Summary
Kleine dierlijke bestraling werd in het verleden meestal uitgevoerd zonder de mogelijkheid om gericht een goed afgebakende tumor volume. Het doel was om na te bootsen de behandeling van menselijke glioblastoma bij ratten. Met behulp van een kleine dierlijke bestraling platform, wij uitgevoerd MRI geleide 3D hoekgetrouwe bestraling met PET gebaseerde sub volume boost in een preklinische instelling.
Abstract
Voor decennia, werd kleine dierlijke straling onderzoek meestal uitgevoerd met behulp van vrij ruwe experimentele opstellingen toepassing van eenvoudige één-beam technieken zonder de mogelijkheid te richten op een specifieke of goed afgebakende tumor volume. De levering van straling werd bereikt met behulp van vaste stralingsbronnen of lineaire versnellers produceren megavoltage (MV) x-stralen. Deze apparaten zijn niet in staat om sub millimeter precisie vereist voor kleine dieren. Bovendien, de hoge doses geleverd aan gezonde omringende weefsel belemmert reactie beoordeling. Het vergroten van de vertaling tussen kleine dierlijke studies en mensen, was ons doel om de behandeling van menselijke glioblastoma in een rat-model na te bootsen. Zodat een nauwkeuriger bestraling in een preklinische instelling, onlangs, werden precisie afbeelding geleide kleine dierlijke straling onderzoek platformen ontwikkeld. Vergelijkbaar met menselijke planningssystemen, behandeling van plan deze micro-irradiators is gebaseerd op computertomografie (CT). Laag contrast van het zachte weefsel op CT maakt het echter zeer uitdagend om te lokaliseren doelen in bepaalde weefsels, zoals de hersenen. Daarom integratie van magnetische resonantie beeldvorming (MRI), die uitstekende soft-weefsel contrast in vergelijking met CT heeft, in staat zou stellen een nauwkeurigere afbakening van de doelstelling voor bestraling. In het laatste opgedaan decennium ook biologische beeldvormingstechnieken, zoals positron emissie tomografie (PET) belang voor straling therapie behandeling begeleiding. PET maakt de visualisatie van bijvoorbeeld, glucose consumptie, aminozuur vervoer of hypoxie, aanwezig in de tumor. Gericht op die zeer proliferatieve of radio-resistente delen van de tumor met een hogere dosis zou een voordeel van overleving. Deze hypothese heeft geleid tot de invoering van de biologische tumor volume (BTV), naast de conventionele bruto doelvolume (GTV), klinische doelvolume (CTV) en geplande doelvolume (PTV).
De preklinische beeldvorming lab van de Universiteit Gent, een micro-irradiator, een klein dier PET, en een 7 T klein dier MRI zijn beschikbaar. Het doel was om MRI geleide bestraling en PET-geleide sub volume boost in een glioblastoma rat model te nemen.
Introduction
Hoogwaardige glioma is de meest voorkomende en meest agressieve kwaadaardige hersentumor bij volwassenen met een mediane overleving van 1 jaar, ondanks de huidige behandelmodaliteiten. De standaard van zorg omvat maximale chirurgische resectie gevolgd door gecombineerde externe lichtbundel radiotherapie (RT) en temozolomide (TMZ), gevolgd door onderhoud TMZ1,2,3. Sinds de introductie van TMZ nu meer dan 15 jaar geleden, zijn geen significante verbeteringen aangebracht in de behandeling van deze tumoren. Daarom is de implementatie van nieuwe therapeutische strategieën dringend maar eerst moet worden onderzocht in kleine dierlijke kanker therapie modellen (meestal muizen en ratten). Tumor-dragende knaagdier modellen kunnen worden gebruikt om te onderzoeken van de werkzaamheid van nieuwe en complexe straling protocollen, eventueel gecombineerd met andere (nieuwe) behandeling agenten, om te beoordelen van straling reactie of te onderzoeken van radio-beschermende agenten. Een groot voordeel van preklinische straling onderzoek is de mogelijkheid om te werken onder gecontroleerde experimentele omstandigheden met behulp van grote cohorten resulterend in versnelde gegevens opbrengst te wijten aan de kortere levensduur van knaagdieren. De preklinische bevindingen moeten vervolgens worden vertaald in een klinische proef in een veel snellere en meer efficiënte manier dan in de huidige praktijk4.
Kleine dierlijke straling experimenten in de laatste decennia zijn meestal bereikt met behulp van vaste straling bronnen5,6,7, bijvoorbeeld, 137Cs en 60Co, isotopen, of lineair versnellers bestemd voor menselijke klinische gebruik, toe te passen van een interne stralingsveld met MV x-stralen6,8,9,10,11. Echter, deze apparaten bereiken geen sub millimeter precisie, die vereist voor kleine dieren12 is. Bovendien, MV x-stralen hebben kenmerken ongeschikt voor het bestralen van kleine doelen, zoals de opbouw van een dosis op het raakvlak van de lucht-weefsel in de regio van de ingang van de lichtbundel met een omvang in de volgorde van het dier grootte zelf4,6 ,8,9,10,11. Deze laatste maakt het vrij uitdagend om te leveren een uniforme dosis aan een tumor terwijl sparend omringende normale hersenen weefsel4,8,9,10,11. Vandaar, is het onduidelijk in welke mate de huidige dierlijke studies nog steeds relevant voor de moderne RT praktijk12 zijn. In dit verband onlangs ontwikkelde driedimensionale (3D) hoekgetrouwe kleine dierlijke micro-irradiators zijn veelbelovend om de technologische kloof tussen geavanceerde 3D beeld-geleide RT technieken, zoals intensiteit Intensiteitsgemoduleerde radiotherapie (IMRT) of hoekgetrouwe bogen gebruikt in de mens en de huidige kleine dierlijke bestraling4,13. Deze platforms maken gebruik van een kilovoltage (kV) X-ray bron te verkrijgen van de scherpe penumbras en te vermijden dosis opbouw. Deze platforms omvatten een computergestuurde podium voor dier positionering, een kV X-ray bron voor beeldvorming en radiotherapie, een roterende gantry vergadering om levering van de straling uit verschillende hoeken, en een collimating systeem aan de vorm van de bundel van straling 4. in 2011, een micro-irradiator werd geïnstalleerd op de preklinische beeldvorming lab van de Universiteit van Gent (Figuur 1). Dit systeem is vergelijkbaar met moderne menselijke radiotherapie praktijk en biedt een breed scala aan preklinische experimenten, zoals de synergie van de straling met andere therapieën, complexe straling regelingen en beeld-geleide sub doel boost studies.
Behandeling van plan deze micro-irradiators is gebaseerd op CT, die gelijk is aan menselijke plannen systemen14,15. Voor CT beeldvorming, wordt een on-board X-ray detector gebruikt in combinatie met de dezelfde kV röntgenbuis dat wordt gebruikt tijdens de behandeling. CT beeldvorming wordt gebruikt als het voorziet in de nauwkeurige dierlijke positionering en informatie die nodig is voor individuele straling dosis berekeningen via segmentatie biedt. Echter, als gevolg van het lage contrast van het zachte weefsel in CT beeldvorming, tumoren in de hersenen van kleine dieren, zoals hoogwaardige glioma, gemakkelijk kunnen niet worden afgebakend. De opneming van multimodaliteit imaging is daarom noodzakelijk voor een nauwkeurig doel volume afbakening. Vergeleken met CT, biedt MRI enorm superieure zachte-weefsel contrast. Dit maakt het veel gemakkelijker om te visualiseren laesie grenzen die in een veel betere afbakening van het doelvolume resulteren zal, helpen om beter te bestralen van de laesie en te voorkomen dat het omliggende weefsel, zoals geïllustreerd in Figuur 24, 16. Een bijkomend voordeel is dat de MRI gebruikt niet-ioniserende straling, in tegenstelling tot CT die gebruik van ioniserende straling maakt. De belangrijkste nadelen van MRI zijn de verwerving van de relatief lange tijden en hoge operationele kosten. Het is belangrijk op te merken dat de MRI-scans kunnen niet worden gebruikt voor berekeningen van de dosis, zoals zij niet het vereiste elektronen dichtheid informatie, bieden hoewel vooruitgang is geboekt op dit gebied, ook met de recente ontwikkeling van MIJNHEER-LINACS. Als zodanig is een gecombineerde CT/MRI dataset de methode van keuze voor de planning van de bestraling van kwaadaardige glioma, met zowel de vereiste informatie voor targeting (MRI gebaseerde volumes) en voor dosis berekeningen (op basis van CT elektron dichtheid).
Als u wilt verkleinen van de kloof tussen kleine dierlijke bestraling en klinische routine, moet MRI duidelijk worden geïntegreerd in de workflow van de micro-irradiator, een juiste registratieplichtige tussen MRI en CT, die verre van triviaal is. In dit document, ons protocol voor MRI geleide 3D hoekgetrouwe doorstraling van F98 glioblastoma bij ratten wordt besproken, die is onlangs gepubliceerd17.
Hoewel het opnemen van CT en MRI in de workflow van de micro-irradiator een duidelijke stap voorwaarts in kleine dierlijke bestraling onderzoek is, deze anatomische beeldvormingstechnieken niet altijd mogelijk een volledige definitie van het doelvolume. Pathologische veranderingen in de hersenen op CT en MRI worden gekenmerkt door een verhoogd vochtgehalte (oedeem) en lekkage van de bloed - hersenbarrière of contrastverbetering. Contrastverbetering zowel hyper-intens gebieden op MRI T2-gewogen zijn echter niet altijd een nauwkeurige maatstaf van omvang van de tumor.Tumorcellen hebben geconstateerd tot ver buiten de marges van contrastverbetering12. Ook herkent geen van deze technieken de meest agressieve onderdelen binnen de tumor, die verantwoordelijk voor therapeutische weerstand en herhaling van de tumor wellicht. Daarom aanvullende informatie van moleculaire beeldvormingstechnieken als huisdier een meerwaarde voor RT hebben kan target volume definitie omdat deze technieken in staat stellen om te visualiseren van biologische trajecten in vivo12,18, 19.
In 2000 introduceerde Ling et al. het concept van biologische doelvolume (BTV worden opgespoord) door de integratie van anatomische en functionele beeldvorming in de workflow van de radiotherapie, wat leidt tot wat zij multidimensionale conformele radiotherapie20 noemen. Hierdoor ontstaat de mogelijkheid om de dosis richten door het leveren van een niet-uniforme dosis naar een doel-regio met behulp van bijvoorbeeld PET beelden. De meest gebruikte PET tracer voor tumor staging en voor het controleren van de behandeling is reactie fluor-18 (18F) fluorodeoxyglucose (FDG), die het glucose metabolisme21visualiseert het label. In hoofd en nek kanker, vorige studies hebben aangetoond dat het gebruik van 18F-FDG-PET heeft geleid tot een betere schatting van de werkelijke tumor volume, zoals gedefinieerd door de pathologische specimens, vergeleken met CT en MRI22. In primaire hersenen zijn tumoren, waar FDG is niet handig als gevolg van de zeer sterke achtergrond signaal van de normale hersenen, aminozuren, zoals 11C-methionine en meer recentelijk 18F-fluoroetthyltyrosine (FET), onderzocht voor GTV afbakening met vaak uitgesproken verschillen tussen aminozuur PET en MRI gebaseerde GTVs23. Echter is geen potentiële proces onderzoekt de betekenis van deze bevinding verricht nog. Wij hebben in deze studie gekozen de aminozuur tracer 18F-FET en de hypoxie tracer 18F-fluoroazomycin-arabinoside (18F-FAZA). 18 F-FET en 18F-FAZA werden geselecteerd omdat een verhoogde-aminozuur opname is sterk gecorreleerd met het tarief van de proliferatie in GB tumoren, overwegende dat de opname van een hypoxie PET-tracer is gecorreleerd met weerstand tegen18 radiotherapie (chemo) , 23. sub volume stimuleren met behulp van de micro-irradiator werd geoptimaliseerd door een extra stralingsdosis te geven aan een PET gedefinieerde deel van de F98 GB tumor bij ratten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie voor dierproeven (ECD 09/23 en ECD 12/28). Alle commerciële details kunnen gevonden worden in de Tabel van materialen.
1. F98 GB Rat cel Model
- De cellen van de F98 GB, ATCC, verkregen in monolayers met Dulbecco van gemodificeerde Eagle Medium, 10% kalfsserum, 1% penicilline, 1% streptomycine, 1% L-glutamine en 0,1% amfotericine b, cultuur en plaats in een CO2 incubator (5% CO2 en 37 ° C).
- Inoculeer glioma cellen in de hersenen van vrouwelijke Fischer F344 ratten (lichaamsgewicht 170 g).
- Gebruik van steriele instrumenten en steriele handschoenen dragen te allen tijde.
- Anesthetize de ratten door het injecteren van een mengsel van 74 mg/kg ketamine en intrapertioneally (IP) xylazine 11 mg/kg met een insuline spuit (1 mL, 29 G). Bevestig de afstomping door het uitblijven van antwoord aan de reflex van de terugtrekking van de ledematen. Immobiliseren de ratten in een stereotactische apparaat met behulp van fixatie punten voor de neus en oren. Plaats een carbomer oog gel ter voorkoming van droogheid van de ogen terwijl onder verdoving.
- Scheren van de rat uit ooghoogte aan de achterkant van de schedel en desinfecteren van de huid met Povidon-jodium.
- Bloot van de schedel door een middellijn hoofdhuid incisie van 2 cm, en een 1 mm gat (diamant boor) 2 mm posterior en 2,5 mm laterale aan de bregma in het rechts frontaal halfrond.
- Invoegen van een stereotactically geleide insuline naald (29 G) en injecteren 5 µL celsuspensie (20.000 F98 GB cellen) 3 mm diep met een microsyringe pomp controller (instellingen: injecteren (I50), stem op 1 nL/s (001 SDN)).
- Trekken de spuit langzaam en sluit de insnijding met been wax. Suture van de huid en desinfecteren met Povidon-jodium.
- Het stabiliseren van de lichaamstemperatuur van de dierlijke na ingreep met behulp van een rood licht. Volgen het ontwaken van de rat totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Het dier niet tot het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld terugkeren. Houd alle dieren onder milieuvriendelijke gecontroleerde omstandigheden (12 h normaal licht/donker cycli, 20-24 ° C en 40-70% relatieve vochtigheid) met voedsel en water ad libitum. Zorg ervoor dat de dieren op de voet volgen door het toezicht van hun lichaamsgewicht, voedsel, water inname, en hun activiteiten en normaal gedrag. Gebruik een dodelijke dosis pentobarbital natrium om te euthanaseren van de dieren (160 mg/kg) als een daling van 20% lichaamsgewicht wordt waargenomen of wanneer het normale gedrag (bijvoorbeeldontbreken van grooming) ernstig verslechtert.
2. bevestiging van de tumorgroei
Opmerking: Evalueren tumor groei 8 dagen na inoculatie met behulp van MRI T2-gewogen, dynamische contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) en contrast-enhanced T1-gewogen MRI. Wanneer de tumor een grootte van 2,5 x 2,5 x 2,5 mm3bereikt, selecteert u de rat voor therapie.
- Ten eerste een naald 30 G verbinding te maken met een 60 cm lange buis, die intraveneus wordt geplaatst in de ader van de laterale staart. Anesthetize de ratten door middel van een neus kegel met 2% Isofluraan gemengd met zuurstof (0,3 L/min). Afstomping bevestigen wanneer de ratten niet op de reflex van de terugtrekking van de ledematen reageren. Dekking van de ratten met een verwarmde deken en plaats ze in het bed van de MRI. Gebruik een carbomer eye gel ter voorkoming van droogte.
- Plaatsen van het bed in de houder met een vaste rat hersenen oppervlak spoel, en plaats het bed op een 72 mm rat hele lichaam zender spoel.
- Het uitvoeren van een scan van de localizer gevolgd door een scan van de spin-echo T2-gewogen om te beoordelen van de tumorgroei. T2-MRI reeks details: TR/TE 3661/37.1 ms 109 µm isotrope in-plane resolutie segment dikte 600 µm, 4 gemiddelden, TA 9 min 45 s.
- Als de tumor wordt bevestigd op de verwerving van T2-gewogen, injecteren een contrast gadoliniumhoudende agent de intraveneus geplaatste buis (MRI contrast agent; 0.4 mL/kg) 30 s na het begin van de DCE-MRI-overname. Verwerven DCE-MRI tijdens 12 min met behulp van een fast-lage hoek geschoten (FLASH) volgorde in een enkel sneetje (dikte 1 mm segment). Gebruik een ruimtelijke resolutie van in-plane van (312 µm2) en een temporele resolutie van 1.34 s.
- Met behulp van het hulpprogramma voor het analyse van het image-reeks, selecteer een regio van belang (ROI) binnen de regio van de vermoedelijke tumor aan het uitzetten van de signaalsterkte na verloop van tijd. Vervolgens analyseren de vorm van de curve van de resulterende DCE ter bevestiging van de aanwezigheid van glioblastoma (Figuur 3).
- Ten slotte, verwerven een contrast-enhanced T1-gewogen spin-echo-reeks. T1-MRI reeks details: TR/TE 1539/9,7 ms 117 µm isotrope in-plane resolutie, segment dikte 600 µm, 3 gemiddelden, TA 4 min 15 s. typische contrast-enhanced heer T1-gewogen beelden zijn afgebeeld in Figuur 2.
- Na het finaliseren van de T1-gewogen sequentie, kan het dier onder continu toezicht, wakker, totdat het volledige bewustzijn herwint.
3. multimodaliteit Imaging voor Volume-doelverschuiving
Opmerking: Om te kunnen uitvoeren van MRI geleide 3D hoekgetrouwe bestraling van de rat F98 GB model met PET-geleide sub volume boosting, 3 imaging modaliteiten moeten worden uitgevoerd. Eerst, injecteren van de radiotracer, dan voer MRI vervolgens verricht tijdens de tracer opname, een statische PET-overname en een behandeling plan CT.
- Anesthetize de dieren met behulp van een neus kegel met 2% Isofluraan gemengd met zuurstof (0,3 L/min). Afstomping bevestigen wanneer de ratten niet op de reflex van de terugtrekking van de ledematen reageren. Gebruik een carbomer eye gel om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
- Invoegen van een katheter (26 G) in de ader van de staart, zodat de injectie van 37 MBq van PET radioactieve tracer opgelost in 200 µL zoutoplossing. Injecteren 18F-FET of 18F-FAZA, 30 min of 2 h vóór PET verwerving, respectievelijk.
- MRI contrast agent (0.4 mL/kg) intraveneus injecteren in de ader van de staart met behulp van de katheter 15 min vóór PET verwerving.
- Plaats de ratten op een in-house maakte multimodaliteit bed en beveiligen met behulp van de haak en lus bevestigingsmiddelen, het handhaven van een vaste positie tijdens beeldvorming en micro-bestraling (Figuur 1).
- Positiebepaling drie multimodaliteit markeringen (haarvaten gevuld met water) onder, boven, en aan de rechterkant van de schedel. Plaats de rat, nog steeds vast op het bed van multimodaliteit, in de dierlijke houder van de MRI-scanner, bevestigen de rat hersenen oppervlak spoel en plaats deze set-up op een 72 mm rat hele lichaam zender spoel. Het uitvoeren van een scan van de localizer gevolgd door een reeks contrast-enhanced T1-gewogen spin-echo.
- Vervoer van het dier voor het uitvoeren van een 18F-FET of 18F-FAZA PET acquisitie. Verwerven van een 30 min statische-PET scan in de lijst-modus. Scan moet worden verworven van ofwel 30 min na 18F-FET injectie of 2 h na 18F-FAZA injectie.
4. RT behandeling plannen
- Gebruik de pre-klinische behandeling planning systeem (PCTPS) voor de planning van de behandeling. Importeer de planning CT in de PCTPS en handmatig segmenteren deze CT-afbeelding in drie verschillende weefsel klassen: lucht, bot en weke delen. Deze handmatige segmentatie is gebaseerd op de vaststelling van de drie verschillende grijs-waarde drempels op de planning CT. Deze handmatig geselecteerde grijs-waardedrempels moeten worden zodanig gekozen dat lucht in de hersenen afwezig is en de dikte van dat bot van de schedel nul is. Zodra deze drempels worden gedefinieerd, worden materiële dichtheden toegewezen door de PCTPS voor bot en weke delen lucht (Figuur 4).
- Als alleen MRI begeleiding nodig is, het laden van de MRI-scan en samen met de planning CT met behulp van de PCTPS registreren.
- Gebruik vastlichaam transformaties (drie vertalingen en drie rotaties), de markeringen van multimodaliteit en de schedel. Door overlappen de grotere signaalsterkte van de schedel op CT met zwarte signaal op een MRI, een precieze fusie kan worden bereikt (Figuur 5).
- Selecteer het doel voor bestraling in het midden van de contrast-verbeterende tumor op de MRI T1-gewogen, Zie Figuur 6 en Figuur 7.
- Wanneer extra PET-informatie opgenomen worden moet, bevatten een CT/MRI/PET co registratie met de biomedische afbeelding kwantificering software (BIQS).
- Gebruik de contouren in de BIQS te bereiken PET/MRI beeld fusie (Figuur 8). Na co registratie, selecteer het doel in het midden van de verhoogde PET tracer opname in de BIQS (Figuur 9) en de coördinaten handmatig invoeren in de PCTPS met behulp van de volgende transformaties: X → -X, Y → Z en Z → -Y.
- Selecteer de voorgeschreven dosering, aantal bogen, boog positie, rotatie bereik van de bogen en de grootte van de collimator (Figuur 10).
- Voor MRI geleide RT, gebruik de volgende instellingen: een voorgeschreven dosis van 20 Gy, 3 bogen aan de hoeken van de Bank van-45 °, 0 ° en 45 ° met boog rotaties van 120 ° en een collimator afmeting van 5 x 5 mm geplaatst.
- Voor PET-MRI-geleide RT, gebruik de volgende instellingen: een voorgeschreven dosis van 20 Gy met behulp van de 3 bogen en een 5 x 5 mm collimator en extra 5 Gy sub volume te stimuleren met behulp van 3 niet-coplanair bogen en een collimator 1 x 1 mm. Selecteer een rotatie van 120 ° voor alle bogen terwijl het veranderen van de positie van de Bank (-45 °, 0 ° en 45 °).
- Berekenen van de dosisverdeling in het dier en de lichtbundel levering parameters om de voorgeschreven dosering te leveren aan de doelstelling met behulp van de PCTPS. Voordat de daadwerkelijke bestraling, testen de rotaties van de boog op de standpunten van de verschillende bank om te voorkomen dat eventuele botsing tijdens bestraling.
- Voor de daadwerkelijke bestraling, een 0,15 mm koperen filter selecteert, stelt u de X-ray spanning op 220 kV, stel de X-ray huidige 13 mA, en positie de juiste collimator op de gantry. De RT uitvoeren door de juiste lichtbundel levering parameters van de PCTPS aan de micro-irradiator.
- Tijdens deze procedures, de rat wordt gehouden onder continue Isofluraan verdoving (2% Isofluraan, gemengd met zuurstof 0,3 L/min). Na de uitvoering van de laatste boog, kan het dier onder continu toezicht, wakker, totdat het volledige bewustzijn herwint.
5. dosis Volume histogrammen (DVHs)
Opmerking: Om te vergelijken de werkelijke dosis geleverd aan de tumor target volumes en het omliggende normale hersenweefsel, berekenen DVHs.
- Teken een volume-of-interest (VOI) rond de tumor en de normale hersenen op de T1-gewogen contrast-enhanced heer beelden voor het berekenen van de gemiddelde, maximale en minimale dosis (Figuur 11).
- Als een surrogaat voor de maximale berekenen gemiddelde, en de minimale dosis aan het volume van de tumor en de normale weefsel hersenvolume, de D2, D50en D90. D staat voor de dosis ontvangen door x % van het volume, aangeduid door het subscript, en kan worden afgeleid uit de resulterende GLS.
6. TMZ en Sham chemotherapie
- De behandeling van het glioblastoma bij patiënten na te bootsen, beheren van gelijktijdige chemotherapie met behulp van IP-injecties van 29 mg/kg TMZ ontbonden in een zoutoplossing met 25% dimethylsulfoxide (DMSO) eenmaal per dag gedurende 5 dagen vanaf de dag van bestraling24, 25. gebruik 1 mL, 29 G insuline spuit voor het beheer van de injectie.
- Beheren injectie uit stap 6.1 zonder TMZ voor de controlegroep.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om na te bootsen de menselijke behandeling methodologie voor de doorstraling van glioblastoma in een preklinische model, was opneming van MRI geleide radiotherapie noodzakelijk. Met behulp van de PCTPS en de interface van de micro-irradiator konden we F98 glioblastoma bij ratten met meerdere hoekgetrouwe niet-coplanair cirkelboog, gericht op het contrast-enhanced regio op T1-gewogen MRI17bestralen. Rigid-lichaam transformaties in combinatie met een bed van multimodaliteit werden gebruikt voor beeldregistratie tussen MRI en planning CT. De isocenter voor de bestraling werd geselecteerd in het midden van de contrast-enhanced tumor regio op T1-gewogen MRI (Figuur 7).
Dosis distributies en cumulatieve DVHs van de gemiddelde, minimale en maximale dosis van het doelvolume en de normale weefsel hersenvolume werden berekend voor vijf verschillende dieren (Figuur 12). Op basis van de gelijkenis met het protocol van de klinische bestraling en een optimale dosisverdeling, werd een dosis plan met behulp van drie niet-coplanair bogen geselecteerd. Toepassing van de laatste, ontvangen 90% van het doelvolume de gewenste dosis, terwijl het minimaliseren van de dosis tot normale hersenen weefsel17.
Na het bevestigen van de haalbaarheid van MRI geleide bestraling van het F98 rat glioblastoma model, proberen we te verwerken PET gebaseerde sub volume boost in de preklinische workflow voor RT planning. We konden combineren 3 beeldvormende modaliteiten, uitvoeren van eerst MRI dan PET, en ten slotte CT terwijl de rat is vastgesteld op een in-house gemaakte multimodaliteit bed (Figuur 1). Voor co registratie van deze modaliteiten gebruiken we de BIQS, waardoor veel meer tools voor rigide overeenkomende (Figuur 8). Een eenvoudige transformatie toe te passen, zowel de heer gebaseerd en PET gebaseerd isocenter (Figuur 9) kan worden overgebracht naar de PCTPS. In Figuur 13, worden zowel de MRI als de PET-gebaseerd isocenter voor bestraling na de berekening van de dosis in de PCTPS weergegeven. Om het bestralen van het gehele volume van de contrast-verbetering we geselecteerd een collimator 5 x 5 en drie arcs roterende 120 °. Voor het stimuleren van het deel van de meest metabolisch actief tumor vastgesteld op 18F-FET PET of het meest hypoxische deel van de tumor vastgesteld op 18F-FAZA PET, was een dosis van 5 Gy geselecteerd en geleverd met behulp van een collimator diameter van 1 mm. Nogmaals, de 3 bogen roterende 120 ° worden toegepast.
Figuur 1: Micro-irradiator integratie van een röntgenbuis kV, een roterende gantry, een computergestuurde robotic stadium, een collimating systeem aan de lichtbundel vorm en een flat-panelbeeldscherm CT detector. Het dier wordt geplaatst op een 4 mm dikke PVC multimodaliteit bed om te voorkomen dat bewegingen tussen meerdere beeldvorming acquisities, zoals een MRI-scan, gevolgd door een planning CT, dat beeld fusie. vergemakkelijkt Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Glioblastoma bevestiging. MRI T1-gewogen, T2-gewogen MRI en DCE-MRI van een rat F98 GB. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: DCE kromme. Met behulp van het hulpprogramma voor het analyse van het image-reeks, een ROI kan worden geselecteerd op de DCE-MRI-scan kunnen worden uitgezet de signaalsterkte na verloop van tijd. Vervolgens, vermag analyse van de vorm van de resulterende DCE curve de aanwezigheid van glioblastoma bevestigen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: CT segmentatie. Segmentatie op basis van CT wordt gedaan door een aantal drempelwaarden nauwkeurig onderscheidt lucht longweefsel, vetweefsel, botten en andere weefsels binnen de afbeelding handmatig te definiëren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: MRI-CT fusion. Door overlappen de grotere signaalsterkte van de schedel op CT met zwarte signaal op een MRI, kan een precieze fusie worden bereikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Cone beam CT. Er is geen tumor zichtbaar op CT, waardoor het onmogelijk om te selecteren van de isocenter in het midden van de tumor. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: T1-gewogen MRI Contrast-enhanced. De contrast-enhanced T1-gewogen MRI visualiseert duidelijk een rat F98 hersentumor. Het midden van de contrastverbetering is geselecteerd als de isocenter voor de RT planning. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: MRI-PET fusion. Het hulpprogramma voor de contouren in de BIQS, wordt PET/MRI beeld fusie bereikt.Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: MRI-PET-doelverschuiving. Het doel voor bestraling is geselecteerd in het centrum van contrast-verhoging op T1-gewogen MRI (links). Het doel voor het stimuleren van de sub volume is geselecteerd in het midden van het verhoogde signaal op 18F-FET PET (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10: radiotherapie planning. Voorgeschreven dosis, aantal bogen, boog positie, rotatie bereik van de bogen en de collimator grootte wilt berekenen van de radiotherapie planning, selecteert u de isocenter. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 11: DVH berekening. Teken een volume-of-interest (VOI) rond de tumor op de T1-gewogen contrast-enhanced heer beelden voor het berekenen van de DVH binnen dit volume. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 12: dosis plan met behulp van contrast-enhanced T1-gewogen MRI en drie niet-coplanair arcsto leveren 20 Gy aan het doelvolume. Aan de rechterkant, wordt de cumulatieve dosis Volume Histogram (GLS) van het volume van de tumor en de normale hersenweefsel afgebakend op contrast-enhanced T1-gewogen MRI gegeven. Dit cijfer is gewijzigd van Bolcaen et al. 20 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 13: geselecteerd MRI en PET-geleide isocenter voor bestraling. De CT-afbeelding in axiale, coronale en Sagittaal is gevisualiseerd met het plan van de dosis 20 Gy leveren aan de doelstelling regio (geel). De isocenter die werd geïdentificeerd op het contrast-verbeterende MRI is zichtbaar (groen) en de isocenter gelokaliseerd op het deel van de metabolisch actief tumor vastgesteld op 18F-FET PET is ook zichtbaar (rood). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om te bereiken van nauwkeurige bestraling van het doel van glioblastoma tumor in de hersenen van de rat, was de micro-irradiator aan boord CT begeleiding niet voldoende. Hersentumoren zijn nauwelijks zichtbaar als gevolg van onvoldoende weke contrast, zelfs als contrastverbetering zou worden gebruikt. MRI moet als zodanig worden opgenomen zodat nauwkeuriger bestraling. Met behulp van een sequentiële heer acquisitie op een 7 T-systeem en een CT-overname op de micro-irradiator we konden richten de dosis aan het contrast-verbeterende weefsel van de tumor in de hersenen en berekenen van een plan van de dosis met behulp van de planning CT. Dit was mogelijk na afbeelding fusion en dosis berekeningen met behulp van de PCTPS17. Het moet echter worden gehouden in het achterhoofd dat MRI is gevoelig voor geometrische verstoringen die niet in dit protocol worden gecorrigeerd. Bovendien, voordat het vertalen van dit protocol bestraling naar andere delen van het lichaam, verder onderzoek is nodig. Het belang van een segmentatie van de nauwkeurige weefsel ten gevolge van het gebruik van lagere kV energie fotonen moet worden beschouwd. Terwijl segmentatie in drie klassen van het weefsel in de rat hersenen zou voldoende zijn, moeten meer weefsel klassen worden vermeld in de thoracale of abdominale regio van ratten om nauwkeurige dosis berekeningen. Om te vermijden verkeer tijdens het vervoer tussen de verschillende beeldvormingssystemen, we maakte gebruik van een bed van multimodaliteit die beweging van het hoofd (Figuur 1 minimaliseert). Echter is een extra inspanning noodzakelijk bij de toepassing van dit protocol op andere lichaamsdelen, thoracale of abdominale regio's. Vooral kleine dierlijke bestraling van organen beïnvloed door respiratoire beweging of intestinale transit is nog uitdagend.
De opneming van het huisdier-geleide sub volume boost bleek ook niet haalbaar, ondanks een arbeidsintensieve protocol. Een voordeel van nucleaire beeldvormende technieken, zoals PET, is de mogelijkheid om het imago van de heterogeniteit binnen tumoren, waarmee gericht op zeer metabolisch actief of straling resistente delen van de tumor. We konden naar verhoging van de dosis, specifiek gericht op de meest biologisch actieve of meest hypoxische regio van de tumor met 18F-FET PET of 18F-FAZA PET, respectievelijk. De kritieke stap in het protocol is mede beeldregistratie. Op dit moment vermag geen software automatisch co registreren preklinische MRI of CT met PET beelden met hoog genoeg nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. In het algemeen, PET verklikstoffen in neuro-oncologie vertonen een lage opname normale hersenen die het registratieproces compliceert. Voor de fusie van de drie beeldvormende modaliteiten (CT/MRI/PET-folie) liever we de BIQS in plaats van de PCTPS, die momenteel niet te gemakkelijk combineren meerdere beeldvormende modaliteiten ontwikkeld. Bovendien heeft de BIQS meer slimme tools voor het afstemmen van de rigide. Een belangrijke hulp is ook het gebruik van een bed van multimodaliteit, voorkomen van verkeer van het dier tussen de verschillende beeldvormende acquisities. Echter, handmatige co registratie is tijdrovend en verhoogt de tijd van de verdoving van de dieren. Zodra beeldregistratie is bereikt, was exporteren de coördinaten van de BIQS in de PCTPS door een eenvoudige transformatie toe te passen op de coördinaten van het doel haalbaar.
Het is niet alleen belangrijk voor het juist richten op het volume (biologische) tumor: sparen van het omringende hersenweefsel van de normale moet ook rekening worden gehouden. Dit laatste is vaak verwaarloosde in huidige dierlijke radiotherapie experimenten, maar zeer belangrijk om het model ook klinisch relevant te maken. Dit werd bereikt door het toepassen van meerdere niet-coplanair bogen. Om onze kennis, was meerdere boog craniale bestraling in het kleine dieren nooit toegepast vóór. Met betrekking tot het gebruik van de lichtbundel is deze methode sluit gelijkenis met het klinische beeld-geleide hoekgetrouwe RT en als gevolg van het gebruik van arc behandeling het doel uiteindelijk ontvangt de voorgeschreven dosering, terwijl de normale weefsels slechts een fractie van het ontvangen. Als zodanig is een eerste stap gemaakt om te minimaliseren van de kloof tussen de preklinische en klinische RT technologie17. Een beperking van deze micro-irradiator is dat gantry rotatie beperkt tot 120 is °. Combineren van arc rotaties met een verandering in de positie van de bank verder verhoogd de sparing van normale hersenweefsel rondom de tumor doelstelling.
Deze methodologie is een belangrijke stap naar de integratie van biologische beeldvormende modaliteiten voor de oriëntatie van de radiotherapie. Nieuwe ontwikkelingen zijn echter nodig ter vereenvoudiging van de pre-klinisch beeld fusie en op te nemen dosis schilderij door getallen (DPBN) in preklinische toepassingen. Met behulp van de huidige micro-irradiator, zijn we nu in staat om toe te passen sub volume stimuleren; DPBN is echter nog niet mogelijk als gevolg van beperkingen in de berekeningen van de dosis, gantry rotaties en collimator ontwerp. Tot slot, de ontwikkeling van compacte preklinische PET-scanners bieden sub millimeter ruimtelijke resolutie is veelbelovend26 en deze apparaten kunnen een zeer elegante oplossing om huisdier te integreren in een kleine dierlijke straling platform bieden.
We toonden de toepasselijkheid van dit model voor gecombineerde MRI, PET-geleide bestraling en chemotherapie van glioblastoma bij ratten en voor toekomstige onderzoek naar nieuwe therapieën voor glioblastoma. Bovendien, de toepassing van het huisdier-geleide sub volume boost is een eerste stap naar de integratie van een BTV bij de planning van straling behandeling van kleine dierlijke kanker modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om bekend te maken
Acknowledgments
De auteurs bedank Stichting Luka Hemelaere en Soroptimist International voor de ondersteuning van dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GB RAT model | |||
| F98 Glioblastoma cell line | ATCC | CRL-2397 | |
| Fischer F344/Ico crl Rats | Charles River | N/A | http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/fischer-344-rat |
| Micropump system | World Precision Instruments | UMP3 | Micro 4: https://www.wpiinc.com/products/top-products/make-selection-ump3-ultramicropump/#tabs-1 |
| Stereotactic frame | Kopf | 902 | Model 902 Dual Small Animal Stereotaxic frame |
| diamant drill | Velleman | VTHD02 | https://www.velleman.eu/products/view/?id=370450 |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | https://www.aesculapusa.com/products/wound-closure/hemostatic-bone-wax |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| InfraPhil IR lamp | Philips | HP3616/01 | |
| Ethilon | Ethicon | 662G/662H | FS-2, 4-0, 3/8, 19 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM | Invitrogen | 14040-091 | |
| Penicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-032 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-224 | |
| Falcons | Thermo Scientific | 178883 | 175 cm2 nunclon surface, disposables for cell culture with filter caps |
| Cell freezing medium | Sigma-aldrich | C6164 | Cell Freezing Medium-DMSO, sterile-filtered, suitable for cell culture, endotoxin tested |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal irradiation | |||
| Micro-irradiator | X-strahl | SARRP | |
| software for irradiation | X-strahl | MuriPlan | pre-clinical treatment planning system (PCTPS), version 2.0.5. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal PET | |||
| microPET system possibility 1 | Molecubes | B-Cube | http://www.molecubes.com/b-cube/ |
| microPET system possibility 2 | TriFoil Imaging, Northridge CA | FLEX Triumph II | http://www.trifoilimaging.com |
| PET tracers | In-house made | 18F-FDG, 18F-FET, 18F-FAZA, 18F-Choline | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal MRI | |||
| microMRI system | Bruker Biospin | Pharmascan 70/16 | https://www.bruker.com/products/mr/preclinical-mri/pharmascan/overview.html |
| Dotarem contrast agent | Guerbet | MRI contrast agent, Dotarem 0,5 mmol/ml | |
| rat whole body transmitter coil | Rapid Biomedical | V-HLS-070 | |
| rat brain surface coil | Rapid Biomedical | P-H02LE-070 | |
| Water-based heating unit | Bruker Biospin | MT0125 | |
| 30 G Needle for IV injection | Beckton-Dickinson | 305128 | 30 G |
| PE 10 tubing (60 cm/injection) | Instech laboratories, Inc | BTPE-10 | BTPE-10, polyethylene tubing 0.011 x .024 in (0.28 x 60 mm), non sterile, 30 m (98 ft) spool, Instech laboratories, Inc Plymouth meeting PA USA- (800) 443-4227- http://www.instechlabs.com |
| non-heparinised micro haematocrit capillaries | GMBH | 7493 21 | these capillaries are filled with water to create markers visible on MRI and CT |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| isoflurane: Isoflo | Zoetis | B506 | Anaesthesia |
| ketamine: Ketamidor | Ecuphar | Anaesthesia | |
| xylazine: Sedaxyl | Codifar NV | Anaesthesia | |
| catheter | Terumo | Versatus-W | 26G |
| Temozolomide | Sigma-aldrich | T2577-100MG | chemotherapy |
| DMSO | Sigma-aldrich | 276855-100ML | |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image analysis | |||
| PMOD software | PMOD technologies LLC | PFUS (fusion tool) | biomedical image quantification software (BIQS), version 3.405, https://www.pmod.com/web/?portfolio=22-image-processing-pfus |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia-equipment | |||
| Anesthetic movabe unit | ASA LTD | ASA 0039 | ASA LTD, 5 valley road, Keighley, BD21 4LZ |
| Oxygen generator | Veterinary technics Int. | 7F-3 | BDO-Medipass, Ijmuiden |
References
- Stupp, R., et al. Promising survival for patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme treated with concomitant radiation plus temozolomide followed by adjuvant temozolomide. J Clin Oncol. 20 (5), 1375-1382 (2002).
- Dhermain, F. Radiotherapy of high-grade gliomas: current standards and new concepts, innovations in imaging and radiotherapy, and new therapeutic approaches. Chin J Cancer. 33 (1), 16-24 (2014).
- Ahmed, R., et al. Malignant gliomas: current perspectives in diagnosis, treatment, and early response assessment using advanced quantitative imaging methods. Cancer Manag Res. 6, 149-170 (2014).
- Verhaegen, F., Granton, P., Tryggestad, E. Small animal radiotherapy research platforms. Phys Med Biol. 56 (12), R55-R83 (2011).
- Kinsella, T. J., Vielhuber, K. A., Kunugi, K. A., Schupp, J., Davis, T. W., Sands, H. Preclinical toxicity and efficacy study of a 14-day schedule of oral 5-iodo-2-pyrimidinone-2-deoxyribose as a prodrug for 5-iodo-2-deoxyuridine radiosensitization in U251 human glioblastoma xenografts. Clin Cancer Res. 6 (4), 1468-1475 (2000).
- Vellimana, A. K., et al. Combination of paclitaxel thermal gel depot with temozolomide and radiotherapy significantly prolongs survival in an experimental rodent glioma model. J Neurooncol. 111 (3), 229-236 (2012).
- Kioi, M., Vogel, H., Schultz, G., Hoffman, R. M., Harsh, G. R., Brown, J. M. Inhibition of vasculogenesis, but not angiogenesis, prevents the recurrence of glioblastoma after irradiation in mice. J Clin Invest. 120 (3), 694-705 (2010).
- Vinchon-Petit, S., Jarnet, D., Jadaud, E., Feuvret, L., Garcion, E., Menei, P. External irradiation models for intracranial 9L glioma studies. J Exp Clin Cancer Res. 29, 142 (2010).
- Yang, W., et al. Convection enhanced delivery of carboplatin in combination with radiotherapy for treatment of brain tumors. J Neurooncol. 101 (3), 379-390 (2011).
- Rousseau, J., et al. Efficacy of intracerebral delivery of cisplatin in combination with photon irradiation for treatment of brain tumors. J Neurooncol. 98 (3), 287-295 (2010).
- Baumann, B. C., et al. An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the small animal radiation research platform. Transl Oncol. 5 (4), 230-237 (2012).
- Grosu, A. -L., et al. Implications of IMT-SPECT for postoperative radiotherapy planning in patients with gliomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 54 (3), 842-854 (2002).
- Butterworth, K. T., Prise, K. M., Verhaegen, F. Small animal image-guided radiotherapy: Status, considerations and potential for translational impact. Br J Radiol. 88 (1045), 4-6 (2015).
- Aird, E. G. A., Conway, J. CT simulation for radiotherapy treatment planning. Br J Radiol. 75 (900), 937-949 (2002).
- Baker, G. R. Localization: Conventional and CT simulation. Br J Radiol. 79 (Spec No 1). , S36-S49 (2006).
- Corroyer-Dumont, A., et al. MRI-guided radiotherapy of the SK-N-SH neuroblastoma xenograft model using a small animal radiation research platform. Br J Radiol. 90 (1069), 20160427 (2017).
- Bolcaen, J., et al. MRI-guided 3D conformal arc micro-irradiation of a F98 glioblastoma rat model using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP). J Neurooncol. 120 (2), 257-266 (2014).
- Niyazi, M., et al. FET-PET for malignant glioma treatment planning. Radiother Oncol. 99 (1), 44-48 (2011).
- Grosu, A. L., et al. First experience with I-123-alpha-methyl-tyrosine SPECT in the 3-D radiation treatment planning of brain gliomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 47 (2), 517-526 (2000).
- Ling, C. C., et al. Towards multidimensional radiotherapy (MD-CRT):biological imaging and biological conformality. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 47 (3), 551-560 (2000).
- Wahl, R. L., Jacene, H., Kasamon, Y., Lodge, M. A. From RECIST to PERCIST: Evolving Considerations for PET response criteria in solid tumors. J Nucl Med. 50 Suppl 1. (5), 122S-150S (2009).
- Daisne, J. F., et al. Tumor volume in pharyngolaryngeal squamous cell carcinoma: comparison at CT, MR imaging, and FDG PET and validation with surgical specimen. Radiology. 233 (1), 93-100 (2004).
- Grosu, A. -L., Weber, W. PET for radiation treatment planning of brain tumours. Radiother Oncol. 96 (3), Elsevier Ireland Ltd. 325-327 (2010).
- Banissi, C., Ghiringhelli, F., Chen, L., Carpentier, A. F. Treg depletion with a low-dose metronomic temozolomide regimen in a rat glioma model. Cancer Immunol Immunother. 58, 1627-1634 (2009).
- Robinson, C. G., et al. Effect of alternative temozolomide schedules on glioblastoma O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase activity and survival. Br J Cancer. 103, 498-504 (2010).
- España, S., Marcinkowski, R., Keereman, V., Vandenberghe, S., Van Holen, R. DigiPET: sub-millimeter spatial resolution small-animal PET imaging using thin monolithic scintillators. Phys Med Biol. 59 (13), 3405 (2014).
