSF alene. Labeur og Son rapporterte at den kombinerte bruken av GM-CSF og IL-4 i mediet av domenekontrollere induserte høyere uttrykk for modningsmarkører, som IFN-ɣ, TNF-α og IL-6, og forbedret antigen-presentasjonsevne 7,20,21. Son et al. foreslo også at kombinasjonen av GM-CSF og IL-4 fremmer modning av domenekontrollere 7,21.
I denne studien dyrket vi direkte de oppsamlede benmargscellene uten å lyse erytrocyttene og separert dem ved gradient sentrifugering, noe som kan føre til celletap og til slutt til en reduksjon i høstede domenekontrollere. Før mediet ble endret, var det flere suspenderende celler i kultursystemet, inkludert erytrocytter, T-celler, B-celler og granulocytter. Under samkulturen kan disse cellene produsere cytokiner for å fremme modning av domenekontrollere.
Når det gjelder begrensninger, brukte denne protokollen bare to lårben av musen, unntatt de mindre tibias, noe som resulterte i tap av noen mesenchymale stamceller. Kort sagt utviklet vi en kostnadseffektiv og effektiv protokoll for isolering og generering av benmargsavledede dendrittiske celler fra mus, som bare tar 10 minutter å skille benmargsceller. Et stort antall DCer med høy renhet ble høstet etter 6 dager til 7 dager med inkubasjon med 10 ng/ml GM-CSF og IL-4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer at de ikke har noen interessekonflikter og at de ikke har noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Program of Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 og TJWJ202021QN034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
