Summary
I fortiden, var små dyr bestråling normalt udføres uden evnen til at målrette en vel afgrænset tumor volumen. Målet var at efterligne behandling af menneskelige glioblastom i rotter. Brug en lille dyr bestråling platform, udført vi Mr-vejledt 3D conformal bestråling med PET-baseret sub volumen styrke i prækliniske omgivelser.
Abstract
I årtier, var små dyr stråling forskning for det meste udføres ved hjælp af temmelig rå eksperimentelle opsætninger anvende simple single-beam teknikker uden mulighed for at målrette en bestemt eller godt afgrænset tumor volumen. Levering af stråling blev opnået ved hjælp af faste strålingskilder eller lineære acceleratorer producerer megavoltage (MV) røntgenbilleder. Disse enheder er i stand til at opnå sub millimeter præcision kræves for små dyr. Desuden, de høje doser leveret til sund omkringliggende væv hæmmer svar vurdering. For at øge oversættelse mellem små dyreforsøg og mennesker, var vores mål at efterligne behandling af menneskelige glioblastom i en rotte model. Hvis du vil aktivere en mere præcis bestråling i prækliniske omgivelser, for nylig, blev præcision image-vejledt små dyr stråling forskningsplatforme udviklet. Svarende til menneskelige planlægningssystemer, behandling planlægning på disse mikro-irradiators er baseret på computertomografi (CT). Lav bløddelene kontrast på CT gør det imidlertid meget udfordrende at lokalisere mål i visse væv, som hjernen. Derfor ville indlemmede magnetisk resonans imaging (MR), som har fremragende bløddelene kontrast i forhold til CT, give en mere præcis afgrænsning af målet for bestråling. I sidst fik årti også biologiske Billeddannende teknikker, såsom positron emission tomografi (PET) interesse for stråling terapi behandling vejledning. PET gør det muligt for visualisering af fx, glucose forbrug, aminosyre transport eller hypoxi, til stede i tumor. Rettet mod de meget proliferativ eller radio-resistente dele af tumor med en højere dosis kunne give en overlevelse fordel. Denne hypotese førte til indførelsen af biologiske tumor volumen (BTV), ud over den konventionelle brutto destinationsenheden (GTV), kliniske destinationsenheden (CTV) og planlagte destinationsenheden (PTV).
De prækliniske imaging lab af Gent Universitet er en mikro-irradiator, et lille dyr PET og en 7 T lille dyr Mr tilgængelige. Målet var at inkorporere Mr-vejledt bestråling og PET-styrede sub volumen styrke i en glioblastom rotte model.
Introduction
High-Grade gliom er den mest almindelige og mest aggressive ondartet hjernesvulst hos voksne med en median overlevelse på 1 år trods nuværende behandlingsmodaliteter. Standarden for pleje omfatter maksimal kirurgisk resektion efterfulgt af kombinerede ekstern strålebehandling strålebehandling (RT) og temozolomide (TMZ), efterfulgt af vedligeholdelse TMZ1,2,3. Siden indførelsen af TMZ nu mere end 15 år siden, er der sket ingen væsentlige forbedringer i behandlingen af disse tumorer. Derfor er gennemførelsen af nye terapeutiske strategier presserende men undersøges først i små dyr kræft terapi modeller (for det meste mus og rotter). Tumor-bærende gnavere modeller kan bruges til at undersøge effekten af nye og komplekse stråling protokoller, eventuelt kombineret med andre (ny) behandling agenter, at vurdere stråling svar eller at undersøge radio-beskyttende agenter. En stor fordel af prækliniske stråling forskning er evnen til at arbejde under kontrollerede eksperimentelle betingelser ved hjælp af store kohorter resulterer i fremskyndede data udbytte på grund af den kortere levetid af gnavere. Prækliniske resultaterne bør derefter oversættes til et klinisk forsøg på en meget hurtigere og mere effektiv måde end i aktuelle praksis4.
Små dyr stråling eksperimenter i de sidste årtier har typisk opnået ved hjælp af faste stråling kilder5,6,7, f.eks., 137Cs og 60Co, isotoper, eller lineær acceleratorer beregnet til human klinisk brug, anvender en enkelt strålingsfelt med MV x-stråler6,8,9,10,11. Men når disse anordninger ikke sub millimeter præcision, hvilket er nødvendigt for små dyr12. Derudover har MV x-stråler karakteristika uegnet til bestråling små mål, såsom en dosis ophobning på grænsefladen luft-væv i regionen indgangen af stråle med en grad i størrelsesordenen dyret størrelse sig4,6 ,8,9,10,11. Sidstnævnte gør det ganske udfordrende at levere en ensartet dosis til en tumor mens besparende omgivende normale hjerne væv4,8,9,10,11. Derfor er det uklart, i hvilket omfang nuværende dyreforsøg stadig er relevante for moderne RT praksis12. I denne henseende, nyligt udviklede tredimensionale (3D) conformal små dyr mikro-irradiators er lovende at slå bro over den teknologiske kløft mellem avancerede 3D image-vejledt RT teknikker, såsom intensitet moduleret strålebehandling (IMRT) eller Conformal lysbuer anvendes i mennesker og nuværende lille dyr bestråling4,13. Disse platforme gøre brug af en kilovoltage (kV) X-ray kilde at opnå skarpe penumbras og undgå dosis opbygning. Disse platforme omfatter en computer-kontrollerede fase for dyr positionering, en kV X-ray kilde til billedbehandling og strålebehandling, en roterende gantry forsamling at give stråling levering fra forskellige vinkler, og et kolliminerende system til at forme stråling strålen 4. i 2011, en mikro-irradiator blev installeret på den prækliniske imaging lab af Gent Universitet (figur 1). Dette system svarer til moderne menneskers strålebehandling praksis og giver mulighed for en bred vifte af prækliniske forsøg, såsom synergien af stråling med andre behandlingsformer, komplekse stråling ordninger og image-vejledt delmål boost undersøgelser.
Behandling planlægning på disse mikro-irradiators er baseret på CT, hvilket svarer til menneskelig planlægning systemer14,15. For CT billeddannelse, der en on-board X-ray detektor bruges i kombination med den samme kV X-ray tube, der bruges under behandling. CT billeddannelse anvendes, da det giver mulighed for nøjagtig animalske positionering og indeholder oplysninger nødvendige for individuelle stråling dosis beregninger via segmentering. Men på grund af den lave bløddelene kontrast i CT billeddannelse, tumorer i hjernen i små dyr såsom high-grade gliom, kan ikke være let afgrænset. Indarbejdelse af multimodalitet imaging er derfor nødvendigt for en nøjagtig target volume afgrænsning. Sammenlignet med CT, giver Mr langt overlegen bløddelene kontrast. Dette gør det meget nemmere at visualisere læsion grænser, som vil resultere i en meget bedre afgrænsning af destinationsdiskenheden, hjælper til bedre bestråle læsion og undgå omkringliggende væv, som illustreret i figur 24, 16. En yderligere fordel er, at Mr bruger ikke-ioniserende stråling, i modsætning til CT, der bruger ioniserende stråling. De større ulemper ved MRI er forholdsvis lang erhvervelse gange og høje driftsomkostninger. Det er vigtigt at bemærke, at Mr-scanninger ikke kan bruges til beregninger af dosis, da de ikke giver de nødvendige elektron tæthed oplysninger, selv om der gøres fremskridt på dette område, også med den seneste udvikling af hr.-LINACS. En kombineret CT/Mr datasæt er den foretrukne metode til planlægning af bestråling af maligne gliom, der indeholder både oplysninger, der kræves for målretning (Mr-baserede diskenheder) og dosis beregninger (CT-baseret elektron tæthed).
For at mindske kløften mellem små dyr bestråling og kliniske rutine, skal Mr klart integreres i arbejdsflow af mikro-irradiator, der kræver en korrekt registrering mellem Mr og CT, som ligger er trivielt. I dette papir, vores protokol for Mr-vejledt 3D conformal bestråling af F98 glioblastom i rotter er diskuteret, offentliggjort som er blevet for nylig17.
Selvom indarbejde CT og Mr i arbejdsprocessen af mikro-irradiator er et klart skridt fremad i små dyr bestråling forskning, tillader disse anatomiske Billeddannende teknikker altid ikke en fuldstændig definition af destinationsdiskenheden. Patologiske ændringer i hjernen på CT og Mr er karakteriseret ved øget vand indhold (ødem) og udsivning af blod - hjerne barrieren eller kontrastforbedring. Men både kontrastforbedring og hyper-intens områder på T2-vægtet Mr er ikke altid en nøjagtig måling af tumor omfang.Tumorcellerne har fundet langt ud over kanten af kontrastforbedring12. Ingen af disse teknikker kan også identificere de mest aggressive dele inden for tumor, som kan være ansvarlig for terapeutisk modstand og tumor recidiv. Derfor, yderligere oplysninger fra molekylær billeddannelse teknikker som PET kan have en merværdi for RT målrette volumen definition, fordi disse teknikker gør det muligt for at visualisere biologiske veje i vivo12,18, 19.
I 2000 indførte Ling et al. begrebet biologisk destinationsenheden (BTV) ved at integrere anatomisk og funktionel billeddannelse i arbejdsprocessen strålebehandling, fører til hvad de kaldte multidimensional conformal strålebehandling20. Dette skaber mulighed for at forbedre dosis målretning ved at levere en uensartet dosis til et målområde ved hjælp af for eksempel PET billeder. Mest anvendte PET tracer for tumor iscenesættelse og for at overvåge behandlingen svar er fluor-18 (18F) mærket fluorodeoxyglucose (FDG), som visualiserer glukose metabolisme21. I hoved og hals kræft, tidligere undersøgelser har vist, at brugen af 18F-FDG PET førte til et bedre estimat af den faktiske tumor volumen, som defineret af de patologiske prøver, sammenlignet med CT og Mr22. I primære hjerne er tumorer, hvor FDG ikke er nyttigt på grund af det meget stærke baggrund signal fra den normale hjerne, aminosyrer, som 11C-methionin og mere nylig 18F-fluoroetthyltyrosine (FET), blevet undersøgt for GTV afgrænsning med ofte markante forskelle mellem aminosyrer PET og MRI-baseret GTVs23. Ingen kommende retssag undersøger betydningen af denne konstatering er imidlertid blevet udført endnu. I denne undersøgelse, har vi valgt aminosyre tracer 18F-FET og hypoksi tracer 18F-fluoroazomycin-arabinoside (18F-FAZA). 18 F-FET og 18F-FAZA blev valgt fordi en øget aminosyre optagelse er stærkt korreleret med spredning sats i GB tumorer, der henviser til, at optagelsen af en hypoxi PET-sporstof er korreleret med modstand (kemo) strålebehandling18 , 23. sub volumen styrke ved hjælp af mikro-irradiator var optimeret ved at give en ekstra stråledosis til en PET-defineret del af F98 GB tumor i rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for dyreforsøg (ECD 09/23 og ECD 12/28). Alle kommercielle detaljer kan findes i Tabel af materialer.
1. F98 GB rotte celle Model
- Kultur F98 GB celler, erhvervet fra ATCC, i encellelag bruger Dulbeccos modificerede Eagle Medium, 10% kalveserum, 1% penicillin, 1% streptomycin, 1% L-glutamin og 0,1% amphotericin b, og placere i en CO2 inkubator (5% CO2 og 37 ° C).
- Podes gliom celler i hjernen hos kvindelige Fischer F344 rotter (kropsvægt 170 g).
- Brug sterile instrumenter og bære sterile handsker på alle tidspunkter.
- Bedøver rotter ved at indsprøjte en blanding af 74 mg/kg ketamin og 11 mg/kg xylazin intrapertioneally (IP) med en insulin sprøjte (1 mL, 29 G). Bekræfte anesthetization i mangel af svar på tilbagetrækning refleks af lemmer. Lamme rotter i en stereotactic enhed ved hjælp af fiksering point for næse og ører. Sted en carbomer eye gel til at forhindre tørhed af øjnene mens under anæstesi.
- Barbere rotte fra øjenhøjde på bagsiden af kraniet og desinficere huden med povidon-jod.
- Udsætte kraniet gennem en midterlinjen hovedbunden indsnit i 2 cm, og gøre en 1 mm hul (diamant boremaskine) 2 mm posteriort og 2,5 mm lateral til bregma i den højre frontal halvkugle.
- Indsætte en stereotactically guidede insulin nål (29 G) og indsprøjtes 5 µL cellesuspension (20.000 F98 GB celler) 3 mm dyb ved hjælp af en mikrosprøjte pumpe controller (indstillinger: injicere (I50), Vurder 1 nL/s (001 SDN)).
- Trække sprøjten langsomt og luk snittet med knogle voks. Sutur af hud og desinficere med povidon-jod.
- Stabilisere dyr efter operationen ved hjælp af en rød lygtes kropstemperatur. Overvåge opvågnen af rotte, indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency. Returnere ikke dyret til selskab med andre dyr indtil fuldt tilbagebetalt. Holde alle dyr under miljømæssigt kontrollerede forhold (12t normale lys/mørke cyklus, 20-24 ° C og relativ luftfugtighed 40-70%) med mad og vand ad libitum. Sørg for at følge dyr tæt ved overvågning af deres kropsvægt, mad, indtagelse af vand, og deres aktivitet og normal adfærd. Bruge en dødelig dosis af pentobarbital natrium til at aflive dyr (160 mg/kg), hvis en nedgang af 20% kropsvægt er observeret, eller når den normale adfærd alvorligt forringes (f.eks.mangel på grooming).
2. bekræftelse af tumorvækst
Bemærk: Evaluere tumor vækst 8 dage efter podning med T2-vægtet Mr, dynamisk kontrast-forstærket MRI (DCE-MRI) og kontrast-forstærket T1-vægtet MRI. Når svulsten når en størrelse på 2,5 x 2,5 x 2,5 mm3, Vælg rotte for terapi.
- Først forbinde en 30 G nål til et 60 cm langt rør, der placeres intravenøst i den laterale hale vene. Bedøver rotter gennem en næsen kegle med 2% isofluran blandet med ilt (0,3 L/min). Bekræft anesthetization, når rotterne ikke reagerer på tilbagetrækning refleks af lemmer. Dække rotter med en opvarmet tæppe og placere dem i Mr bed. Bruge en carbomer eye gel til at forhindre tørhed.
- Placere sengen i holderen med en fast rotte hjernen overflade coil, og placere sengen i et 72 mm rotte hele kroppen sender coil.
- Udføre en localizer scanning efterfulgt af en T2-vægtet spin-ekko scanning at vurdere tumorvækst. T2-Mr sekvens detaljer: TR/TE 3661/37,1 ms, 109 µm isotropic i flyet opløsning, Skive tykkelse 600 µm, 4 gennemsnit, TA 9 min. 45 s.
- Hvis tumor er bekræftet på T2-vægtede erhvervelse, indsprøjte en gadolinium-holdige kontraststof i intravenøst placerede slangen (MR-kontrastmidlet; 0,4 mL/kg) 30 s efter starten af DCE-Mr erhvervelse. Erhverve DCE-Mr under 12 min ved hjælp af en fast-lav vinkel skud (FLASH) sekvens i en enkelt skive (1 mm skive tykkelse). Bruge en i-fly rumlige opløsning af (312 µm2) og en tidsmæssig opløsning på 1,34 s.
- Ved hjælp af værktøjet image sequence analysis, Vælg en region af interesse (ROI) inden for mistanke om tumor regionen afbilde signal intensitet over tid. Efterfølgende analysere form af den resulterende DCE kurve til at bekræfte tilstedeværelsen af glioblastom (figur 3).
- Endelig, erhverve en kontrast-forstærket T1-vægtet spin-ekko sekvens. T1-Mr sekvens detaljer: TR/TE 1539/9,7 ms, 117 µm isotropic i flyet opløsning, Skive tykkelse 600 µm, 3 gennemsnit, TA 4 min 15 s. typisk kontrast-forstærket T1-vægtet hr. billeder er vist i figur 2.
- Efter færdiggørelse af T1-vægtet sekvens, kan dyret vågner op under konstant tilsyn, indtil det genvinder fuld bevidsthed.
3. multimodalitet tænkelig nemlig volumen valg af observationsområde
Bemærk: for at være i stand til at foretage Mr-vejledt 3D model conformal bestråling af F98 GB rotte med PET-styrede sub volumen styrke, 3 imaging modaliteter skal udføres. Først injicere radiotracer, derefter udføre Mr under tracer optagelse, senere udføre en statisk PET erhvervelse og en behandling planlægning CT.
- Bedøver dyr ved hjælp af en næsen kegle med 2% isofluran blandet med ilt (0,3 L/min). Bekræft anesthetization, når rotterne ikke reagerer på tilbagetrækning refleks af lemmer. Bruge en carbomer eye gel til at forhindre tørhed under anæstesi.
- Indsætte et kateter (26 G) i halen vene, gør det muligt for injektion af 37 MBq af PET radioaktive sporstof opløses i 200 µL saltvand. Injicere enten 18F-FET eller 18F-FAZA, 30 min eller 2 h før PET erhvervelse, henholdsvis.
- Injicere MR-kontrastmidlet (0,4 mL/kg) intravenøst i halen vene med kateter 15 min før PET erhvervelse.
- Placer rotter på en in-house lavet multimodalitet seng og sikre ved hjælp af krog og løkke skruer, opretholde en fast position under imaging og mikro-bestråling (figur 1).
- Lave tre multimodalitet markører (kapillærer fyldt med vand), nedenunder, ovenfor, og på højre side af kraniet. Placere den rotte, stadig fast på i den animalsk indehaver af MR-scanneren Bed & multimodalitet, lave rotte hjernen overflade coil og placere dette set-up i et 72 mm rotte hele kroppen sender coil. Udføre en localizer scanning efterfulgt af en kontrast-forstærket T1-vægtet spin-ekko sekvens.
- Transport af dyr for at udføre en 18F-FET eller 18F-FAZA PET erhvervelse. Erhverve en 30 min statisk PET-scanning i liste-mode. Scanningen skal være erhvervet enten 30 min efter 18F-FET injektion eller 2 h efter 18F-FAZA injektion.
4. RT behandling planlægning
- Bruge præ-klinisk behandling planlægning system (PCTPS) til behandling planlægning. Importere planlægning CT i PCTPS og manuelt opdele dette CT billede i tre forskellige væv klasser: knogle, blødt væv og luft. Denne manual segmentering er baseret på at definere tre forskellige grå-tærskelværdier på den planlægning CT. Tærsklerne manuelt valgte grå-værdi skal vælges således, at luften i hjernen er fraværende og at knogle tykkelse af kraniet er nul. Når disse tærskler er defineret, tildeles materielle tætheder af PCTPS for ben, blødt væv og luft (figur 4).
- Hvis kun Mr vejledning er nødvendig, ladning MR-scanning og co registrerer med planlægning CT ved hjælp af PCTPS.
- Bruge kroppen stiv transformationer (tre oversættelser og tre rotationer), multimodalitet markører og kraniet. Ved at lægge øget signal intensiteten af kraniet på CT med sort signal på Mr, en præcis fusion kan være opnået (figur 5).
- Vælg målet for bestråling i midten af kontrast-styrke tumor på T1-vægtet MRI, se figur 6 og figur 7.
- Når yderligere PET oplysninger skal medtages, omfatte en PET/CT/Mr Co registrering ved hjælp af biomedicinske billede kvantificering software (BIQS).
- Brug værktøjet konturer i BIQS for at opnå PET/Mr billede fusion (figur 8). Efter Co registrering, Vælg destinationen i midten af den øgede PET tracer optagelse i BIQS (figur 9) og indtaste koordinaterne manuelt i PCTPS ved hjælp af de følgende forandringer: X → -X og Y → Z Z → -Y.
- Vælg den foreskrevne dosis, antallet af buer, bue position, rotation vifte af buer og kollimator størrelse (figur 10).
- For Mr-vejledt RT, bruger følgende indstillinger: en foreskrevne dosis af 20 Gy, 3 buer placeret på sofaen vinkler-45 °, 0 ° og 45 ° med bue rotationer af 120 ° og en kollimator størrelse på 5 x 5 mm.
- For PET-Mr-vejledt RT, bruger følgende indstillinger: en foreskrevne dosis af 20 Gy med 3 buer og en 5 x 5 mm kollimator og ekstra 5 Gy for sub volumen opreklamering bruger 3 ikke-coplanare buer og en 1 x 1 mm kollimator. Vælg en rotation af 120 ° for alle buer mens du udskifter placeringen af sofaen (-45 °, 0 ° og 45 °).
- Beregne dosis fordelingen inden for dyret og stråle levering parametre til at levere den foreskrevne dosis til destinationen ved hjælp af PCTPS. Inden selve bestråling, teste arc rotationer på de forskellige sofa holdninger til at forhindre enhver kollision under bestråling.
- For den faktiske bestråling, Vælg en 0,15 mm kobber filter, indstille X-ray spænding til 220 kV, indstille X-ray nuværende 13 mA, og holdning den rigtige kollimator på paafyldningsanordningen. Effektuere RT ved at overføre parametrene passende stråle levering fra PCTPS til mikro-irradiator.
- I disse procedurer, rotten er holdt under kontinuerlig isofluran anæstesi (2% isofluran, blandet med ilt 0,3 L/min). Efter udførelse af den sidste bue, kan dyret vågner op under konstant tilsyn, indtil det kommer til fuld bevidsthed.
5. dosis volumen histogrammer (DVHs)
Bemærk: Hvis du vil sammenligne de faktiske dosis leveres til tumor target diskenheder og det omgivende normale hjernevæv, beregne DVHs.
- Tegne en volumen-af-interesse (VOI) omkring tumor og det normale hjerne på T1-vægtede kontrast-forstærket hr., billederne til at beregne gennemsnit, maximum og minimum dosis (Figur 11).
- Som et surrogat for maksimal, middelværdi og minimal dosis til tumor volumen og normal hjerne væv volumen, beregne D2, D50og D90. D står for den dosis, der modtages ved x % af mængden, angivet ved sænket skrift, og kan være afledt fra den resulterende DVH.
6. TMZ og Sham kemoterapi
- At efterligne behandling af glioblastom i patienter, administrere samtidig kemoterapi ved hjælp af IP injektioner af 29 mg/kg TMZ opløst i saltvand med 25% dimethylsulfoxide (DMSO) en gang om dagen i 5 dage, startende fra dag af bestråling24, 25. Brug 1 mL, 29 G insulin sprøjte til at administrere injektion.
- For kontrolgruppen, administrere injektion fra trin 6.1 uden TMZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at efterligne den menneskelige behandling metode for bestråling af glioblastom i prækliniske model, var inddragelse af Mr-vejledt strålebehandling nødvendigt. Ved hjælp af PCTPS og grænsefladen mikro-irradiator vi var i stand til at bestråle F98 glioblastom i rotter med flere conformal ikke-coplanare buer målretning regionen kontrast-forstærket på T1-vægtet MRI17. Stiv-krop transformationer i kombination med en multimodalitet seng blev brugt til billede registrering mellem Mr og planlægning CT. Isocenter for bestråling blev valgt midt i kontrast-forstærket tumor regionen på T1-vægtet MRI (figur 7).
Dosis distributioner og kumulative DVHs af middelværdi, minimal og maksimal dosis af destinationsdiskenheden og normal hjerne væv volumen blev beregnet for fem forskellige dyr (figur 12). Baseret på lighed med kliniske bestråling protokol og en optimal dosis fordeling, blev en dosis plan bruger tre ikke-coplanare buer valgt. Anvendelsen af sidstnævnte, modtaget 90% af destinationsdiskenheden den ønskede dosis, samtidig minimere dosis til normal hjerne væv17.
Efter at have bekræftet gennemførligheden af Mr-vejledt bestråling af F98 rotte glioblastom model, forsøgte vi at indarbejde PET-baseret sub volumen styrke i prækliniske arbejdsgangen for RT planlægning. Vi var i stand til at kombinere 3 billeddiagnostiske modaliteter, udfører først MRI og PET, og endelig CT mens rotten er fast på en in-house lavet multimodalitet seng (figur 1). For fælles registrering af disse modaliteter brugte vi BIQS, muliggør en masse flere værktøjer for stive tilsvarende (figur 8). Anvende en enkel transformation, både MR og PET baseret isocenter (fig. 9) kunne overføres til PCTPS. I Figur 13, er både Mr og PET-baseret isocenter til bestråling efter dosis beregning i PCTPS vist. For at bestråle den hele kontrast-styrke volumen vi valgte en 5 x 5 kollimator og tre buer roterende 120 °. For at øge den mest metabolisk aktive tumor del identificeret på 18F-FET PET eller den mest hypoksiske tumor del identificeret på 18F-FAZA PET, blev en dosis af 5 Gy valgt og leveres ved hjælp af en kollimator af diameter 1 mm. Igen, 3 buer roterende 120 ° anvendes.
Figur 1: mikro-irradiator integrere en kV X-ray tube, en roterende gantry, en computerstyret robot fase, en kolliminerende system til figur strålen og en beboelse-bedømmelseskomite CT detektor. Dyret er placeret på en 4 mm tyk PVC multimodalitet seng at forhindre bevægelser mellem imaging masseanskaffelser, såsom en MRI scanning efterfulgt af en planlægning CT, som letter billede fusion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: glioblastom bekræftelse. T1-vægtet MRI, T2-vægtet Mr og DCE-MR-scanning af en F98 GB rotte. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: DCE kurve. Ved hjælp af værktøjet image sequence analysis, en ROI kan vælges på DCE-MR-scanning til at plotte signal intensitet over tid. Efterfølgende er analyse af resulterende DCE kurvens form stand til at bekræfte tilstedeværelsen af glioblastom. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: CT segmentering. Segmentering baseret på CT er udført manuelt definerer en række tærskelværdier at skelne præcist mellem luft fra lungevæv, fedtvæv, knogler og andre væv i billedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Mr-CT fusion. Ved at lægge øget signal intensiteten af kraniet på CT med sort signal på Mr, kan der opnås en præcis fusion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: kegle stråle CT. Ingen tumor ses på CT, hvilket gør det umuligt at vælge isocenter i midten af tumor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: kontrast-forstærket T1-vægtet MRI. Kontrast-forstærket T1-vægtet Mr visualiserer klart en rotte F98 hjernesvulst. Midten af kontrastforbedring er valgt som isocenter for RT planlægning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Mr-PET fusion. Ved hjælp af værktøjet konturer i BIQS, er PET/Mr billede fusion opnået.Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Mr-PET måludvælgelser. Målet for bestråling er valgt i midten af kontrastforbedring på T1-vægtet MRI (venstre). Målet for sub volumen styrke er valgt i midten af den øgede signal på 18F-FET PET (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: planlægning af stråleterapi. For at beregne strålebehandling planlægning, skal du vælge isocenter, foreskrevne dosis, antallet af buer, bue position, rotation vifte af buer og kollimator størrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: DVH beregning. Tegne en volumen-af-interesse (VOI) omkring tumor på T1-vægtede kontrast-forstærket hr., billederne til at beregne DVH inden for denne diskenhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: dosis plan ved hjælp af kontrast-forstærket T1-vægtet MRI og tre ikke-coplanare arcsto levere 20 Gy at destinationsdiskenheden. Til højre, er den kumulative dosis volumen Histogram (DVH) tumor og det normale hjernevæv afgrænset på kontrast-forstærket T1-vægtet MRI givet. Dette tal er blevet ændret fra Bolcaen et al. 20 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 13: valgt Mr og PET-styret isocenter for bestråling. CT billede i aksial, koronal og sagittal udsigt er visualiseret med dosis planen levere 20 Gy til målområde (gul region). Den isocenter, der blev identificeret på kontrast-styrke Mr er synlige (grøn) og isocenter lokaliseret på metabolisk aktive tumor del identificeret på 18F-FET PET er også synlige (rød). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at opnå nøjagtige bestråling af glioblastom tumor mål i hjernen, rotte, var mikro-irradiator's on-board CT vejledning ikke tilstrækkelig. Hjernetumorer er næsten ikke synlig på grund af utilstrækkelig bløddele kontrast, selvom kontrastforbedring ville blive brugt. Som sådan, skal Mr medtages for at give mulighed for mere præcis bestråling. Ved hjælp af en sekventiel hr. erhvervelse på et 7 T system og en CT erhvervelse på mikro-irradiator vi var i stand til at målrette dosis på kontrast-styrke tumor væv i hjernen og beregne en dosis plan ved hjælp af den planlægning CT. Dette var muligt efter billede fusion og dosis beregninger ved hjælp af PCTPS17. Det skal dog holdes for øje, at Mr er tilbøjelige til geometriske forvridninger, som ikke er korrigeret i denne protokol. Derudover før oversætte denne bestråling protokol til andre dele af kroppen, er yderligere forskning nødvendig. Betydningen af en nøjagtig væv segmentering som følge af brug af lavere kV energi fotoner bør overvejes. Mens segmentering i tre væv klasser kan være tilstrækkeligt i hjernen, rotte, skal mere væv klasser være angivet i bryst eller abdominale regionen af rotter til at give præcise dosis beregninger. For at undgå bevægelser under transporten mellem de forskellige Billeddannende systemer, vi har gjort brug af en multimodalitet seng, som minimerer bevægelse af hovedet (figur 1). Men en yderligere indsats er nødvendigt ved anvendelsen af denne protokol til andre dele af kroppen, enten bryst eller abdominale regioner. Især små dyr bestråling af organer påvirket af respiratorisk bevægelse eller tarm transit er stadig udfordrende.
Indarbejdelse af PET-styrede sub volumen styrke blev også vist sig at være umulig, trods en arbejdskrævende protokol. En fordel ved nukleare billeddannelse teknikker, såsom PET, er evnen til at billede heterogenitet i tumorer, som giver mulighed for målretning metabolisk meget aktive eller stråling resistente dele af svulsten. Vi var i stand til at øge dosis, specifikt målrettet på de mest biologisk aktive eller mest hypoksiske region af tumor med 18F-FET PET eller 18F-FAZA PET, hhv. Den kritiske trin i protokollen er billedet Co registrering. I øjeblikket, er ingen software stand til at automatisk Co registrere prækliniske Mr eller CT med PET billeder med tilstrækkelig høj nøjagtighed og reproducerbarhed. Generelt vise PET røbestoffer i neuro-onkologisk en lav optagelse i normal hjerne, der komplicerer registreringsprocessen. For sammensmeltning af de tre Billeddannende modaliteter (PET/CT/Mr) foretrak vi BIQS snarere end PCTPS, der ikke udvikles i øjeblikket nemt kombinere flere billeddiagnostiske modaliteter. BIQS har desuden flere smarte værktøjer til stive matchende. En stor hjælp er også brugen af en multimodalitet seng, forhindrer flytning af dyr mellem de forskellige imaging erhvervelser. Men manuel Co registrering er tidskrævende og øger tid af bedøvelse af dyr. Når billedet registrering er opnået, var eksportere koordinaterne fra BIQS til PCTPS muligt ved at anvende en enkel transformation på mål koordinater.
Det er ikke kun vigtigt at præcist målrettede (biologiske) tumor volumen: besparende i det omgivende normale hjernevæv har skal tages i betragtning. Sidstnævnte er ofte oversete i aktuelle dyrs strålebehandling eksperimenter, men meget vigtigt at gøre modellen også klinisk relevante. Dette blev opnået ved at anvende flere ikke-coplanare buer. Til vores viden, blev flere arc kraniel bestråling i små dyr aldrig anvendt før. Beam skik er denne metode i tæt lighed med det kliniske billede-styrede conformal RT og anvendelse af arc behandling målet i sidste ende modtager den foreskrevne dosis, mens de normale væv kun modtager en brøkdel af den. Som sådan er er et første skridt lavet til at minimere afstanden mellem prækliniske og kliniske RT teknologi17. En begrænsning af denne mikro-irradiator er, paafyldningsanordningen rotation er begrænset til 120 °. Kombinere arc rotationer med en ændring i sofaen position yderligere øget besparende af normale hjernevæv omkring tumor mål.
Denne metode er et vigtigt skridt hen imod integration af biologiske billeddiagnostiske modaliteter for strålebehandling vejledning. Nye udviklinger er imidlertid nødvendigt at forenkle præ-klinisk billede fusion og indarbejde dosis maleri af numre (DPBN) i prækliniske applikationer. Bruger den aktuelle micro-irradiator, er vi nu i stand til at anvende sub volumen styrke; men DPBN er endnu ikke muligt på grund af begrænsninger i dosis beregninger, paafyldningsanordningen rotationer og kollimator design. Endelig, udvikling af kompakt prækliniske PET scannere tilbyder sub millimeter rumlige opløsning er lovende26 og disse enheder kan give en meget elegant løsning til at integrere PET en lille dyr stråling platform.
Vi vist anvendeligheden af denne model for kombinerede Mr og PET-styrede bestråling samt kemoterapi af glioblastom i rotter og for fremtidig forskning på nye therapeutics for glioblastom. Endvidere er anvendelsen af PET-styrede sub volumen styrke et første skridt hen imod inkorporering af en BTV i stråling behandling planlægning af små dyr kræftmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Stichting Luka Hemelaere og Soroptimist International til støtte for dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GB RAT model | |||
| F98 Glioblastoma cell line | ATCC | CRL-2397 | |
| Fischer F344/Ico crl Rats | Charles River | N/A | http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/fischer-344-rat |
| Micropump system | World Precision Instruments | UMP3 | Micro 4: https://www.wpiinc.com/products/top-products/make-selection-ump3-ultramicropump/#tabs-1 |
| Stereotactic frame | Kopf | 902 | Model 902 Dual Small Animal Stereotaxic frame |
| diamant drill | Velleman | VTHD02 | https://www.velleman.eu/products/view/?id=370450 |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | https://www.aesculapusa.com/products/wound-closure/hemostatic-bone-wax |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| InfraPhil IR lamp | Philips | HP3616/01 | |
| Ethilon | Ethicon | 662G/662H | FS-2, 4-0, 3/8, 19 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM | Invitrogen | 14040-091 | |
| Penicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-032 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-224 | |
| Falcons | Thermo Scientific | 178883 | 175 cm2 nunclon surface, disposables for cell culture with filter caps |
| Cell freezing medium | Sigma-aldrich | C6164 | Cell Freezing Medium-DMSO, sterile-filtered, suitable for cell culture, endotoxin tested |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal irradiation | |||
| Micro-irradiator | X-strahl | SARRP | |
| software for irradiation | X-strahl | MuriPlan | pre-clinical treatment planning system (PCTPS), version 2.0.5. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal PET | |||
| microPET system possibility 1 | Molecubes | B-Cube | http://www.molecubes.com/b-cube/ |
| microPET system possibility 2 | TriFoil Imaging, Northridge CA | FLEX Triumph II | http://www.trifoilimaging.com |
| PET tracers | In-house made | 18F-FDG, 18F-FET, 18F-FAZA, 18F-Choline | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal MRI | |||
| microMRI system | Bruker Biospin | Pharmascan 70/16 | https://www.bruker.com/products/mr/preclinical-mri/pharmascan/overview.html |
| Dotarem contrast agent | Guerbet | MRI contrast agent, Dotarem 0,5 mmol/ml | |
| rat whole body transmitter coil | Rapid Biomedical | V-HLS-070 | |
| rat brain surface coil | Rapid Biomedical | P-H02LE-070 | |
| Water-based heating unit | Bruker Biospin | MT0125 | |
| 30 G Needle for IV injection | Beckton-Dickinson | 305128 | 30 G |
| PE 10 tubing (60 cm/injection) | Instech laboratories, Inc | BTPE-10 | BTPE-10, polyethylene tubing 0.011 x .024 in (0.28 x 60 mm), non sterile, 30 m (98 ft) spool, Instech laboratories, Inc Plymouth meeting PA USA- (800) 443-4227- http://www.instechlabs.com |
| non-heparinised micro haematocrit capillaries | GMBH | 7493 21 | these capillaries are filled with water to create markers visible on MRI and CT |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| isoflurane: Isoflo | Zoetis | B506 | Anaesthesia |
| ketamine: Ketamidor | Ecuphar | Anaesthesia | |
| xylazine: Sedaxyl | Codifar NV | Anaesthesia | |
| catheter | Terumo | Versatus-W | 26G |
| Temozolomide | Sigma-aldrich | T2577-100MG | chemotherapy |
| DMSO | Sigma-aldrich | 276855-100ML | |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image analysis | |||
| PMOD software | PMOD technologies LLC | PFUS (fusion tool) | biomedical image quantification software (BIQS), version 3.405, https://www.pmod.com/web/?portfolio=22-image-processing-pfus |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia-equipment | |||
| Anesthetic movabe unit | ASA LTD | ASA 0039 | ASA LTD, 5 valley road, Keighley, BD21 4LZ |
| Oxygen generator | Veterinary technics Int. | 7F-3 | BDO-Medipass, Ijmuiden |
References
- Stupp, R., et al. Promising survival for patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme treated with concomitant radiation plus temozolomide followed by adjuvant temozolomide. J Clin Oncol. 20 (5), 1375-1382 (2002).
- Dhermain, F. Radiotherapy of high-grade gliomas: current standards and new concepts, innovations in imaging and radiotherapy, and new therapeutic approaches. Chin J Cancer. 33 (1), 16-24 (2014).
- Ahmed, R., et al. Malignant gliomas: current perspectives in diagnosis, treatment, and early response assessment using advanced quantitative imaging methods. Cancer Manag Res. 6, 149-170 (2014).
- Verhaegen, F., Granton, P., Tryggestad, E. Small animal radiotherapy research platforms. Phys Med Biol. 56 (12), R55-R83 (2011).
- Kinsella, T. J., Vielhuber, K. A., Kunugi, K. A., Schupp, J., Davis, T. W., Sands, H. Preclinical toxicity and efficacy study of a 14-day schedule of oral 5-iodo-2-pyrimidinone-2-deoxyribose as a prodrug for 5-iodo-2-deoxyuridine radiosensitization in U251 human glioblastoma xenografts. Clin Cancer Res. 6 (4), 1468-1475 (2000).
- Vellimana, A. K., et al. Combination of paclitaxel thermal gel depot with temozolomide and radiotherapy significantly prolongs survival in an experimental rodent glioma model. J Neurooncol. 111 (3), 229-236 (2012).
- Kioi, M., Vogel, H., Schultz, G., Hoffman, R. M., Harsh, G. R., Brown, J. M. Inhibition of vasculogenesis, but not angiogenesis, prevents the recurrence of glioblastoma after irradiation in mice. J Clin Invest. 120 (3), 694-705 (2010).
- Vinchon-Petit, S., Jarnet, D., Jadaud, E., Feuvret, L., Garcion, E., Menei, P. External irradiation models for intracranial 9L glioma studies. J Exp Clin Cancer Res. 29, 142 (2010).
- Yang, W., et al. Convection enhanced delivery of carboplatin in combination with radiotherapy for treatment of brain tumors. J Neurooncol. 101 (3), 379-390 (2011).
- Rousseau, J., et al. Efficacy of intracerebral delivery of cisplatin in combination with photon irradiation for treatment of brain tumors. J Neurooncol. 98 (3), 287-295 (2010).
- Baumann, B. C., et al. An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the small animal radiation research platform. Transl Oncol. 5 (4), 230-237 (2012).
- Grosu, A. -L., et al. Implications of IMT-SPECT for postoperative radiotherapy planning in patients with gliomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 54 (3), 842-854 (2002).
- Butterworth, K. T., Prise, K. M., Verhaegen, F. Small animal image-guided radiotherapy: Status, considerations and potential for translational impact. Br J Radiol. 88 (1045), 4-6 (2015).
- Aird, E. G. A., Conway, J. CT simulation for radiotherapy treatment planning. Br J Radiol. 75 (900), 937-949 (2002).
- Baker, G. R. Localization: Conventional and CT simulation. Br J Radiol. 79 (Spec No 1). , S36-S49 (2006).
- Corroyer-Dumont, A., et al. MRI-guided radiotherapy of the SK-N-SH neuroblastoma xenograft model using a small animal radiation research platform. Br J Radiol. 90 (1069), 20160427 (2017).
- Bolcaen, J., et al. MRI-guided 3D conformal arc micro-irradiation of a F98 glioblastoma rat model using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP). J Neurooncol. 120 (2), 257-266 (2014).
- Niyazi, M., et al. FET-PET for malignant glioma treatment planning. Radiother Oncol. 99 (1), 44-48 (2011).
- Grosu, A. L., et al. First experience with I-123-alpha-methyl-tyrosine SPECT in the 3-D radiation treatment planning of brain gliomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 47 (2), 517-526 (2000).
- Ling, C. C., et al. Towards multidimensional radiotherapy (MD-CRT):biological imaging and biological conformality. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 47 (3), 551-560 (2000).
- Wahl, R. L., Jacene, H., Kasamon, Y., Lodge, M. A. From RECIST to PERCIST: Evolving Considerations for PET response criteria in solid tumors. J Nucl Med. 50 Suppl 1. (5), 122S-150S (2009).
- Daisne, J. F., et al. Tumor volume in pharyngolaryngeal squamous cell carcinoma: comparison at CT, MR imaging, and FDG PET and validation with surgical specimen. Radiology. 233 (1), 93-100 (2004).
- Grosu, A. -L., Weber, W. PET for radiation treatment planning of brain tumours. Radiother Oncol. 96 (3), Elsevier Ireland Ltd. 325-327 (2010).
- Banissi, C., Ghiringhelli, F., Chen, L., Carpentier, A. F. Treg depletion with a low-dose metronomic temozolomide regimen in a rat glioma model. Cancer Immunol Immunother. 58, 1627-1634 (2009).
- Robinson, C. G., et al. Effect of alternative temozolomide schedules on glioblastoma O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase activity and survival. Br J Cancer. 103, 498-504 (2010).
- España, S., Marcinkowski, R., Keereman, V., Vandenberghe, S., Van Holen, R. DigiPET: sub-millimeter spatial resolution small-animal PET imaging using thin monolithic scintillators. Phys Med Biol. 59 (13), 3405 (2014).
