Analyse af Transforming Growth Factor ß Familie kavalergang produkter udskilles i Blastocoele af Xenopus laevis embryoner

Summary

Når Transforming Growth Factor ß familie prækursor proteiner er ektopisk udtrykt i Xenopus laevis embryoner, de dimerize, få kløvet og udskilles i blastocoele, som begynder ved den sene blastula til tidlig gastrula fase. Vi beskriver en metode til at aspirere kavalergangsprodukter fra blastocoele hulrum til immunblod analyse.

Abstract

De to arme i superfamilien Transforming Growth Factor ß (Tgfß), repræsenteret ved henholdsvis Tgfß/Nodal eller Bone morfogenetisk protein (Bmp) ligands, spiller en væsentlig rolle i embryonal udvikling og voksen homøostase. Medlemmer af Tgfß-familien er lavet som inaktive prækursorer, der dimeriserer og foldes inden for endoplasmisk reticulum. Forløberen er efterfølgende spaltet i ligand og prodomain fragmenter. Selv om kun dimeric ligand kan engagere Tgfß receptorer og aktivere downstream signalering, der er stigende erkendelse af, at den fremherskende moiety bidrager til ligand aktivitet. I denne artikel beskrives en protokol, der kan bruges til at identificere kavalergangsprodukter, der genereres under aktivering af Tgfß-prækursorproteiner. RNA-kodning af Tgfß-prækursorer injiceres først i X. laevis-embryoner. Den følgende dag indsamles kavalergangsprodukter fra blastocoele af gastrula fase embryoner og analyseres på vestlige blots. Denne protokol kan udfyldes relativt hurtigt, kræver ikke dyre reagenser og giver en kilde til koncentrerede Tgfß kavalergangsprodukter under fysiologiske forhold.

Introduction

Medlemmer af Transforming Growth Factor ß (Tgfß) er syntetiseret som inaktive, dimerized forløber proteiner. Prækursorerne er derefter spaltet af medlemmer af proprotein convertase (PC) familie, enten inden for sekretorisk vej eller uden for celler. Dette skaber en aktiv, disulfid-bundet ligand dimer og to fremherskende^{fragmenter 1}. Selv om det har været kendt i over 30 år, at prodomain af Tgfß familie prækursorer er forpligtet til at generere en aktiv ligand², forståelsen af, hvordan prodomains bidrage til ligand funktion er ufuldstændig.

Selv om forståelsen af processen med proteolytisk aktivering af Tgfß-familiemedlemmer fortsat er ufuldstændig, er der stigende interesse for at forstå, hvilke pc-konsensusmotiver der er spaltet in vivo, om kavalergangen forekommer i et bestemt subcellulært eller ekstracellulært rum, og om prodomain forbliver kovalent eller noncovalent forbundet med den spaltede ligand³. Flere undersøgelser har vist, at prodomain ikke kun guider ligand foldning før kavalergang^4,5, men kan også påvirke vækstfaktor stabilitet og rækkevidde af handling^6,7,8,9, drive dannelsen af homodimers eller heterodimers¹⁰, forankre ligand i den ekstracellulære matrix til at opretholde ligand latency¹¹, og i nogle tilfælde fungere som en ligand i sin egen ret til at aktivere heterologe signalerer¹². Heterozygotpunktmutationer inden for mange medlemmer af Tgfß-familien er forbundet med øjen-, knogle-, nyre-, skelet- eller andre defekter hos mennesker³. Disse resultater understreger prodomain's kritiske rolle med hensyn til at skabe og opretholde en aktiv ligand og understreger vigtigheden af at identificere og dechifrere kavalergangsprodukternes rolle, der er udviklet under proteolytisk modning af Tgfß-familieprækursorer.

Her beskriver vi en detaljeret protokol for aspirerende kavalergangsprodukter, der genereres under modning af Tgfß familieprækursorer fra blastocoele af X. laevis embryoner og derefter analysere dem på immunblots. Denne protokol kan bruges til at afgøre, om et eller flere pc-konsensusmotiver i et prækursorprotein er spaltet i vivo^10,13, identificere de endogene pc'er, der spalter hvert motiv^13,14, sammenligner in vivo dannelse af Tgfß familie enslyniker versus heterodimers¹⁰ eller analysere, om menneskelige sygdomsrelaterede punktmutationer i Tgfß prækursorer påvirker deres evne til at danne funktionelle dimeriske ligands.

Protocol

Alle beskrevne procedurer er godkendt af Den Institutionelle Komité for Dyrepleje og Anvendelse (IACUC) fra University of Utah. Frøer har til huse i en IACUC godkendt facilitet. Hanfrøer aflives ved nedsænkning i tricain efter ved at klippe hjertelidten. Kvindelige frøer er anbragt i laboratoriet i højst 24 timer efter hormonel induktion af gydning for at give mulighed for ægopsamling og returneres derefter til plejefaciliteten.

1. Indsamling af X. laevis Testikler

1. Bedøve en seksuelt moden mand i 0,2% Tricain (tabel 1) i 30-40 minutter, indtil dyret ikke reagerer på at klø klemme.
2. Brug stumpe sammentrækninger til at trække huden væk fra kroppens væg. Lav et vandret snit i huden på tværs af underlivet ved hjælp af kirurgisk saks. Lav et parallelt snit i den underliggende kropsvæg, og derefter en tredje, vinkelret snit gennem kroppen væggen op gennem brystkassen.
   1. Fold de resulterende flaps tilbage, find hjertelidten og klip basen for at ekssanguinate og sikre døden.
3. Træk de gule fedtlegemer ud af maven med stumpe sammentrækninger og find testiklerne på hver side, der ligger til grund for bunden af fedtkroppe. Fjern hver testis ved klipning det væk fra fedt organer og eventuelle vedhæftede indvolde ved hjælp af kirurgisk saks.
4. Overfør testikler til en petriskål, der indeholder 1x Modificeret Barths løsning (MBS) (tabel 1). Skyl og fjern eventuelle klæbende blodkar eller vedhæftede indvolde.
   1. Den ene testis overføres til en 35 mm petriskål, der indeholder testisbuffer (tabel 1), til umiddelbar brug, og opbevar den anden i et 10 mL konisk rør fyldt med reagensbuffer til senere brug. Testis skal opbevares ved 4 °C, når den ikke anvendes, og vil forblive levedygtig i mindst to uger.
      BEMÆRK: Fotografier af testikler isolation kan findes i Reference 15.

2. Indsamling og befrugtning af X. laevis æg

BEMÆRK: Frøer skal håndteres med vinylhandsker eller hænder vaskes før og efter håndtering af frøerne. Latexhandsker, lotion og vaskemiddelrester på menneskelige hænder vil skade frøernes skrøbelige hud.

1. Aftenen før gydning injiceres 0,3 mL (1200 IE) af human chorionic gonadotropin (tabel 1) i ryglymfehinden på to eller tre modne X. laevis hunner ved hjælp af en 1 mL sprøjte udstyret med en 26 G nål. Brug en ny nål til hver injektion.
2. Efter injektionen placeres hunnerne i en forseglet beholder (ikke lufttæt) i en biologisk inkubator på 18 °C. Gydning begynder generelt 14-16 timer senere.
   BEMÆRK: Plastskuffer eller plastbeholdere med lufthuller skåret i låget fungerer godt til at holde kvinder natten over. Sørg for, at låget er fast for at forhindre frøer i at undslippe og udtørre i inkubatoren.
3. Hold kvinden over en 100 mm Petriskål indeholdende 1x MBS og tryk blidt på frøens underliv for at udvise æg i skålen.
4. Skær et lille stykke af testis (~ 1 /5) ved hjælp af et barberblad og overfør det til en 1,5 mL rør, der indeholder ~ 500 μL på 1x MBS. Knus med en pille støder eller væv homogenisator. Opbevar den resulterende sædaffjedring på is eller ved 4 °C til efterfølgende befrugtning samme dag.
5. Vip 100 mm Petriskålen for at hælde så meget af 1x MBS som muligt af, og fjern resten ved hjælp af en plastoverførselspipette. Påfør ca. 100 μL sædaffjedring, tilsæt ca. 1 mL 0,1x MBS og hvirvle for at blande.
   1. Efter 5 min, oversvømme fadet med dechloreret postevand eller 0,1x MBS og lad stå i 30 min.
      BEMÆRK: Vand kan dechloreres ved hjælp af et filter, eller kommunalt postevand kan stå udækket i mindst 24 timer, så kloren kan sprede sig i områder, hvor konventionel klor tilsættes til vandet. I områder, hvor chloramin tilsættes for at desinficere drikkevand, skal vandet i stedet behandles med en kommercielt tilgængelig balsam, der kan nedbryde kloramin.
      BEMÆRK: Æg opsamles i en høj saltopløsning (1x MBS) for at forhindre dannelsen af en geléfrakke, hvilket ville give en barriere for befrugtning. Efter befrugtning giver lavsaltopløsningen (dechloreret vand eller 0,1x MBS) mulighed for geléfrakkedannelse, og æggene klæber til hinanden og skålen. Æg, der er blevet befrugtet, vil rotere sådan, at den pigmenterede dyrestang vender opad inden for 30 minutter. Hvis dette ikke sker, og æggene ser sunde ud under mikroskopet, er sædens levedygtighed mistænkelig, og det kan være nødvendigt at høste nye testikler.
6. Hæld opløsningen, der dækker æggene og fyld petriskålen med frisklavet 2% cysteopløsning (Tabel 1). Hvirvle opløsningen i fadet i 3-5 min indtil geléfrakken er opløst, og æggene klæber ikke længere til hinanden eller skålen.
   1. Vip fadet og hæld forsigtigt cysteopløsningen af, eller fjern med en plastikpipette. Udskift med 1x DeBoers damvand (tabel 1). Hvirvle til skylning og dekanter.
   2. Gentag en vask med DeBoers løsning, en med 0,1 x MBS, og genopfyld fadet med 0,1x MBS. Efter fjernelse af geléfrakken bliver æggene mere skrøbelige og må ikke udsættes for luftvæskegrænsefladen.
7. Flyt de befrugtede æg til en biologisk inkubator på 16 °C, eller lad dem ligge på bænken ved stuetemperatur. Hvis den efterlades ved stuetemperatur, vil den første kavalergang forekomme 1-1,5 timer efter befrugtning, og efterfølgende kløfter vil forekomme ca. hvert 30. minut. Hvis embryoner derimod inkuberes ved 15-16 °C, vil der forekomme kløfter ca. hver time, og det vil være muligt at injicere et større antal embryoner fra en given gyde.

3. Mikroinjektion af X. laevis embryoner

1. Varm og træk glas kapillærer til et fint punkt ved hjælp af en mikropipette puller med følgende indstillinger: To-trins træk; Varme 1: 67,4 °C; Varme 2: 62 °C.
   BEMÆRK: Disse indstillinger er specifikke for mikropipettetrækkeren og glaskapillærerne, der bruges her (Materialetabel).
2. Under en dissekering mikroskop, klip spidsen af en trukket nål tæt på enden ved hjælp af Dumont # 5 sammentrækninger. Nålen skal være skarp, men ikke så tynd, at spidsen bøjer, når den kontakter embryoet. Figur 1 viser et eksempel på en korrekt trukket nål, der ikke er blevet klippet til mikroinjektion (A), og et, der er klippet (B).
3. Sæt nålen i en nåleholder, der er tilsluttet en mikroinjektor. Fastgør nåleholderen til en mikromanipulator. Placer 2-4 μL af udjævnet syntetisk RNA kodning Tgfß prækursor protein, der skal analyseres på et lille stykke parafilm under en dissekering mikroskop.
   1. Ved hjælp af mikromanipulatoren sænkes nålen ned i dråben, og brug fyldfunktionen på mikroinjektoren til at suge RNA ind i nålen. Sørg for at holde nålen under overfladen af dråben, og se fremskridt under mikroskopet for at undgå at suge luft ind i nålen.
      BEMÆRK: Hvis antistoffer, der genkender prodomain og / eller ligand domæne Tgfß prækursor, der skal analyseres ikke er tilgængelige, sekvens kodning en epitop tag (f.eks V5, myc, Flag) kan indsættes in-frame i cDNA, der vil blive brugt som en skabelon for RNA transskription. In vivobioaktiviteten af det mærkede protein skal sammenlignes med in vivobioaktiviteten af det mærkede protein for at sikre, at epitopen ikke forstyrrer korrekt foldning, kavalergang eller aktivitet.
4. Skub en dråbe af RNA-opløsningen ud i luften og mål dråbestørrelsen ved hjælp af et mikrometer monteret på injektionsfasen eller i mikroskopets okular. Juster faldstørrelsen til ca. 10 nL ved hjælp af tids- og trykkontrollerne på mikroinjektoren.
   BEMÆRK: RNA-koncentrationer i området 5-20 ng/μL er egnede til at levere 50-200 pg RNA i hvert embryo. Denne mængde RNA er generelt tilstrækkelig til at detektere kavalergangsprodukter i aspirater fra 10-20 embryoner. Det er bedst at sigte efter den laveste dosis RNA, der giver et påviseligt signal på immunblod. Større mængder RNA kan forårsage gastrulationsfejl, hvilket forstyrrer udvidelsen af blastocoele.
5. Flyt embryoner til en injektionsskål eller bakke, der indeholder 5% Ficoll i 0,1x MBS (Tabel 1), når de når 2-4 cellestadiet. En 35 mm Petriskål udstyret med et stykke nylonnet i bunden kan tjene som en billig injektionsskål, der vil holde embryonerne immobiliseret. Sæt nålen i nærheden af dyrestangen, og indsprøjt 10 nL RNA i en celle i hvert embryo.
   BEMÆRK: Embryoner kan nemt injiceres når som helst mellem den ene og 16 cellefase. Injektion af embryoet, efter at det er spaltet, sikrer, at ægget blev befrugtet, og at embryoet er sundt. Den nøjagtige placering af injektionen er ikke afgørende. En mere detaljeret beskrivelse af gydning, kultur og mikroinjektion af RNA'er i X. laevis embryoner findes i reference 15.
6. De injicerede embryoner overføres til en 35 mm petriskål fyldt med 5 % Ficoll i 0,1x MBS (tabel 1). Placer de små retter inde i en 150 mm Petriskål og dæk løst med et låg for at forhindre kulturmedierne i at fordampe. Kultur embryonerne natten over ved 15-16 °C.
   BEMÆRK: Dyrkning af embryoner i Ficoll hjælper med at hele injektionsstedet. Hvis fine nåle anvendes, dyrkning i 2-3% Ficoll er tilstrækkelig, mens 5% Ficoll foretrækkes, hvis tilsyneladende skader er observeret. Opbevaring af embryoner i Ficoll opløsning i 1-2 timer efter injektion er nok til at støtte heling, men natten inkubation beskadiger ikke embryoet, så længe opløsningen er ændret før starten af gastrulation.

4. Blastocoele Udvinding og analyse af Tgfß Kavalergang produkter

1. Den følgende morgen efter injektionen skal Ficollopløsningen fjernes og fjerne døde eller døende embryoner. Skyl embryonerne en eller to gange med 0,1x MBS, og kultur embryonerne i 0,1x MBS på bænken ved stuetemperatur.
   BEMÆRK: Embryoner kan også returneres til den biologiske inkubator på 16 °C for at bremse udviklingen.
2. Varm og træk glas kapillærer til et fint punkt ved hjælp af en mikropipette puller med følgende indstillinger: To trin træk; Varme 1: 67,4 °C; Varme 2: 62 °C.
   BEMÆRK: Disse indstillinger er specifikke for den puller og glas kapillær, der anvendes her (Tabel over materialer).
3. Under et dissekeringmikroskop klippes spidsen af en trukket nål af sammenkøjede. For at forhindre tilstopning skal åbningen af en nål, der anvendes til blastocoele aspiration, være større end i en nål, der anvendes til mikroinjektion. Et eksempel på en god trukket og klippet nål, der skal anvendes til blastocoele aspiration er vist i figur 1C. Sæt aspirationsnålen i nåleholderen, der er tilsluttet en mikroinjektor, og fastgør nåleholderen til en mikromanipulator.
   BEMÆRK: Den optimale nålediameter bestemmes empirisk af trial and error. Nåle med en stor diameter fyldes for hurtigt og gør det mere sandsynligt, at cellulære snavs vil komme ind i nålen. I modsætning hertil vil meget små diameter nåle sandsynligvis blive tilstoppet. Når en passende nål er genereret, er det nyttigt at generere flere nåle klippet på samme position.
4. Anbring embryoner i en injektionsbakke eller skål fyldt med 0,1x MBS, når de når tidligt til midten af gastrula-stadiet (fase 10-11).
5. Sæt nålen under overfladen af embryoet nær dyrestangen. Tryk på fyldknappen på mikroinjektoren, mens du kigger gennem dissekeringmikroskopet for at holde øje med nålen og embryoet. I løbet af få sekunder vil niveauet af klar væske stige i nålen, og embryoet vil kollapse og blive konkav.
   1. Hvis overskyet hvidt stof kommer ind i nålen, slip fyldknappen og pulser indsprøjteknappen en eller flere gange for at skubbe overskyet stof, som består af cellulære snavs, der sandsynligvis indeholder proteaser.
      BEMÆRK: Hvis blastocoele kollapser og cellerester kommer ind i nålen, så snart der trykkes på påfyldningsknappen, indikerer dette, at åbningen i nålen er for stor. Hvis blastocoele ikke kollapser, men hvidt stof kommer ind i nålen med det samme, viser dette, at nålen blev indsat for dybt og rører blastocoele gulvet. Skub det hvide stof ud, og gå videre til det næste foster. Aspirationshastigheden kan styres mere omhyggeligt ved at pulsere fyldknappen i stedet for at trykke på den kontinuerligt. Dette er især vigtigt, hvis åbningen i nålen er større end optimal.
6. Gentag trin 4.5, indtil væsken er indsugning fra blastocoele af 10-20 embryoner.
   BEMÆRK: Generelt er blastocoelevæske, der er indsugning fra 10-20 embryoner, tilstrækkelig til at detektere kavalergangsprodukter på immunblotter. Dette kan dog variere afhængigt af antistofkvalitet og skal bestemmes empirisk.
7. Læg et stykke paraffin på injektionsbakken og pipetten 1 μL nucleasefrit vand på den. Dyk nålen ned under vanddråben og tryk på indsprøjtningsknappen for at fjerne blastocoelevæsken i vandet.
   1. Alternativt kan du skubbe væsken direkte ud på parafilmen, men i dette tilfælde skal du trykke på indsprøjteknappen i stedet for at holde den nede. Dette udviser væsken under lavere tryk, hvilket forhindrer den i at flade ud på parafilmen, hvilket gør det vanskeligt at trække op i en pipette.
8. Overfør blastocoelevæsken til et sterilt mikrocentrifugrør på is. Forvent at høste ca. 0,3-0,5 μL blastocoelevæske pr. embryo. Tilsæt nukleasefrit vand for at justere det endelige volumen til 30 μL.
9. Overfør blastocoele væske-udtømte embryoner til et separat rør på is. Overskydende 0,1x MBS fjernes, og der tilsættes 200 μL kølet (4 °C) embryolyatbuffer (10 μL pr. embryo) (tabel 1). Pipette embryonerne op og ned 10-20 gange ved hjælp af en mikropipette, indtil de er fuldt homogeniseret, og ingen klumper tilbage.
10. Centrifugere de homogeniserede embryoner i et nedkølet mikrocentrifuge ved 10.000 x g i 10 min. Fjern 160 μL af supernatanten ved hjælp af en P200 pipette og overfør til et nyt rør på is, idet du er omhyggelig med at undgå de hvide æggeblommeproteiner og andet cellulært snavs i den nederste halvdel af røret.
    1. Gentag mikrocentrifugeringen én gang, og overfør 128 μL af det klare supernatant til et nyt rør på is. På dette tidspunkt kan ryddede embryolyater og blastocoelevæske opbevares ved -80 °C så længe som ønsket.
       BEMÆRK: Med nogle få undtagelser udskilles Tgfß-prækursorproteiner ikke i blastocoele og vil kun blive påvist i de udtømte embryolyater. I modsætning hertil ses Tgfß familie kavalergangsprodukter primært i blastocoelevæsken. Det er nyttigt at høste og analysere både embryolyset og blastocoelevæsken til de fleste formål. Dette giver som minimum en positiv kontrol for at sikre, at forløberen blev robust oversat og stabil. Derudover giver det en mulighed for at sammenligne relative nøgletal for kavalergangsprodukter med prækursorer mellem forskellige vilde typer eller mutantproteiner for at identificere mutationer, der gør det muligt at udskille intakte prækursorer i blastocoelevæske (f.eks. mutationer i pc-konsensusmotivet, der giver mulighed for korrekt foldning og sekretion uden kavalergang, i hvilket tilfælde den intakte forløber opdages i både embryo- og blastocoelevæsken) eller mutationer, der genererer fejlfoldede, ikke-kavalerbare proteiner (i hvilket tilfælde forløberen vil blive påvist i embryolyset, men kavalergangsprodukter vil være fraværende i blastocoelevæsken).
11. Deglycosylatproteiner, der findes i blastocoelevæske med PNGase F på dette tidspunkt ved at følge producentens anvisninger.
    BEMÆRK Der er ingen grund til at deglycosylatere prækursorproteiner, der findes i embryolyset, da disse repræsenterer endoplasmisk reticulum (ER)-residente former for forløberen, der mangler de komplekse N-forbundne oligosaccharider fjernet af PNGase F. I modsætning hertil har kavalergangsprodukter, der findes i blastocoelevæske, bevæget sig gennem trans-Golgi-netværket (TGN), hvor kulhydrater ændres yderligere og nu kan fjernes af PNGase F. Efter deglycosylation migrerer kavalergangsprodukter som et mere tæt kondenseret bånd på SDS-geler, som kan hjælpe med at visualisere, kvantificere og præcist identificere kavalergangsprodukter. Dette er ikke strengt påkrævet, men det kan være nyttigt, for eksempel hvis du forsøger at skelne mellem homodimers og heterodimers baseret på migrationsmønstre, eller hvis et kavalergangsprodukt indeholder heterogene kulhydrater, der får det til at migrere som et bredt fuzzy band.
12. Der tilsættes 5 μL reduktion af 4x prøvebuffer (tabel 1) til 15 μL blastocoelevæske og 15 μL klar embryolyt. Der tilsættes 5 μL ikke-reducerende 4x prøvebuffer (tabel 1) til de resterende 15 μL blastocoelevæske. Varm til 100 °C i 5 min og læg på is.
    BEMÆRK: Analyse af proteiner under ikke-reducerende forhold er afgørende for at analysere dannelsen af spaltede homodimeriske eller heterodimeriske ligands, men er ikke nødvendig, hvis det kun analyseres kavalergangssteder eller niveauer af spaltede proteiner. Med nogle få undtagelser udskilles prodomainfragmenter som monomerer. Desuden udfoldes forløberproteiner, der er til stede i embryolyset, primært, ER-hjemmehørende monomerer. Der er således ingen grund til at analysere disse produkter under ikke-reducerende forhold.
13. Forkædning af prækursorproteiner og kavalergangsprodukter ved elektroforese på 15 % SDS/polyacrylamidgeler.
14. Overfør proteiner fra gelen til en PVDF-membran ved hjælp af elektroforetetisk overførsel.
15. Inkuber membraner med passende antistoffer, der genkender prodomain og ligand domæne (eller epitop tags indsat i disse domæner), vask og inkubere med ordentlige sekundære antistoffer. Visualiser proteiner med chemiluminescens eller fluorescerende billeddannelse.

Representative Results

Eksperimentets mål beskrevet nedenfor var at afgøre, om Bmp4 og Bmp7 danner heterodimers (dimers bestående af en Bmp4 ligand og en Bmp7 ligand), homodimers (bestående af to Bmp4 eller to Bmp7 ligands), eller en blanding af hver, når de er co-udtrykt i X. laevis. Data vist i figur 2 er udvundet af en tidligere offentliggjort undersøgelse¹⁰. Figur 2A er et skematisk, der viser kavalergangsprodukter, der er genereret ved proteolytisk modning af Bmp4 eller Bmp7 homodimeriske prækursorer eller Bmp4/7 heterodimeriske prækursorer. Bmp4 er spaltet på to steder i prodomain at generere to fremherskende fragmenter (mørkegrønne og gule) og en dimerisk ligand fragment (lysegrøn), der migrerer på ~ 26 kDa på SDS-SIDE geler. Bmp7 er spaltet på et enkelt sted for at generere en prodomain fragment (rødbrun) og en dimeric ligand fragment (pink), der migrerer på ~ 35 kDa. Heterodimeriske ligands migrerer ved ~ 30 kDa. Sølvstangen i ligand dimers repræsenterer en myc-epitop tag indsat i dette domæne.

RNA-kodning af Bmp4myc- eller Bmp7myc-prækursorer (200 pg) eller begge RNA'er (100 pg af hver) blev injiceret i X. laevis embryoner i 2-4 cellestadiet. Embryonerne blev dyrket natten over ved 16 °C, indtil de nåede det tidlige gastrula-stadium. På dette tidspunkt blev væske indsugning fra blastocele af 20 embryoner i hver gruppe og sterilt vand blev tilsat for at bringe volumen til i alt 30 μL. Efter deglycosylation blev hver prøve opdelt i to rør. Reduktion af prøvebufferen blev tilføjet til det ene rør, og der blev tilføjet ikke-reducerende prøvebuffer til den anden. Prøverne blev opvarmet til 100 °C i 5 min. Proteiner blev derefter adskilt af SDS /PAGE og immunoblots blev undersøgt med antistoffer, der genkender myc-epitop tag (Figur 2B). Under reducerende forhold blev der fundet et enkelt bånd svarende til spaltede Bmp4-monomerer og et langsommere migrerende bånd svarende til spaltede BMP7-monomerer i lysater fra embryoner, der kun udtrykker henholdsvis Bmp4 eller Bmp7 (figur 2C, D, lavere panel, vognbaner 1, 2). Begge bånd blev påvist i embryoner co-udtrykke Bmp4 og Bmp7 (Figur 2C, D, lavere panel, vognbane 3). Relativt tilsvarende mængder Bmp4 og Bmp7 monomerer var til stede i hver af de tre grupper (lavere panel, reducere). I dette eksperiment, når proteiner blev adskilt under ikke-reducerende forhold, blev der fundet et enkelt modent Bmp4/7 heterodimerbånd af mellemmobilitet sammen med en spormængde af Bmp4 homodimer i embryoner, der sammen udtrykker Bmp4 og Bmp7 (Figur 2C, øverste panel). Ud fra disse resultater konkluderer vi, at hvis tilsvarende niveauer af Bmp4- og Bmp7-prækursorproteiner udtrykkes i Xenopus-embryoner, danner de fortrinsvis heterodimerer snarere end enten homodimer. I forsøget vist i figur 2Der der betydeligt mere Bmp7-protein til stede i forhold til Bmp4 (lavere panel, reduktion). Som følge heraf opdages Bmp4 homodimers i embryoner, der udtrykker både Bmp7- og Bmp4-prækursorproteiner, og i stedet er de tilgængelige Bmp4 til stede som en Bmp4/7-heterodimer, og de overskydende Bmp7 danner homodimerer. Mens dette eksperiment ikke er optimalt, da målet var at co-udtrykke den tilsvarende mængde Bmp4 og Bmp7 forløber, resultaterne er stadig i overensstemmelse med den konklusion, at Bmp4 og Bmp7 fortrinsvis danner heterodimers over enten homodimer når co-udtrykt.

Figur 1. Injektion og aspirationsnåle. Fotografier af repræsentative nåle, der er trukket, men ikke klippet (A), trukket og klippet til brug som en injektionsnål (B) eller trukket og klippet til brug som en aspirationsnål (C) vises. Pilen og pilespidsen i (A) angiver det punkt, hvor glasset blev klippet for at generere en nål til henholdsvis injektion og aspiration. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Analyse af kløvede Bmp ligands udvundet af X. laevis blastocele væske. (A) Kavalergangsprodukter fremstillet af Bmp4 og Bmp7 homodimeriske eller heterodimeriske prækursorproteiner og placeringen af myc epitop tag (sølvstang) vises skematisk (B) Skematisk diagram, der viser tidspunktet for injektion og blastocoelevæskeudvinding. (C-D) Xenopus embryoner blev injiceret med 200 pg Bmp7 eller Bmp4 RNA, eller med Bmp4 og Bmp7 RNA blandet sammen (100 pg hver). På gastrulastadiet blev væske udvundet fra blastocoele af det samme antal embryoner i hver eksperimentel gruppe. Proteiner, der findes i blastocoelevæsken, blev deglycosyleret og adskilt af SDS-PAGE. Antistoffer, der genkender myc-epitop-mærket, blev brugt til at sondere immunblod. Den relative position af immunoreaktive ligand monomerer og dimers vises skematisk til højre for hver gel. Sort linje i (C) angiver fjernelse af en mellemliggende vognbane på skampletten. De viste data er uddraget fra en tidligere offentliggjort undersøgelse¹⁰. Klik her for at se en større version af dette tal.

Opløsning	Sammensætning
0,2% Tricain	20 g tricain opløst i deioniseret vand, juster pH til 7,4 ved tilsætning af natriumbicarbonat
10x MBS	880 mM NaCl, 10 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 100 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgSO4, 0,14 mM Ca(NO3)2, 0,41 mM CaCl2; Juster til pH 7.5 med NaOH. 10x MBS-lageret kan opbevares ved 4 °C og fortyndes efter behov.
2% cysteinopløsning	2 g cystein pr. 100 ml deioniseret vand, juster pH til 7,8-8,0 med natriumhydroxid.  Gør frisk hver dag.
20x DeBoer's dam vand	100 mM NaCl, 1,3 mM KCl, 0,44 mM CaCl2; Juster til pH 7.4 med NaHCO3. 20x lager af DeBoers damvand kan opbevares ved 4 °C og fortyndes efter behov.
4x ikke-reducerende eksempelbuffer	200 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% bromophenol blå, 40% glycerol.
4x reduktion af eksempelbuffer	200 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,4% bromophenol blå, 40% glycerol, 14,4 M ß-mercaptoethanol
5% Ficoll-løsning	25 g Ficoll i 500 ml 0,1 x MBS, juster pH til 7,5 med natriumhydroxid.  Opbevares ved 4 °C.
Embryo lysat buffer	50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 2,5 % NP-40.  Opbevares ved 4 °C.
Human chorionic gonadotropin	Brug en 3 mL sprøjte fastgjort til en 19 G nål, injicere 2,5 mL sterilt vand gennem gummiproppen af et hætteglas af human chorionic gonadotropin (10.000 IE ). Opbevares ved 4 °C .
Testis buffer	10% fosterkvægsserum, 1% pen/strep (100U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin i 1x MBS

Tabel 1.

Discussion

De vigtigste fordele ved den protokol, der er beskrevet her, er, at den kan afsluttes relativt hurtigt, ikke kræver dyre reagenser og giver en kilde til koncentrerede Tgfß kavalergangsprodukter under fysiologiske forhold. En anden fordel er, at det giver en mulighed for at analysere epitop-taggede proteiner og dermed omgå manglen på kommercielt tilgængelige antistoffer, der genkender de fleste Tgfß familieprodomain. Selvom det også er muligt at analysere kavalergangen af epitopmærkede Tgfß-prækursorproteiner i transfected dyrkede pattedyrceller, er der flere fordele ved at bruge X. laevis. Tidlige X. laevis embryoner udtrykke alle fire medlemmer af pc-familien, der er kandidater til endogene Tgfß convertases (Furin, Pcsk5, Pcsk6 og Pcsk7)^13,14,16. Nogle pattedyrscellelinjer udtrykker ikke en eller flere pc'er, hvilket kræver det ektopiske udtryk for både prækursorproteinet og dets konvertase for at undersøge kavalergang¹⁷. En vigtigere overvejelse er, at meget høje niveauer af prækursorproteiner genereret af forbigående transfekt af transformerede celler kan føre til artefakter, såsom udskillelsen af fejlfoldede kavalergangsprodukter, som kan forekomme, hvis prækursorniveauer overstiger kapaciteten til kvalitetskontrol i ER¹⁸. Dette kan maskere effekten af skadelige mutationer på prækursor dimerization og kavalergang, da de fejlfoldede kavalergangsprodukter vises i medierne, og forkertfoldning ville ikke blive opdaget, medmindre aktiviteten analyseres. I modsætning hertil opdager forsøg, der anvender X. laevis embryoner, let defekter ved foldning, hvilket fører til enten tab af forløber på grund af det fejlfoldede proteinrespons på skadestuen eller afvigende migration af kavalergangsprodukter under ikke-reducerende forhold^10,18.

Under blastocoele aspirationsproceduren er det vigtigt at forsøge at udtrække en omtrent tilsvarende mængde blastocoelevæske fra hvert embryo, især hvis målet for eksempel var at sammenligne kavalergangsprodukter genereret fra vilde typer og mutantprækursorer. Dette er en uakt videnskab, men at aspirere i omtrent lige meget tid fra hvert embryo hjælper med at normalisere lydstyrken. Derudover hjælper aspirerende væske fra et større antal embryoner i hver gruppe med at normalisere eventuelle forskelle i volumen mellem individuelle embryoner.

In vitro-kavalergangsreaktioner er en alternativ procedure, der kan anvendes til at afgøre, om et bestemt pc-motiv, der er til stede i et Tgfß-prækursorprotein, er spaltet, og til at identificere og/eller udelukke potentielle pc'er som endogene cabrioer for et givet substrat. Eksisterende protokoller beskriver en simpel analyse, hvor radiomærkede prækursorproteiner genereres in vitro, ved hjælp af kanin reticulocytter, for eksempel, eller in vivo, ved hjælp af X. laevis oocytter. Substrater inkuberes derefter in vitro med kandidat rekombinant pc'er og kavalergangsprodukter analyseret ved elektroforese og autoradiografi¹⁹. Mens denne protokol giver en hurtig og nem måde at afgøre, om et protein er et pc-substrat og for at identificere, hvilke potentielle kavalergangssteder der anvendes in vivo, er det usandsynligt, at prækursorproteinerne er tilstrækkeligt foldede eller dimerized, og derfor kan spalteoplysninger fra disse eksperimenter ikke afspejle in vivo-situationen.

En mangel ved den protokol, vi beskriver her, er, at det er umuligt at visualisere korrekt foldet, dimerized forløberprotein i X. laevis embryoner. Det samme gælder i andre ektopiske ekspressionssystemer, såsom forbigående transfected pattedyrceller, da urent monomerisk prækursorprotein akkumuleres inden for SKADESTU'en på meget højere niveauer end post-ER dimerized og foldede prækursorer. Den dimerized forløber er hurtigt spaltet og udskilles, når det forlader skadestuen. Hvis det er vigtigt at analysere dimerisering og foldning af prækursorproteiner, er en nyttig alternativ procedure at undersøge handel og kavalergang af radiomærkede prækursorer i X. laevis oocytter²⁰. Autoradiografiens høje følsomhed kombineret med det faktum, at proteiner bevæger sig langsommere gennem sekretorsystemet i oocytter, end de gør i dyrkede pattedyrceller eller embryoner, gør det muligt at opdage dimeriserede prækursorproteiner i oocytter og teste, om proteinerne er korrekt foldet og har forladt skadestuen ved at undersøge deres glycosylationsstatus^{18, 21}.

Sammenfattende giver denne protokol en hurtig og ligetil metode til at analysere kavalergangsprodukter genereret af modningen af Tgfß-familiens prækursorproteiner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ß-mercaptoethanol	Fisher	AC125470100
Bromophenol Blue	Fisher	B392-5
Calcium Chloride	Fisher	C79-500
Calcium Nitrate	Fisher	C109-500
Disposable Pellet Pestle/Tissue Grinder	Fisher	12-141-364
Dumont #5 forceps	Fine Science tools	11251-10
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150H
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F9378-500G
Glass capillary, 1 X 90 mm	Narshige	G-1
Glycerol	Fisher	G33-4
HEPES	Fisher	BP310-500
Human chorionic gonadotropin	Sigma Aldrich	CG10-10VL
Injection Syringe, 1 mL	Fisher	8881501368
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
Magnesium Sulfate	Fisher	M63-500
Needle, 26 G	Fisher	305111
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140148
Picoliter Microinjector	Warner Instruments	PLI-100A
Pipette Puller	Narashige	PC-100
Potassium Chloride	Fisher	P217-500
PVDF Membrane	Sigma Aldrich	IPVH00010
Sodium Bicarbonate	Fisher	S233-500
Sodium Chloride	Fisher	S271-10
Sodium Dodecyl Sulfate	Fisher	BP166-500
Sodium Hydroxide	Fisher	S318-500
Tricaine-S	Pentair	TRS5
Tris	Fisher	BP152-5