Summary
Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.
Abstract
Die Nachfrage nach dendritischen Zellen (DCs) steigt allmählich mit fortschreitender immunbiologischer Forschung. DCs sind jedoch in allen Geweben selten. Die traditionelle Methode zur Isolierung von DCs beinhaltet in erster Linie die Induktion der Knochenmarkdifferenzierung (BM) in DCs durch Injektion großer Dosen (>10 ng / ml) von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor / Interleukin-4 (GM-CSF / IL-4), was das Verfahren komplex und teuer macht. In diesem Protokoll wurden unter Verwendung aller BM-Zellen, die in 10 ng / mL GM-CSF / IL-4-Medium kultiviert wurden, nach 3-4 Halbkulturaustausch bis zu 2,7 x 10 7 CD11c + -Zellen (DCs) pro Maus (zwei Oberschenkelknochen) mit einer Reinheit von 80% -95% geerntet. Nach 10 Tagen in Kultur nahm die Expression von CD11c, CD80 und MHC II zu, während die Anzahl der Zellen abnahm. Die Anzahl der Zellen erreichte nach 7 Tagen Kultur ihren Höhepunkt. Darüber hinaus dauerte diese Methode nur 10 Minuten, um alle Knochenmarkzellen zu ernten, und eine hohe Anzahl von DCs wurde nach 1 Woche Kultur erhalten.
Introduction
Dendritische Zellen (DCs) sind die stärksten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) zur Aktivierung naiver T-Zellen und zur Induktion spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten-Reaktionen (CTL) gegen Infektionskrankheiten, Allergieerkrankungen und Tumorzellen 1,2,3. DCs sind das primäre Bindeglied zwischen angeborener Immunität und adaptiver Immunität und spielen eine wesentliche Rolle bei der immunologischen Abwehr und der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz. In den letzten 40 Jahren haben viele Forscher versucht, die Untergruppen von DCs und ihre Funktionen bei Entzündungen und Immunität zu definieren. Nach diesen Studien entwickeln sich DCs entlang der myeloischen und lymphatischen Linien aus Knochenmarkzellen. Tumorimpfstoffe haben in den letzten Jahren bedeutende Meilensteine erreicht und haben eine vielversprechende Zukunft. Mechanisch modulieren Tumorimpfstoffe die Immunantwort und verhindern das Tumorwachstum, indem sie zytotoxische T-Lymphozyten mit Hilfe von Tumorantigenen aktivieren. Der auf DCs basierende Impfstoff spielt eine wichtige Rolle in der Tumorimmuntherapie und wurde als eine der vielversprechendsten Anti-Tumor-Therapienidentifiziert 1,4. Darüber hinaus wurden DCs häufig bei der Erprobung neuer molekular ausgerichteter Medikamente und Immun-Checkpoint-Inhibitoreneingesetzt 5.
Forscher benötigen dringend eine hohe Anzahl von hochreinen DCs, um die Rolle von DCs weiter zu untersuchen. DCs sind jedoch in verschiedenen Geweben und Blut selten und machen nur 1% der Blutzellen bei Menschen und Tieren aus. Die In-vitro-Kultur von dendritischen Knochenmarkzellen (BMDC) ist eine wichtige Methode, um große Mengen an DC-Zellen zu erhalten. In der Zwischenzeit wurde das Lutz-Protokoll zur Erzeugung von DCs aus Knochenmark von Forschernhäufig verwendet 6. Obwohl das Protokoll bei der Gewinnung von DC-Zellen wirksam ist, ist es komplex und teuer und beinhaltet die Zugabe hoher Konzentrationen von Zytokinen und die Lyse von roten Blutkörperchen.
In dieser Studie berichten wir über eine Methode zur Isolierung fast aller Knochenmarkzellen aus dem Knochenmark (BM) der Maus und zur Induktion der Differenzierung in BMDC nach 7-9 Tagen Inkubation in vitro, mit einer niedrigeren Konzentration von GM-CSF und IL-4. Dieses Verfahren dauert nur 10 Minuten, um fast alle Knochenmarkzellen zu entnehmen und sie in einem vollständigen Medium zu suspendieren. Kurz gesagt, wir bieten eine effiziente und kostengünstige Kultivierungsmethode für BMDC in dieser Forschung.
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Protocol
Alle Verfahren wurden vom Nanjing Medical University Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Isolierung des Knochenmarks und Präparation der BM-Zellen
- Opfern Sie C57BL/6-Mäuse (18-22 g, 6-8 Wochen alt) durch CO2 -Erstickung. Korrigieren Sie die Maus auf dem Operationstisch der Maus. Desinfizieren Sie die Oberflächen mit 70% Ethanol.
- Schneiden Sie die Haut des Beins ab, um die Muskeln und die Oberschenkelarterie freizulegen. Klemmen und reißen Sie die Oberschenkelarterie mit zwei Pinzetten ab und ziehen Sie dann das proximale Ende in Richtung Bauch.
HINWEIS: Schneiden Sie die Oberschenkelarterie nicht direkt ab. Andernfalls verursacht es übermäßige Blutungen und kontaminiert das Sichtfeld. - Schneiden Sie alle Muskeln um den Oberschenkelknochen ab.
- Strecken Sie die unteren Gliedmaßen der Maus langsam nach außen, bis das Geräusch einer Hüftgelenksluxation zu hören ist und der Oberschenkelkopfprolaps sichtbar ist.
- Trennen Sie die unteren Gliedmaßen vom Körper mit einer Schere entlang der Innenseite des Hüftkopfes.
- Schneiden Sie die Hinterbeine vom Ende des Kniegelenks ab, um einen freien und vollständigen Femur zu erhalten.
- Entfernen Sie die am Femur befestigten Muskeln mit Gaze.
HINWEIS: Zerreißen Sie die Muskeln nicht direkt. Der Oberschenkelknochen von Mäusen ist empfindlich, seine Integrität muss erhalten bleiben. - Den Femur für 2-5 min in 75% Alkohol tauchen.
2. Induktionskultur des BMDC
- Spülen Sie den Restalkohol mit PBS ab. Verwenden Sie eine hämostatische Pinzette, um den mittleren und unteren Teil des Femurs zu klemmen, und einen anderen Satz, um das untere Ende des Femurs zu klemmen. Die hämostatische Pinzette wird seitlich auf den Femur aufgetragen, und der Femur wird von der Epiphysenlinie getrennt.
HINWEIS: Die epiphysäre Linie ist nicht leicht sichtbar, bis der Femur bricht. Dies und die nächsten Schritte werden alle in einer sterilen Umgebung durchgeführt. - Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze (Nadel: 0,6 mm x 25 mm), um die Knochenmarkhöhle aus dem Epiphysenlinienbruch zu durchdringen und die Nadel zu drehen, um den Oberschenkelkopf und die Knochenmarkhöhle zu durchdringen. Pulsieren und spülen Sie die Knochenmarkhöhle mit 1 ml des vollständigen Mediums, das GM-CSF/IL-4 enthält, bis der Knochen weiß wird.
HINWEIS: Komplettes Kulturmedium: 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, 55 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng/mL GM-CSF und 10 ng/mL IL-4. - Resuspendiert alle Zellen in 24 ml vollständigem Kulturmedium (~5 x 105 Zellen/ml). Nach dem Mischen wurde das gesamte Medium auf einer 6-Well-Platte mit 4 ml/Well ausgesät und dann bei 37 °C mit 5% CO 2 für2 Tage inkubiert.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, Erythrozyten zu lysen. - Ersetzen Sie das gesamte Medium nach 2 Tagen durch ein Medium, das GM-CSF/IL-47 enthält. Ersetzen Sie am vierten, sechsten und achten Tag die Hälfte des Mediums durch das vollständige Medium, das 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 enthält.
HINWEIS: In diesem Schritt werden suspendierte Zellen wie Erythrozyten und Lymphozyten entfernt. - Machen Sie jeden Tag Fotos, um das Zellwachstum aufzuzeichnen. Ernten Sie ab dem sechsten Tag eine Zellquelle pro Tag, um die Zellzahl zu zählen und CD11c, CD80 und MHC II-Expression 6,7 nachzuweisen.
3. Durchflusszytometrische Detektion der Expression von CD11c, CD80 und MHC II
- Nach dem Waschen der DCs mit PBS 1 x 106 Zellen in 100 μL FACS-Puffer resuspendieren, 0,5 μg Anti-Maus-CD16/32-Antikörper hinzufügen und 10 Minuten auf Eis inkubieren, um unspezifische Antigenstellen zu blockieren.
- 1 μg Percp/cy5,5-CD11c, 0,5 μg PE-CD80 und 0,04 μg APC-MHC II-Antikörper zugeben und 30 min auf Eis inkubieren.
- Bei 1.000 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand entfernen, 1 ml 4% Paraformaldehyd hinzufügen, für 30 min bei 4 °C fixieren und in 300 μL FACS-Puffer wieder suspendieren.
- Durchflusszytometrie durchführen.
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Representative Results
Die 1 x 10 7-1,7 x 107 Zellen wurden aus zwei Oberschenkelknochen extrahiert und in 24 ml Medium resuspendiert, bevor sie in eine 6-Well-Platte gepflanzt wurden (Abbildung 1A). Nach 2 Tagen wurden nicht adhärente Zellen durch vollständigen Wechsel des Kulturmediums entfernt. Vor dem Wechsel des Mediums wurde eine signifikante Anzahl von suspendierten Zellen beobachtet (Abbildung 1B). Nach 3 Tagen Kultur begannen sich kleinzellige Kolonien zu bilden. Am sechsten Tag nahm die Größe und Anzahl der Kolonien deutlich zu. Am siebten Tag erreichte die Anzahl der Zellen ihren Höhepunkt (22 x 10 6-27 x 106) und sank dann allmählich (Abbildung 2A). Die Oberfläche der DC-Zellen wurde mit längeren Pseudopodien rau und zeigte eine typische reife DC-Zellmorphologie (Abbildung 2B). Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass das Verhältnis von CD11c-positiven zu Gesamtzellen am sechsten Tag 71% betrug, während das Verhältnis am zehnten Tag auf 96,1% anstieg (Abbildung 2C, 2D).
Um die Expression von kostimulierenden Molekülen zu bewerten, wurden CD11c, CD80 und MHC II 8 co-gefärbt. Wie in Abbildung 3A dargestellt, nahm die Expression von CD11c, CD80 und MHC II mit zunehmender Kultivierungszeit von Tag 6 bis Tag 10 allmählich zu. Darüber hinaus zeigte die durchflusszytometrische Analyse einen allmählichen Anstieg der Anteile von CD11c- und CD80-Doppelpositiv-, CD11c- und MHCII-Doppelpositivzellen (Abbildung 3B, 3D) und dreifach-positiven Zellen (Abbildung 3C, 3D).
Abbildung 1: Repräsentative Bilder von DCs zu verschiedenen Kulturzeiten . (A) Flussdiagramm des Anbaus von BMDC. (B) Repräsentative Bilder von DCs zu verschiedenen Kulturzeiten. Knochenmarkzellen wurden in 24 ml Kulturmedium mit 10 ng/mL GM-CSF und IL-4 suspendiert und in einer 6-Well-Platte ausgesät. BF, vor dem Wechsel des Kulturmediums; AF, nach dem Wechsel des Kulturmediums. Roter Pfeil, DC-Kolonie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Anzahl und Reinheit der DCs zu verschiedenen Kulturzeiten. (A) Gesamtzahl der Zellen in allen Kultursubstraten. (B) Repräsentative Bilder von DCs. (C,D) Durchflusszytometrische und grafische Darstellung der Analyse des Anteils von DCs. Positive Zellen wurden nach CD11c sortiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Expression von kostimulierenden Molekülen in DCs. (A) Die Expression von CD11c, CD80 und MHC ΙΙ in DCs. (B) Durchflusszytometrische Analyse des Anteils von CD11c und CD80 doppelpositiven, CD11c und MHC ΙΙ doppelt positiven und dreifach-positiven Zellen. (C, D) Durchflusszytometrische Analyse von Tag 6 - Tag 10 und grafische Darstellung zur Darstellung der statistischen Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Menschen und Mäuse haben unterschiedliche DC-Untergruppen, einschließlich klassischer DCs (cDCs, einschließlich cDC1s und cDC2s), plasmazytoider DCs (pDCs) und Monozyten-abgeleiteter DCs (MoDCs) 9,10,11. Es ist allgemein anerkannt, dass cDC1s zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen (CTL) auf intrazelluläre Krankheitserreger und Krebs und cDC2s Immunantworten auf extrazelluläre Krankheitserreger, Parasiten und Allergene regulieren12. Eine signifikante Anzahl von DCs kann in vitro aus BM-Vorläuferzellen in Mäusen in Gegenwart von GM-CSF und IL-4 6,13,14 hergestellt werden. Die Reinheit und Menge der DCs spielen eine Schlüsselrolle für eine erfolgreiche DC-Immuntherapie. Forscher haben gezeigt, dass zwei Dosen von 1 x 105 bis 1 x 106 DCs in einem Xenograft-Modell15,16,17,18 effiziente zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen (CTL) hervorrufen könnten. Dies bedeutet, dass eine hohe Anzahl von hochreinen DCs kultiviert werden muss, um die Rolle von DCs in der Tumorimmuntherapie weiter zu untersuchen.
Die traditionelle Methode zur Gewinnung von Knochenmarkzellen besteht darin, die beiden Enden des Femurs zu schneiden und mit dem Medium 6,7 zu spülen. In dieser Studie haben wir auf innovative Weise physiologische anatomische Strukturen verwendet, um den Femur zu durchtrennen. Hämostatische Pinzetten wurden verwendet, um das untere Ende des Femurs zu klemmen und seitlich zu bewegen. Die Epiphysenlinie ist physiologisch schwach, was sie anfällig für Frakturen macht, wenn sie gestresstsind 19. Nachdem der Femur von der Epiphysenlinie getrennt wurde, verbleibt eine kleine Menge Knochen in der Knochenhöhle. Die Nadel kann leicht in den Knochen in die Knochenmarkhöhle eindringen. Die Methode ist einfach zu bedienen, schützt wertvolle Knochenmarkzellen und bietet eine zelluläre Grundlage für die Kultur einer hohen Anzahl von DCs. Wir kultivierten die DCs mit einer Kombination aus 10 ng/mL GM-CSF und 10 ng/mL IL-4, was mehr zur Reifung von DCs beiträgt als GM-CSF allein. Labeur und Son berichteten, dass die kombinierte Verwendung von GM-CSF und IL-4 im Medium von DCs eine höhere Expression von Reifungsmarkern wie IFN-ɣ, TNF-α und IL-6 und eine verbesserte Antigen-präsentierende Fähigkeit 7,20,21 induzierte. Son et al. schlugen auch vor, dass die Kombination von GM-CSF und IL-4 die Reifung der DCs 7,21 fördert.
In dieser Studie kultivierten wir die gesammelten Knochenmarkzellen direkt, ohne die Erythrozyten zu lysieren, und trennten sie durch Gradientenzentrifugation, was zu Zellverlust und letztendlich zu einer Verringerung der geernteten DCs führen kann. Bevor das Medium gewechselt wurde, gab es mehrere suspendierende Zellen im Kultursystem, darunter Erythrozyten, T-Zellen, B-Zellen und Granulozyten. Während der Kokultur können diese Zellen Zytokine produzieren, um die Reifung von DCs zu fördern.
In Bezug auf die Einschränkungen verwendete dieses Protokoll nur zwei Oberschenkelknochen der Maus, mit Ausnahme der kleineren Tibias, was zum Verlust einiger mesenchymaler Stammzellen führte. Kurz gesagt, wir haben ein kostengünstiges und effizientes Protokoll für die Isolierung und Erzeugung von dendritischen Knochenmarkzellen aus Mäusen entwickelt, das nur 10 Minuten benötigt, um Knochenmarkzellen zu trennen. Eine große Anzahl von hochreinen DCs wurde nach 6 Tagen bis 7 Tagen Inkubation mit 10 ng/ml GM-CSF und IL-4 geerntet.
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Disclosures
Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben und dass sie nichts offenzulegen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Programm des Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 und TJWJ202021QN034) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
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