Summary
Tidligere var liten dyr bestråling vanligvis utført uten mulighet til å målrette et godt kodedel svulst volum. Målet var å etterligner behandlingen av menneskelige glioblastom i rotter. Bruk en liten dyr bestråling plattform, utført vi MRI-guidede 3D conformal bestråling med PET-baserte sub volumet øker i preklinisk omgivelser.
Abstract
I flere tiår, ble liten dyr stråling forskning det meste utført ved hjelp av ganske grov eksperimentelle oppsett bruke enkel enkelt-beam teknikker uten mulighet til å målrette et bestemt eller godt kodedel svulst volum. Levering av stråling ble oppnådd ved hjelp av fast strålekilder eller lineær gasspedalene produsere megavoltage (MV) røntgenstråler. Disse enhetene er ikke å oppnå sub millimeter presisjon kreves for liten dyrene. Videre de høye doser levert til sunn omkringliggende vev hemme svar vurdering. For å øke oversettelsen mellom små studier på dyr og mennesker, var målet å etterligner behandlingen av menneskelige glioblastom i en rotte modell. For å aktivere en mer nøyaktig bestråling i preklinisk omgivelser, nylig ble presisjon bilde-guidede liten dyr stråling forskning plattformer utviklet. Ligner menneskelige planlegging systemer, behandling planlegger disse mikro-irradiators er basert på beregnet tomografi (CT). Men gjør lav bløtvev kontrast på CT det svært utfordrende å lokalisere mål i visse vev, som hjernen. Derfor vil omfatter magnetisk resonans imaging (MRI), som har utmerket bløtvev kontrasten forhold til CT, gjøre en mer presis avgrensning av målet for bestråling. I sist fikk tiåret også biologiske imaging teknikker, som fantes et positron utslipp tomografi (PET) interesse for stråling terapi behandling veiledning. PET kan visualisering av f.eks, glukose forbruk, aminosyre transport eller hypoksi, i svulsten. Målretting de svært proliferativ eller radio-resistente delene av svulst med en høyere dose kan gi en overlevelse fordel. Denne hypotesen førte til innføringen av biologiske svulst volumet (BTV), i tillegg til konvensjonelle brutto målvolumet (GTV), klinisk målvolumet (CTV) og planlagte målvolumet (PTV).
Ved prekliniske tenkelig lab Ghent University er en mikro-irradiator, en liten dyr PET og en 7 T liten dyr MRI tilgjengelig. Målet var å innlemme MRI-guidede bestråling og PET-guidede sub volumet øker i en glioblastom rotte modell.
Introduction
Høyverdig glioma er den vanligste og mest aggressive ondartede hjernesvulst hos voksne med en median overlevelse av 1 år til tross for gjeldende behandlingsmetoder. Standarden på omsorg inkluderer maksimal kirurgisk resection etterfulgt av kombinert ekstern stråle strålebehandling (RT) og temozolomide (TMZ), etterfulgt av vedlikehold TMZ1,2,3. Siden introduksjonen av TMZ nå mer enn 15 år siden, er ingen betydelige forbedringer gjort i behandlingen av disse svulstene. Derfor gjennomføringen av nye strategier haster men bør undersøkes først i liten dyr kreft terapi modellene (mest mus og rotter). Svulst-bærende gnager modeller kan brukes til å undersøke effekten av nye og komplekse stråling protokoller, muligens kombinert med andre (ny) behandling agenter, å vurdere stråling svar eller for å undersøke radio-beskyttende agenter. En stor fordel med prekliniske stråling forskning er muligheten til å arbeide under kontrollerte eksperimentelle forhold med store kohorter resulterer i akselerert data avkastning på grunn av det kortere lifespans av gnagere. Prekliniske resultatene skal deretter oversatt til en klinisk studie på en mye raskere og mer effektiv måte enn i gjeldende praksis4.
Små dyr stråling eksperimenter i de siste tiårene har vanligvis oppnådd med fast stråling kilder5,6,7, f.eks, 137Cs og 60Co, isotoper, eller lineær Gasspedalene ment for human klinisk bruk, bruker et enkelt stråling felt med MV røntgenstråler6,8,9,10,11. Men nå disse enhetene ikke sub millimeter presisjon, som kreves for små dyr12. Videre har MV røntgenstråler egenskaper uegnet for irradiating små mål, slik som en dose oppbygging i luft-vevet grensesnittet i regionen inngangen i strålen med en grad i dyr størrelsen4,6 ,8,9,10,11. Sistnevnte gjør det ganske utfordrende å levere en ensartet dose til en svulst skåner rundt normal hjerne vev4,8,9,10,11. Derfor er det uklart hvilken grad gjeldende dyrestudier fortsatt er relevante for moderne RT praksis12. I denne forbindelse nylig utviklet tredimensjonale (3D) conformal liten dyr mikro-irradiators er lovende å bygge bro over teknologiske gapet mellom avanserte 3D image-guidede RT teknikker, for eksempel intensitet modulert strålebehandling (IMRT) eller conformal buer i mennesker og gjeldende liten dyr bestråling4,13. Disse plattformene gjøre bruk av en kilovoltage (kV) X-ray kilde å få skarpe penumbras og unngå dose oppbygging. Disse plattformene inkluderer en datastyrt scene for dyr posisjonering, en kV X-ray kilde for bildebehandling og strålebehandling, en roterende gantry forsamling tillate stråling levering fra forskjellige vinkler, og et collomating system å forme stråling strålen 4. i 2011, en mikro-irradiator ble installert ved prekliniske tenkelig lab Ghent University (figur 1). Dette systemet ligner moderne menneskelige strålebehandling praksis og gjør en rekke prekliniske eksperimenter, som synergien av stråling med andre terapier, komplekse stråling ordninger og bilde-guidede sub-målet løft studier.
Behandling planlegger disse mikro-irradiators er basert på CT, som tilsvarer menneskelige planlegging systemer14,15. For CT bildebehandling brukes en innebygd X-ray detektor sammen med samme kV røntgenbilde rør som brukes under behandling. CT imaging brukes som det gir nøyaktig dyr plassering og gir informasjon nødvendig for personlige stråling dose beregninger via segmentering. Men på grunn av lav bløtvev kontrasten i CT kan ikke tenkelig, svulster i hjernen av små dyr, som høyverdig glioma, være lett avgrenset. Inkorporering av multi-modalitet imaging er derfor nødvendig for en nøyaktig målet kvantum avgrensning. I forhold til CT, gir MRI langt bedre bløtvev kontrast. Dette gjør det mye enklere å visualisere lesjon grensene som vil resultere i en mye bedre avgrensning av målvolumet, bidrar til å bedre irradiate lesjonen og unngå omkringliggende vev, som vist i figur 24, 16. En ekstra fordel er at Mr bruker ikke-ioniserende stråling, i motsetning til CT som bruker ioniserende stråling. Større ulempene av Mr er relativt lang oppkjøpet ganger og høye driftskostnader. Det er viktig å merke seg at Mr skanner ikke kan brukes for dose beregninger, som de ikke gir den nødvendige elektron tetthet informasjonen, men fremskritt gjøres i dette feltet, også med den siste utviklingen av MR-LINACS. Som sådan, er kombinert CT/MRI dataset metoden for valg for planlegging bestråling av ondartede glioma, som inneholder både informasjon som kreves for målretting (MRI-baserte volumer) og dose beregninger (CT-baserte elektron tetthet).
Du kan redusere gapet mellom små dyr bestråling og klinisk praksis, må MRI klart integreres i arbeidsflyten for mikro-irradiator, som krever en korrekt registrering mellom Mr og CT, som er langt fra ubetydelig. I dette papiret, våre Protokoll for MRI-guidede 3D conformal bestråling av F98 glioblastom i rotter er diskutert, publisert som har vært nylig17.
Selv om omfatter CT og MRI i arbeidsflyten mikro-irradiator er et klart skritt fremover i små dyr bestråling forskning, tillater disse anatomiske Bildeteknikker alltid ikke en fullstendig definisjon av målvolumet. Patologiske forandringer i hjernen på CT og MRI er preget av økt vann innhold (ødem) og lekkasje av blod - hjerne barrieren eller kontrast ekstrautstyr. Både kontrastforbedring og hyperrealistiske intens områder på T2-vektet MRI er imidlertid ikke alltid et nøyaktig mål på svulst grad.Kreftceller påvist langt utover marger kontrastforbedring12. Ingen av disse teknikkene kan også identifisere de mest aggressive delene i svulsten, som kan være ansvarlig for terapeutisk motstand og svulst regelmessighet. Derfor, tilleggsinformasjon fra molekylær Bildeteknikker som PET kan ha en merverdi for RT målet kvantum definisjon fordi disse teknikkene aktiverer visualisere biologiske veier i vivo12,18, 19.
I 2000 introduserte Ling et al. begrepet biologiske målvolumet (BTV) ved å integrere anatomiske og funksjonelle bildebehandling i strålebehandling arbeidsflyten, fører til det de kalte flerdimensjonale conformal strålebehandling20. Dette oppretter muligheten til å forbedre dose mål ved å levere en ikke-uniform dose til et mål område med for eksempel PET bilder. Mest brukte PET tracer for svulst regi og for å dataskjerm behandling respons er fluor-18 (18F) merket fluorodeoxyglucose (FDG), som visualiserer glukose metabolisme21. I hode og nakke kreft, har tidligere studier vist at bruken av 18F-FDG PET førte til et bedre estimat av faktiske svulst volumet, som definert av patologisk prøver, sammenlignet med CT og MRI22. I primære hjernen er svulster, hvor FDG ikke er nyttig på grunn av meget sterk bakgrunn signalet fra normal hjernen, aminosyrer, som 11C-metionin og nylig 18F-fluoroetthyltyrosine (FET), gransket for GTV avgrensning ofte store forskjeller mellom aminosyre PET og MRI-baserte GTVs23. Men er ingen potensiell rettssak undersøker betydningen av dette funnet utført ennå. I denne studien valgt vi aminosyre tracer 18F-FET og hypoksi tracer 18F-fluoroazomycin-arabinoside (18F-FAZA). 18 F-FET og 18F-FAZA ble valgt fordi en økt aminosyre opptak er sterkt korrelert med spredning ofte i GB svulster, mens opptaket av en hypoksi PET-spor er korrelert med motstand mot (kjemoterapi) strålebehandling18 , 23. sub volumet øker med mikro-irradiator var optimalisert ved å gi en ekstra stråledose til en PET-definert del av F98 GB svulst i rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble godkjent av den etiske komiteen for dyreforsøk (ECD 09/23 og ECD 12/28). Alle kommersielle detaljer finnes i Tabell for materiale.
1. F98 GB rotte celle modell
- Kultur F98 GB cellene, Hentet fra ATCC, i monolayers Dulbeccos endret Eagle Medium, 10% kalv serum, 1% penicillin, 1% streptomycin, 1% L-glutamin og 0,1% amfotericin b, og plasser i en CO2 inkubator (5% CO2 og 37 ° C).
- Vaksinere glioma celler i hjernen av Fischer F344 hunnrotter (kroppsvekt 170 g).
- Bruke sterilt instrumenter og bruke sterilt hansker til alle tider.
- Bedøve rotter ved å injisere en blanding av 74 mg/kg ketamin og 11 mg/kg xylazine intrapertioneally (IP) med en insulinsprøyte (1 mL, 29 G). Bekreft anesthetization ved fravær av svar på det uttak refleks av lem. Nakkens rotter i en stereotactic enhet med festepunkter for nese og ører. Sted en karbomer eye gel for å hindre tørrhet i øynene under anestesi.
- Barbere rotta fra øyehøyde til baksiden av skallen og rense huden med povidon-jod.
- Utsette skallen gjennom en midtlinjen hodebunnen snitt 2 cm, og gjøre en 1 mm hull (diamant drill) 2 mm bakre og 2,5 sideveis for bregma i den høyre frontal halvkulen.
- Sett inn en stereotactically guidede insulin nål (29 G) og injisere 5 µL celle suspensjon (20.000 F98 GB celler) 3 mm dyp ved hjelp av en microsyringe pumpe kontroller (innstillinger: injisere (I50), rate 1 nL/s (001 SDN)).
- Ta ut sprøyten sakte og stenger incision med bein voks. Sutur i huden og disinfect med povidon-jod.
- Stabilisere kroppstemperaturen av dyr etter operasjonen ved hjelp av en rød lampe. Overvåke oppvåkning av rotte før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Ikke tilbake dyret til selskapet av andre dyr til helt frisk. Holde alle dyr under miljømessig kontrollerte forhold (12 h vanlig lys/mørke sykluser, 20-24 ° C og 40-70% relativ fuktighet) med mat og vann ad libitum. Sørg for å følge dyrene tett ved å overvåke deres kroppsvekt, mat, vanninntak, og deres aktivitet og normalt. Bruk en dødelig dose pentobarbital natrium for å avlive dyrene (160 mg/kg) hvis en nedgang på 20% kroppsvekt er observert eller når normalt alvorlig forverres (f.eksmangel på grooming).
2. bestillingsbekreftelse Tumor vekst
Merk: Vurdere tumor vekst 8 dager etter vaksinering T2-vektet MRI, dynamisk kontrast forbedret MRI (DCE-MRI) og kontrast forbedret T1-vektet MRI. Når svulsten når en størrelse på 2,5 x 2,5 x 2,5 mm3, Velg rotta for terapi.
- Først koble en 30 G nål slik 60 cm lang som er plassert intravenøst i laterale hale blodåre. Bedøve rotter gjennom en forpart med 2% isoflurane blandes med oksygen (0,3 L/min). Bekrefte anesthetization når rotter ikke svarer det uttak refleks av lem. Dekke rotter med et oppvarmet teppe og plassere dem i Mr seng. Bruk en karbomer øye gel for å hindre tørrhet.
- Sted sengen i holderen med en fast rotte hjernen overflaten coil, og plasser sengen i en 72 mm rotte hele kroppen senderen spolen.
- Skanner localizer etterfulgt av avsøking T2-vektet spin-echo å vurdere tumor vekst. T2-Mr sekvens detaljer: 3661 TR/TE/sett 37,1 ms, 109 µm isotropic i flyet oppløsning, slice tykkelse 600 µm, 4 gjennomsnitt, TA 9 min 45 s.
- Hvis svulst er bekreftet på T2-vektet oppkjøpet, injisere en gadolinium inneholder kontrast agent i intravenøst plassert slangen (MRI kontrast agent, 0.4 mL/kg) 30 s etter starten av DCE-Mr oppkjøpet. Erverve DCE-Mr under 12 min ved hjelp av en fast lav vinkel skutt (FLASH) rekkefølge i et enkelt stykke (1 mm skive tykkelse). Bruke en i-flyet romlig oppløsning på (312 µm2) og en midlertidig løsning av 1,34 s.
- Bruk bildet sekvens analyseverktøyet velge et område av interesse (ROI) i regionen mistenkt svulst tegne signal intensiteten over tid. Deretter analysere form av resulterende DCE kurven å bekrefte tilstedeværelse av glioblastom (Figur 3).
- Til slutt, erverve en kontrast forbedret T1-vektet spin-echo sekvens. T1-Mr sekvens detaljer: TR/TE 1539/9,7 ms, 117 µm isotropic i flyet oppløsning, slice tykkelse 600 µm, 3 gjennomsnittene, TA 4 min 15 s. typisk kontrast forbedret T1-vektet MR bildene er vist i figur 2.
- Etter fullfører T1-vektet sekvensen, kan dyret våkne opp under kontinuerlig tilsyn, før det gjenvinner full bevissthet.
3. multimodality Imaging for volum Målvalg
Merk: for å kunne utføre MRI-guidede 3D conformal bestråling av F98 GB rotte modell med PET-guidede sub volumet øker, 3 imaging modaliteter måtte utføres. Først injisere radiotracer, deretter utføre MRI under tracer opptak, deretter utføre en statisk PET anskaffelse og behandling planlegging CT.
- Bedøve dyrene en forpart med 2% isoflurane blandes med oksygen (0,3 L/min). Bekrefte anesthetization når rotter ikke svarer det uttak refleks av lem. Bruk en karbomer øye gel for å hindre tørrhet under anestesi.
- Sett et kateter (26 G) i halen venen, aktivere injeksjon av 37 MBq PET radioaktivt tracer oppløst i 200 µL saltvann. Injisere enten 18F-FET eller 18F-FAZA, 30 min eller 2t før PET oppkjøpet, henholdsvis.
- Injisere MRI kontrast agent (0,4 mL/kg) intravenøst i halen blodåre bruker kateter 15 min før PET oppkjøpet.
- Plasser rotter på en gjort Multimodalitet seng og sikre med krok og loop festene, opprettholde en fast stilling under bildebehandling og mikro-bestråling (figur 1).
- Fikse tre Multimodalitet markører (kapillærene fylt med vann) under ovenfor og på høyre side av skallen. Plasserer rotte, fortsatt fast på Multimodalitet sengen, i dyr innehaveren av Mr skanneren, fikse rotte hjernen overflaten spolen og plasser dette oppsettet i en 72 mm rotte hele kroppen senderen spolen. Skanner localizer etterfulgt av en kontrast forbedret T1-vektet spin-echo sekvens.
- Transportere dyr for å utføre en 18F-FET eller 18F-FAZA PET oppkjøpet. Få en 30 min statisk PET scan i liste-modus. Skanningen bør være ervervet enten 30 min etter 18F-FET injeksjon eller 2t etter 18F-FAZA injeksjon.
4. RT behandlingsplanlegging
- Bruke pre-klinisk behandling planlegging system (PCTPS) for behandlingsplanlegging. Importere planlegging CT til PCTPS og manuelt segment CT bildet inn i tre ulike vev klasser: bein, bløtvev og luft. Denne manuelle segmentering er basert på definere tre ulike grå verdi terskler på planlegging CT Disse manuelt valgt grå verdi terskler bør velges slik at luften i hjernen er fraværende og at bein tykkelsen på skallen er null. Når disse grensene er definert, tildeles materiale tettheter av PCTPS for bein, bløtvev og luft (Figur 4).
- Hvis bare MRI veiledning er nødvendig, laste MRI-skanning og co registrerer med planlegging CT ved hjelp av PCTPS.
- Bruk rigid kropp transformasjoner (tre oversettelser og tre rotasjoner), Multimodalitet markører og skallen. Ved overliggende økt signal intensiteten av skallen på CT med svart signal på Mr, en presis blanding kan bli oppnådd (figur 5).
- Velg målet for bestråling i midten av svulsten kontrast-forsterke på T1-vektet MRI, se figur 6 og figur 7.
- Når PET tilleggsinformasjon skal inkluderes, kan du ta en CT/MRI/kjæledyr co-registrering ved hjelp av biomedisinsk bilde kvantifisering programvare (BIQS).
- Bruk verktøyet konturer i BIQS for å oppnå PET/MRI bilde fusion (Figur 8). Etter co-registrering, velge målet midt i de økte PET tracer opptak i BIQS (figur 9) og angi koordinatene manuelt i PCTPS bruker disse transformasjonene: X → -X, Y → Z og Z → -Y.
- Velg foreskrevet dose, antall buer, arc posisjon, rotasjon rekke buer og collimator størrelse (Figur 10).
- MRI-guidede RT, bruker følgende innstillinger: en foreskrevet dose av 20 Gy, 3 buer på sofaen vinkler-45 °, 0 ° og 45 ° med bue rotasjoner av 120 °, og en collimator størrelse 5 x 5 mm.
- For PET-MRI-guidede RT, bruker du følgende innstillinger: en foreskrevet dose av 20 Gy bruker 3 buer og en 5 x 5 mm collimator og ekstra 5 Gy for sub volumet øker med 3 ikke-coplanar buer og en 1 x 1 mm collimator. Velg en rotasjon av 120 ° for alle buer mens du endrer plasseringen av sofaen (-45 °, 0 ° og 45 °).
- Beregne dose fordelingen dyret og parameterne bjelke levering å levere foreskrevet dosen til målet ved hjelp av PCTPS. Før selve bestråling, teste bue rotasjoner i forskjellige sofaen plasseringene å unngå en kollisjon under bestråling.
- For det faktiske irradiation, Velg filtere 0.15 mm kopperrør, sette X-ray spenning til 220 kV, angi X-ray gjeldende 13 mA, og plasseringen av høyre collimator på Portal. Utføre RT overføre parameterne riktig bjelke levering fra PCTPS til mikro-irradiator.
- Under disse prosedyrene, rotta holdes under kontinuerlig isoflurane anestesi (2% isoflurane, blandet med oksygen 0,3 L/min). Etter gjennomføringen av siste buen, dyret kan våkne opp under kontinuerlig tilsyn, før det gjenvinner full bevissthet.
5. dose volum histogrammer (DVHs)
Merk: For å sammenligne faktiske dosen levert til tumor målet volumene og de omkringliggende vev for normal hjerne, beregne DVHs.
- Tegne et volum steder (VOI) rundt svulsten og normal hjernen på T1-vektet kontrast forbedret MR bildene for å beregne gjennomsnitt, maksimums- og minimumsverdiene dose (Figur 11).
- Beregn D2, D-50, og D90som et surrogat for maksimal, mener og minimal dose svulst volumet og normal hjerne vev volumet. D står for dosen mottatt av x % av volumet, merket med delskriptet, og kan være avledet fra den resulterende DVH.
6. TMZ og humbug kjemoterapi
- Å etterligner behandlingen av glioblastom hos pasienter, administrere samtidig kjemoterapi bruke IP injeksjoner av 29 mg/kg TMZ oppløst i saltvann med 25% dimethylsulfoxide (DMSO) en gang om dagen i 5 dager fra dagen bestråling24, 25. Bruk 1 mL, 29 G insulinsprøyte administrere injeksjon.
- For kontrollgruppen, administrere injeksjon fra trinn 6.1 uten TMZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å etterligne menneskelige behandling metodikken for bestråling av glioblastom i en prekliniske modell, var inkludering av MRI-guidede strålebehandling nødvendig. Bruker PCTPS og mikro-irradiator grensesnittet kunne vi irradiate F98 glioblastom i rotter med flere conformal ikke-coplanar buer målretting regionen kontrast forbedret på T1-vektet MRI17. Rigid kropp transformasjoner i kombinasjon med en multi-modalitet seng ble brukt for bildet registrering mellom Mr og planlegging CT. Isocenter for bestråling ble valgt i midten av regionen kontrast forbedret svulst på T1-vektet MRI (figur 7).
Dose distribusjoner og kumulative DVHs av mening, minimal og maksimal dose av målvolumet og normal hjerne vev volumet ble beregnet for fem ulike dyr (Figur 12). Basert på likhet med klinisk bestråling protokollen og en optimal dose distribusjon, ble en dose plan med tre ikke-coplanar buer valgt. Bruke sistnevnte, mottatt 90% av målvolumet ønsket dose, samtidig som dosen til normal hjerne vev17.
Etter å ha bekreftet muligheten for MRI-guidede bestråling av F98 rotte glioblastom modell, prøvde vi å innlemme PET-baserte sub volumet øker i preklinisk arbeidsflyten for RT planlegging. Vi var i stand til å kombinere 3 tenkelig modaliteter, utfører første Mr og PET, og endelig CT mens rotta er løst på en huset gjort Multimodalitet seng (figur 1). For co-registrering av disse modaliteter brukte vi BIQS, aktivere mye mer verktøy for stive samsvarende (Figur 8). Bruke en enkel transformasjon, både MR basert og PET basert isocenter (figur 9) kan overføres til PCTPS. I figur 13vises både Mr og PET-baserte isocenter for bestråling etter dose beregning i PCTPS. For å irradiate hele kontrast-forsterke volumet vi valgte en 5 x 5-collimator og tre buer roterende 120 °. For å øke den mest metabolically aktiv svulst delen på 18F-FET PET eller den mest hypoxic svulst delen på 18F-FAZA PET, var en dose av 5 Gy valgt og levert med en collimator av 1 mm diameter. Igjen, 3 buer roterende 120 ° brukes.
Figur 1: Micro-irradiator integrere en kV X-ray tube, en roterende Portal, en datastyrt robot scene, et collomating system figuren strålen og en flatskjerm-CT detektor. Dyret er plassert på en 4 mm tykk PVC Multimodalitet seng å hindre flytting mellom flere tenkelig oppkjøp, for eksempel en Mr-skanning etterfulgt av planlegging CT, som muliggjør bilde fusion. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: glioblastom bekreftelse. T1-vektet MRI, T2-vektet MRI og DCE-Mr av rotte F98 GB. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: DCE kurve. Bruke bildet sekvens analyseverktøyet, en avkastning kan velges på DCE-MRI-skanning tegne signal intensiteten over tid. Deretter er analyse av formen på den resulterende DCE-kurven kunne bekrefte tilstedeværelse av glioblastom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: CT segmentering. Segmentering basert på CT gjøres ved manuelt definere en rekke terskelverdier å skille nøyaktig luft fra lungevev, fett vev, bein og andre vev i bildet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Mr-CT fusion. Ved å legge økt signal intensiteten av skallen på CT med svart signal på Mr, kan en presis blanding oppnås. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Cone beam CT. Ingen svulst vises på CT, gjør det umulig å velge isocenter i midten av svulsten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: kontrast forbedret T1-vektet MRI. Kontrast forbedret T1-vektet Mr visualiserer klart en rotte F98 hjernesvulst. Midten av kontrastforbedring er valgt som isocenter for RT planlegging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: MRI-PET fusion. Bruke verktøyet konturer i BIQS, er PET/MRI bilde blanding oppnådd.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: MRI-PET Målvalg. Målet for bestråling velges i midten av kontrastforbedring på T1-vektet MRI (venstre). Målet for sub volumet øker velges i midten av økt signalet på 18F-FET PET (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: strålebehandling planlegging. Beregne strålebehandling planlegging, velger isocenter, foreskrevet dose, antall buer, arc posisjon, rotasjon rekke buer og collimator størrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11: DVH beregning. Tegne et volum steder (VOI) rundt svulst på T1-vektet kontrast forbedret MR bildene for å beregne DVH i dette volumet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12: Dose plan med kontrast forbedret T1-vektet Mr og tre ikke-coplanar arcsto levere 20 Gy til målvolumet. Den kumulative Dose volum Histogram (DVH) av svulst volumet og normal hjernevev avgrenset på kontrast forbedret T1-vektet MRI gis til høyre. Dette tallet har blitt endret fra Bolcaen et al. 20 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 13: valgt Mr og PET-guidede isocenter for bestråling. CT-bilde i aksial, koronale og sagittal er visualisert med dose planen levere 20 Gy målregion (gul-regionen). Isocenter som ble identifisert på kontrast-forsterke MRI er synlig (grønn) og isocenter lokalisert på den metabolically aktiv svulst delen på 18F-FET PET er også synlig (rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å oppnå nøyaktig bestråling av glioblastom svulst målet i rotte hjernen, var mikro-irradiator's on-board CT veiledning ikke tilstrekkelig. Hjernesvulster er knapt synlig på grunn av utilstrekkelig bløtvev kontrast, selv om kontrast ekstrautstyr ville bli brukt. Som sådan, må MRI tas for å tillate mer presis bestråling. Bruke en sekvensiell MR anskaffelse på et 7 T-system og en CT oppkjøp på mikro-irradiator kunne vi målrette dosen til kontrast-forsterke tumor vev i hjernen og beregne en dose plan med planlegging CT Dette var mulig etter bildet fusion og dose beregninger ved hjelp av PCTPS-17. Men bør det holdes i bakhodet at Mr er utsatt for geometriske skjevheter som ikke rettes opp i denne protokollen. Videre før oversette denne bestråling protokollen til andre deler av kroppen, er videre forskning nødvendig. Betydningen av en nøyaktig vev segmentering på grunn av bruk av lavere kV energi fotoner bør vurderes. Mens segmentering i tre vev klasser kan være tilstrekkelig i rotte hjernen, må flere vev klasser angis i regionen thorax eller abdominal rotter å gi nøyaktige dose beregninger. For å unngå bevegelse under transport mellom forskjellige tenkelig systemer, vi gjort bruk av en Multimodalitet seng som minimerer bevegelse av hodet (figur 1). Men er en ekstra innsats nødvendig når du bruker denne protokollen på andre kroppsdeler, thorax eller abdominal regioner. Spesielt små dyr bestråling av organer påvirket av respiratoriske bevegelse eller intestinal transitt er fortsatt utfordrende.
Inkorporering av PET-guidede sub volumet øker ble også vist å være mulig, til tross for en arbeidskrevende protokoll. En fordel med kjernefysiske imaging teknikker, som PET, er muligheten til å image heterogenitet i svulster, hvilke innrømmer målretting metabolically svært aktiv eller stråling motstandsdyktig deler av svulsten. Vi klarte å øke dosen, rettet på biologisk aktive eller mest hypoxic regionen av svulsten med 18F-FET PET eller 18F-FAZA PET, henholdsvis. Det kritiske trinnet i protokollen er bildet co-registrering. Foreløpig er ingen programvare kjøpedyktig co Registrer automatisk pre-klinisk MRI eller CT med PET bilder med tilstrekkelig nøyaktighet og reproduserbarhet. Generelt, PET tracers i Nevro-onkologi viser en lav opptak i normal hjerne som kompliserer registreringsprosessen. For blanding av tre tenkelig modalitetene (CT/MRI/PET) foretrukket vi BIQS snarere enn PCTPS, som ikke er for øyeblikket utviklet for å sette sammen flere tenkelig modaliteter. Videre har til BIQS flere smarte verktøy for stive samsvar. En stor hjelp er også bruk av en multi-modalitet seng, hindrer bevegelse av dyret mellom forskjellige tenkelig oppkjøpene. Men manuell co-registrering er tidkrevende og øker tiden bedøvelse av dyrene. Når bildet registrering er oppnådd, var eksportere koordinatene fra BIQS til PCTPS mulig ved å bruke en enkel transformasjon på målkoordinaten.
Det er ikke bare viktig å målrette (biologiske) svulst volumet: sparing av de omkringliggende vev for normal hjerne må tas i betraktning også. Sistnevnte er ofte neglisjert i gjeldende dyr strålebehandling eksperimenter, men svært viktig å gjøre modellen også klinisk relevant. Dette ble oppnådd ved å bruke flere ikke-coplanar buer. Vi vet, ble flere bue skallen bestråling i små dyr aldri brukt før. Med hensyn til bruk av bjelke er denne metoden i nær likhet med klinisk bilde-guidede conformal RT og skyldes bruk av arc behandling målet til slutt får foreskrevet dose, mens normale vev får bare en brøkdel av den. Som er et første skritt laget for å redusere gapet mellom prekliniske og kliniske RT teknologi17. En begrensning av denne mikro-irradiator er at gantry rotasjon er begrenset til 120 °. Kombinere bue rotasjoner med en endring i sofaen posisjon ytterligere økt sparing av normal hjernevevet rundt tumor målet.
Denne metoden er et viktig skritt mot inkludering av biologiske tenkelig modaliteter for strålebehandling veiledning. Nye utbygginger er imidlertid nødvendig å forenkle pre-klinisk bilde fusion og å innlemme dose maleri av tall (DPBN) i preklinisk programmer. Bruke den gjeldende mikro-irradiator, er vi nå kan bruke sub volumet øker; men er DPBN ennå ikke mulig på grunn av begrensninger i dose beregninger, gantry rotasjoner og collimator design. Til slutt, utvikling av kompakte prekliniske PET skannere tilbyr sub millimeter romlig oppløsning er lovende26 og disse enhetene kan gi en svært elegant løsning å integrere PET en liten dyr stråling plattform.
Vi demonstrerte anvendbarheten av denne modellen for kombinert Mr og PET-guidede bestråling og kjemoterapi av glioblastom i rotter og for fremtidig forskning på ny legemiddelselskap for glioblastom. Videre er bruk av PET-guidede sub volumet øker et første skritt mot inkorporering av en BTV i stråling behandlingsplanlegging av små dyr kreft modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Stichting Luka Hemelaere og Soroptimist International for å støtte dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GB RAT model | |||
| F98 Glioblastoma cell line | ATCC | CRL-2397 | |
| Fischer F344/Ico crl Rats | Charles River | N/A | http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/fischer-344-rat |
| Micropump system | World Precision Instruments | UMP3 | Micro 4: https://www.wpiinc.com/products/top-products/make-selection-ump3-ultramicropump/#tabs-1 |
| Stereotactic frame | Kopf | 902 | Model 902 Dual Small Animal Stereotaxic frame |
| diamant drill | Velleman | VTHD02 | https://www.velleman.eu/products/view/?id=370450 |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | https://www.aesculapusa.com/products/wound-closure/hemostatic-bone-wax |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| InfraPhil IR lamp | Philips | HP3616/01 | |
| Ethilon | Ethicon | 662G/662H | FS-2, 4-0, 3/8, 19 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM | Invitrogen | 14040-091 | |
| Penicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-032 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-224 | |
| Falcons | Thermo Scientific | 178883 | 175 cm2 nunclon surface, disposables for cell culture with filter caps |
| Cell freezing medium | Sigma-aldrich | C6164 | Cell Freezing Medium-DMSO, sterile-filtered, suitable for cell culture, endotoxin tested |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal irradiation | |||
| Micro-irradiator | X-strahl | SARRP | |
| software for irradiation | X-strahl | MuriPlan | pre-clinical treatment planning system (PCTPS), version 2.0.5. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal PET | |||
| microPET system possibility 1 | Molecubes | B-Cube | http://www.molecubes.com/b-cube/ |
| microPET system possibility 2 | TriFoil Imaging, Northridge CA | FLEX Triumph II | http://www.trifoilimaging.com |
| PET tracers | In-house made | 18F-FDG, 18F-FET, 18F-FAZA, 18F-Choline | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal MRI | |||
| microMRI system | Bruker Biospin | Pharmascan 70/16 | https://www.bruker.com/products/mr/preclinical-mri/pharmascan/overview.html |
| Dotarem contrast agent | Guerbet | MRI contrast agent, Dotarem 0,5 mmol/ml | |
| rat whole body transmitter coil | Rapid Biomedical | V-HLS-070 | |
| rat brain surface coil | Rapid Biomedical | P-H02LE-070 | |
| Water-based heating unit | Bruker Biospin | MT0125 | |
| 30 G Needle for IV injection | Beckton-Dickinson | 305128 | 30 G |
| PE 10 tubing (60 cm/injection) | Instech laboratories, Inc | BTPE-10 | BTPE-10, polyethylene tubing 0.011 x .024 in (0.28 x 60 mm), non sterile, 30 m (98 ft) spool, Instech laboratories, Inc Plymouth meeting PA USA- (800) 443-4227- http://www.instechlabs.com |
| non-heparinised micro haematocrit capillaries | GMBH | 7493 21 | these capillaries are filled with water to create markers visible on MRI and CT |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| isoflurane: Isoflo | Zoetis | B506 | Anaesthesia |
| ketamine: Ketamidor | Ecuphar | Anaesthesia | |
| xylazine: Sedaxyl | Codifar NV | Anaesthesia | |
| catheter | Terumo | Versatus-W | 26G |
| Temozolomide | Sigma-aldrich | T2577-100MG | chemotherapy |
| DMSO | Sigma-aldrich | 276855-100ML | |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image analysis | |||
| PMOD software | PMOD technologies LLC | PFUS (fusion tool) | biomedical image quantification software (BIQS), version 3.405, https://www.pmod.com/web/?portfolio=22-image-processing-pfus |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia-equipment | |||
| Anesthetic movabe unit | ASA LTD | ASA 0039 | ASA LTD, 5 valley road, Keighley, BD21 4LZ |
| Oxygen generator | Veterinary technics Int. | 7F-3 | BDO-Medipass, Ijmuiden |
References
- Stupp, R., et al. Promising survival for patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme treated with concomitant radiation plus temozolomide followed by adjuvant temozolomide. J Clin Oncol. 20 (5), 1375-1382 (2002).
- Dhermain, F. Radiotherapy of high-grade gliomas: current standards and new concepts, innovations in imaging and radiotherapy, and new therapeutic approaches. Chin J Cancer. 33 (1), 16-24 (2014).
- Ahmed, R., et al. Malignant gliomas: current perspectives in diagnosis, treatment, and early response assessment using advanced quantitative imaging methods. Cancer Manag Res. 6, 149-170 (2014).
- Verhaegen, F., Granton, P., Tryggestad, E. Small animal radiotherapy research platforms. Phys Med Biol. 56 (12), R55-R83 (2011).
- Kinsella, T. J., Vielhuber, K. A., Kunugi, K. A., Schupp, J., Davis, T. W., Sands, H. Preclinical toxicity and efficacy study of a 14-day schedule of oral 5-iodo-2-pyrimidinone-2-deoxyribose as a prodrug for 5-iodo-2-deoxyuridine radiosensitization in U251 human glioblastoma xenografts. Clin Cancer Res. 6 (4), 1468-1475 (2000).
- Vellimana, A. K., et al. Combination of paclitaxel thermal gel depot with temozolomide and radiotherapy significantly prolongs survival in an experimental rodent glioma model. J Neurooncol. 111 (3), 229-236 (2012).
- Kioi, M., Vogel, H., Schultz, G., Hoffman, R. M., Harsh, G. R., Brown, J. M. Inhibition of vasculogenesis, but not angiogenesis, prevents the recurrence of glioblastoma after irradiation in mice. J Clin Invest. 120 (3), 694-705 (2010).
- Vinchon-Petit, S., Jarnet, D., Jadaud, E., Feuvret, L., Garcion, E., Menei, P. External irradiation models for intracranial 9L glioma studies. J Exp Clin Cancer Res. 29, 142 (2010).
- Yang, W., et al. Convection enhanced delivery of carboplatin in combination with radiotherapy for treatment of brain tumors. J Neurooncol. 101 (3), 379-390 (2011).
- Rousseau, J., et al. Efficacy of intracerebral delivery of cisplatin in combination with photon irradiation for treatment of brain tumors. J Neurooncol. 98 (3), 287-295 (2010).
- Baumann, B. C., et al. An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the small animal radiation research platform. Transl Oncol. 5 (4), 230-237 (2012).
- Grosu, A. -L., et al. Implications of IMT-SPECT for postoperative radiotherapy planning in patients with gliomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 54 (3), 842-854 (2002).
- Butterworth, K. T., Prise, K. M., Verhaegen, F. Small animal image-guided radiotherapy: Status, considerations and potential for translational impact. Br J Radiol. 88 (1045), 4-6 (2015).
- Aird, E. G. A., Conway, J. CT simulation for radiotherapy treatment planning. Br J Radiol. 75 (900), 937-949 (2002).
- Baker, G. R. Localization: Conventional and CT simulation. Br J Radiol. 79 (Spec No 1). , S36-S49 (2006).
- Corroyer-Dumont, A., et al. MRI-guided radiotherapy of the SK-N-SH neuroblastoma xenograft model using a small animal radiation research platform. Br J Radiol. 90 (1069), 20160427 (2017).
- Bolcaen, J., et al. MRI-guided 3D conformal arc micro-irradiation of a F98 glioblastoma rat model using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP). J Neurooncol. 120 (2), 257-266 (2014).
- Niyazi, M., et al. FET-PET for malignant glioma treatment planning. Radiother Oncol. 99 (1), 44-48 (2011).
- Grosu, A. L., et al. First experience with I-123-alpha-methyl-tyrosine SPECT in the 3-D radiation treatment planning of brain gliomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 47 (2), 517-526 (2000).
- Ling, C. C., et al. Towards multidimensional radiotherapy (MD-CRT):biological imaging and biological conformality. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 47 (3), 551-560 (2000).
- Wahl, R. L., Jacene, H., Kasamon, Y., Lodge, M. A. From RECIST to PERCIST: Evolving Considerations for PET response criteria in solid tumors. J Nucl Med. 50 Suppl 1. (5), 122S-150S (2009).
- Daisne, J. F., et al. Tumor volume in pharyngolaryngeal squamous cell carcinoma: comparison at CT, MR imaging, and FDG PET and validation with surgical specimen. Radiology. 233 (1), 93-100 (2004).
- Grosu, A. -L., Weber, W. PET for radiation treatment planning of brain tumours. Radiother Oncol. 96 (3), Elsevier Ireland Ltd. 325-327 (2010).
- Banissi, C., Ghiringhelli, F., Chen, L., Carpentier, A. F. Treg depletion with a low-dose metronomic temozolomide regimen in a rat glioma model. Cancer Immunol Immunother. 58, 1627-1634 (2009).
- Robinson, C. G., et al. Effect of alternative temozolomide schedules on glioblastoma O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase activity and survival. Br J Cancer. 103, 498-504 (2010).
- España, S., Marcinkowski, R., Keereman, V., Vandenberghe, S., Van Holen, R. DigiPET: sub-millimeter spatial resolution small-animal PET imaging using thin monolithic scintillators. Phys Med Biol. 59 (13), 3405 (2014).
