Summary
Nous présentons ici une méthode économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de haute pureté à partir de souris après 7 jours de culture avec 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.
Abstract
La demande de cellules dendritiques (DC) augmente progressivement à mesure que la recherche en immunologie progresse. Cependant, les DC sont rares dans tous les tissus. La méthode traditionnelle d’isolement des DC consiste principalement à induire la différenciation de la moelle osseuse (BM) dans les DC en injectant de fortes doses (>10 ng / mL) de facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages / interleukine-4 (GM-CSF / IL-4), ce qui rend la procédure complexe et coûteuse. Dans ce protocole, en utilisant toutes les cellules BM cultivées dans un milieu GM-CSF/IL-4 de 10 ng/mL, après 3-4 échanges de demi-culture, jusqu’à 2,7 x 107 cellules CD11c+ (DC) par souris (deux fémurs) ont été récoltées avec une pureté de 80% à 95%. Après 10 jours en culture, l’expression de CD11c, CD80 et MHC II a augmenté, tandis que le nombre de cellules a diminué. Le nombre de cellules a culminé après 7 jours de culture. De plus, cette méthode n’a pris que 10 minutes pour prélever toutes les cellules de la moelle osseuse, et un nombre élevé de DC ont été obtenus après 1 semaine de culture.
Introduction
Les cellules dendritiques (DC) sont les cellules présentatrices d’antigènes (APC) les plus puissantes pour activer les lymphocytes T naïfs et induire des réponses spécifiques aux lymphocytes T cytotoxiques (CTL) contre les maladies infectieuses, les maladies allergiques et les cellules tumorales 1,2,3. Les DC sont le principal lien entre l’immunité innée et l’immunité adaptative et jouent un rôle essentiel dans la défense immunologique et le maintien de la tolérance immunitaire. Au cours des 40 dernières années, de nombreux chercheurs ont cherché à définir les sous-ensembles de DC et leurs fonctions dans l’inflammation et l’immunité. Selon ces études, les DC se développent le long des lignées myéloïdes et lymphoïdes des cellules de la moelle osseuse. Les vaccins tumoraux ont franchi des étapes importantes ces dernières années et ont un avenir prometteur. Mécaniquement, les vaccins tumoraux modulent la réponse immunitaire et empêchent la croissance tumorale en activant les lymphocytes T cytotoxiques à l’aide d’antigènes tumoraux. Le vaccin à base de DC joue un rôle important dans l’immunothérapie tumorale et a été identifié comme l’une des thérapies antitumorales les plus prometteuses 1,4. En outre, les DC ont été largement utilisés dans le test de nouveaux médicaments moléculaires ciblés et d’inhibiteurs du point de contrôle immunitaire5.
Les chercheurs ont un besoin urgent d’un grand nombre de DC de haute pureté pour étudier plus avant le rôle des DC. Cependant, les DC sont rares dans divers tissus et sang, ne représentant que 1% des cellules sanguines chez les humains et les animaux. La culture in vitro de cellules dendritiques de la moelle osseuse (BMDC) est une méthode importante pour obtenir de grandes quantités de cellules DC. Pendant ce temps, le protocole Lutz pour générer des DC à partir de la moelle osseuse a été largement utilisé par les chercheurs6. Bien que le protocole soit efficace pour obtenir des cellules DC, il est complexe et coûteux, impliquant l’ajout de fortes concentrations de cytokines et la lyse des globules rouges.
Dans cette étude, nous rapportons une méthode pour isoler presque toutes les cellules de la moelle osseuse de la moelle osseuse (BM) de souris et induire une différenciation en BMDC après 7-9 jours d’incubation in vitro, avec une concentration plus faible de GM-CSF et d’IL-4. Cette procédure ne prend que 10 minutes pour prélever presque toutes les cellules de la moelle osseuse et les suspendre dans un milieu complet. En bref, nous fournissons une méthode de culture efficace et rentable pour BMDC dans cette recherche.
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Protocol
Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Nanjing.
1. Isolement de la moelle osseuse et préparation des cellules BM
- Sacrifier des souris C57BL/6 (18-22 g, âgées de 6-8 semaines) par asphyxie au CO2 . Réparez la souris sur la table d’opération de la souris. Désinfectez les surfaces avec de l’éthanol à 70%.
- Coupez la peau de la jambe pour exposer les muscles et l’artère fémorale. Serrez et arrachez l’artère fémorale à l’aide de deux pinces, puis tirez l’extrémité proximale vers l’abdomen.
REMARQUE: Ne coupez pas directement l’artère fémorale. Sinon, il provoquera des saignements excessifs et contaminera le champ de vision. - Coupez tous les muscles autour du fémur.
- Étirez lentement les membres inférieurs de la souris vers l’extérieur jusqu’à ce que le bruit de luxation de l’articulation de la hanche se fasse entendre et que le prolapsus de la tête fémorale soit visible.
- Séparez les membres inférieurs du corps à l’aide de ciseaux le long de l’intérieur de la tête fémorale.
- Coupez les pattes postérieures de l’extrémité de l’articulation du genou pour obtenir un fémur libre et complet.
- Retirez les muscles attachés au fémur à l’aide de gaze.
REMARQUE: Ne déchirez pas directement les muscles. Le fémur des souris est délicat, son intégrité doit être maintenue. - Immerger le fémur dans de l’alcool à 75% pendant 2-5 min.
2. Culture d’induction du BMDC
- Rincer l’alcool résiduel avec du PBS. Utilisez une pince hémostatique pour serrer la partie centrale et inférieure du fémur et un autre ensemble pour serrer l’extrémité inférieure du fémur. Les pinces hémostatiques sont appliquées latéralement sur le fémur et le fémur est séparé de la ligne épiphysaire.
REMARQUE: La ligne épiphysaire n’est pas facilement visible jusqu’à ce que le fémur se fracture. Cette étape et les suivantes sont toutes effectuées dans un environnement stérile. - Utilisez une seringue de 1 mL (aiguille : 0,6 mm x 25 mm) pour pénétrer dans la cavité de la moelle osseuse à partir de la rupture épiphysaire de la ligne et faites pivoter l’aiguille pour pénétrer dans la tête fémorale et à travers la cavité de la moelle osseuse. Pulser et rincer la cavité de la moelle osseuse en utilisant 1 mL du milieu complet contenant GM-CSF/IL-4 jusqu’à ce que l’os devienne blanc.
REMARQUE : Milieu de culture complet : 10 % FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine, 55 μM β-mercaptoéthanol, 10 ng/mL GM-CSF et 10 ng/mL IL-4. - Remettre en suspension toutes les cellules dans 24 mL de milieu de culture complet (~5 x 105 cellules/mL). Après mélange, tout le milieu a été ensemencé sur une plaque de 6 puits avec 4 mL/puits, puis incubé à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 2 jours.
REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de lyser les érythrocytes. - Remplacer tout le milieu après 2 jours par un milieu contenant du GM-CSF/IL-47. Les quatrième, sixième et huitième jours, remplacer la moitié du milieu par le milieu complet contenant 10 ng/mL gm-CSF/IL-4.
REMARQUE: Dans cette étape, les cellules en suspension telles que les érythrocytes et les lymphocytes sont enlevées. - Prenez des photos tous les jours pour enregistrer la croissance cellulaire. À partir du sixième jour, récoltez un puits de cellules par jour pour compter le nombre de cellules et détecter l’expression de CD11c, CD80 et MHC II 6,7.
3. Détection cytométrique en flux de l’expression de CD11c, CD80 et MHC II
- Après avoir lavé les DC avec du PBS, remettre en suspension 1 x 106 cellules dans 100 μL de tampon FACS, ajouter 0,5 μg d’anticorps anti-souris CD16/32 et incuber pendant 10 min sur de la glace pour bloquer les sites d’antigènes non spécifiques.
- Ajouter 1 μg de Percp/cy5.5-CD11c, 0,5 μg de PE-CD80 et 0,04 μg d’anticorps APC-CMHC II, et incuber sur de la glace pendant 30 min.
- Centrifuger à 1 000 x g pendant 3 min à 4 °C, retirer le surnageant, ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4 %, fixer pendant 30 min à 4 °C et remettre en suspension dans 300 μL de tampon FACS.
- Effectuer une cytométrie en flux.
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Representative Results
Les cellules 1 x 10 7-1,7 x 107 ont été extraites de deux fémurs et ont été remises en suspension dans 24 mL de milieu avant d’être plantées dans une plaque de 6 puits (Figure 1A). Après 2 jours, les cellules non adhérentes ont été éliminées en changeant complètement le milieu de culture. Avant de changer de milieu, un nombre important de cellules en suspension ont été observées (figure 1B). Après 3 jours de culture, de petites colonies cellulaires ont commencé à se former. Le sixième jour, la taille et le nombre de colonies ont considérablement augmenté. Le septième jour, le nombre de cellules a culminé (22 x 106-27 x 106) puis a diminué progressivement (Figure 2A). La surface des cellules DC est devenue rugueuse avec des pseudopodes plus longs, présentant une morphologie cellulaire DC mature typique (Figure 2B). L’analyse cytométrique en flux a montré que le rapport entre cd11c positif et le nombre total de cellules était de 71 % le sixième jour, tandis que le ratio augmentait à 96,1 % le dixième jour (Figure 2C,2D).
Pour évaluer l’expression des molécules co-stimulatrices, CD11c, CD80 et MHC II ont été co-colorés8. Comme le montre la figure 3A, l’expression de CD11c, CD80 et MHC II a progressivement augmenté avec l’augmentation du temps de culture du jour 6 au jour 10. De plus, l’analyse cytométrique en flux a montré une augmentation progressive des proportions de cellules CD11c et CD80 double-positives, CD11c et MHCII double-positives (Figure 3B,3D) et triple-positives (Figure 3C,3D).
Figure 1: Images représentatives des DC à différents moments de culture. (A) Organigramme de la culture du BMDC. (B) Images représentatives des pays en développement à différents moments de la culture. Les cellules de la moelle osseuse ont été mises en suspension dans 24 mL de milieu de culture avec 10 ng/mL de LCR GM-CSF et IL-4 et ensemencées dans une plaque de 6 puits. BF, avant de changer de milieu de culture; AF, après avoir changé de milieu de culture. Flèche rouge, colonie DC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Nombre et pureté des DC à différents moments de culture. (A) Nombre total de cellules dans tous les milieux de culture. (B) Images représentatives des DC. (C,D) Représentation cytométrique en flux et graphique de l’analyse de la proportion de DC. Les cellules positives ont été triées par CD11c. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : L’expression des molécules co-stimulatrices dans les DC. (A) L’expression de CD11c, CD80 et MHC ΙΙ dans les DC. (B) Analyse cytométrique en flux de la proportion de cellules CD11c et CD80 double-positives, CD11c et MHC ΙΙ double positif et triple-positif. (C, D) Analyse cytométrique en flux du jour 6 au jour 10 et représentation graphique pour montrer l’analyse statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les humains et les souris ont des sous-ensembles de DC différents, y compris les DC classiques (cDC, y compris les cDC1 et cDC2), les DC plasmocytoïdes (pDC) et les DC dérivés de monocytes (MoDC)9,10,11. Il est généralement admis que les cDC1 régulent les réponses des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) aux agents pathogènes intracellulaires et au cancer, et les cDC2 régulent les réponses immunitaires aux agents pathogènes extracellulaires, aux parasites et aux allergènes12. Un nombre important de DC peuvent être produits in vitro à partir de cellules progénitrices BM chez la souris en présence de GM-CSF et d’IL-4 6,13,14. La pureté et la quantité de DC jouent un rôle clé dans le succès de l’immunothérapie DC. Les chercheurs ont montré que deux doses de 1 x 105 à 1 x 106 DC pourraient provoquer des réponses efficaces aux lymphocytes T cytotoxiques (CTL) dans un modèle de xénogreffe 15,16,17,18. Cela implique qu’un grand nombre de DC de haute pureté doivent être cultivés pour étudier plus avant le rôle des DC dans l’immunothérapie tumorale.
La méthode traditionnelle d’obtention de cellules de moelle osseuse consiste à couper les deux extrémités du fémur et à rincer avec le milieu 6,7. Dans cette étude, nous avons utilisé de manière innovante des structures anatomiques physiologiques pour couper le fémur. Des pinces hémostatiques ont été utilisées pour serrer l’extrémité inférieure du fémur et le déplacer latéralement. La ligne épiphysaire est physiologiquement faible, ce qui les rend sensibles aux fractures lorsqu’ils sont stressés19. Une fois le fémur séparé de la ligne épiphysaire, il reste une petite quantité d’os dans la cavité de la moelle. L’aiguille peut facilement pénétrer l’os dans la cavité de la moelle osseuse. La méthode est simple à utiliser, protège les précieuses cellules de la moelle osseuse et fournit une base cellulaire pour la culture d’un grand nombre de DC. Nous avons cultivé les DC en utilisant une combinaison de 10 ng/ mL GM-CSF et 10 ng / mL IL-4, ce qui contribue davantage à la maturation des DC que GM-CSF seul. Labeur et Son ont rapporté que l’utilisation combinée de GM-CSF et d’IL-4 dans le milieu des DC induisait une expression plus élevée des marqueurs de maturation, tels que l’IFN-ɣ, le TNF-α et l’IL-6, et améliorait la capacité de présentation de l’antigène 7,20,21. Son et al. ont également proposé que la combinaison de GM-CSF et d’IL-4 favorise la maturation des DC 7,21.
Dans cette étude, nous avons directement cultivé les cellules de moelle osseuse collectées sans lyser les érythrocytes et les avons séparées par centrifugation par gradient, ce qui peut entraîner une perte cellulaire et, en fin de compte, une réduction des DC récoltés. Avant que le milieu ne soit modifié, il y avait plusieurs cellules en suspension dans le système de culture, y compris les érythrocytes, les lymphocytes T, les cellules B et les granulocytes. Au cours de la co-culture, ces cellules peuvent produire des cytokines pour favoriser la maturation des DC.
En termes de limitations, ce protocole n’utilisait que deux fémurs de la souris, à l’exclusion des tibias plus petits, ce qui entraînait la perte de certaines cellules souches mésenchymateuses. En bref, nous avons développé un protocole rentable et efficace pour l’isolement et la génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris, qui ne prend que 10 minutes pour séparer les cellules de la moelle osseuse. Un grand nombre de DC de haute pureté ont été récoltés après 6 jours à 7 jours d’incubation avec 10 ng/ mL de GM-CSF et d’IL-4.
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Disclosures
Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts et qu’ils n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le programme du plan scientifique et technologique de Tianjin (20JCQNJC00550), le projet des sciences et technologies de la santé de Tianjin (TJWJ202021QN033 et TJWJ202021QN034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
