Summary
Qui viene presentato un flusso di lavoro sperimentale che consente il rilevamento dell'elaborazione della caspasi-8 direttamente nel complesso di segnalazione che induce la morte (DISC) e determina la composizione di questo complesso. Questa metodologia ha ampie applicazioni, dallo svelamento dei meccanismi molecolari delle vie di morte cellulare alla modellazione dinamica delle reti di apoptosi.
Abstract
L'apoptosi estrinseca è mediata dall'attivazione dei recettori di morte (DR) come CD95/Fas/APO-1 o il recettore 1/recettore 2 del ligando che induce l'apoptosi correlata al fattore di necrosi tumorale (TRAIL)-recettore 2 (TRAIL-R1/R2). La stimolazione di questi recettori con i loro ligandi affini porta all'assemblaggio del complesso di segnalazione che induce la morte (DISC). DISC comprende DR, la proteina adattatrice Fas-associated protein with death domain (FADD), procaspasi-8/-10 e proteine enzima-inibitorie cellulari FADD-like (IL)-1β-converting enzyme-inibitory proteins (c-FLIP). Il DISC funge da piattaforma per l'elaborazione e l'attivazione della procaspasi-8. Quest'ultimo avviene attraverso la sua dimerizzazione / oligomerizzazione nei filamenti del dominio effettrice della morte (DED) assemblati al DISC.
L'attivazione della procaspasi-8 è seguita dalla sua elaborazione, che avviene in più passaggi. In questo lavoro, viene descritto un flusso di lavoro sperimentale stabilito che consente la misurazione della formazione di DISC e l'elaborazione della procaspasi-8 in questo complesso. Il flusso di lavoro si basa su tecniche di immunoprecipitazione supportate dall'analisi western blot. Questo flusso di lavoro consente un attento monitoraggio delle diverse fasi del reclutamento della procaspasi-8 al DISC e alla sua elaborazione ed è molto rilevante per lo studio dei meccanismi molecolari dell'apoptosi estrinseca.
Introduction
Uno dei recettori di morte (DR) meglio studiati è CD95 (Fas, APO-1). La via apoptotica estrinseca inizia con l'interazione del DR con il suo ligando affine, cioè CD95L interagisce con CD95 o TRAIL si lega a TRAIL-R. Ciò si traduce nella formazione del DISCO al corrispondente DR. DISC costituito da CD95, FADD, procaspasi-8/-10 e proteine c-FLIP1,2. Inoltre, il DISC è assemblato per interazioni tra proteine contenenti dominio di morte (DD), come CD95 e FADD, e proteine contenenti DED come FADD, procaspasi-8/-10 e c-FLIP (Figura 1). La procaspasi-8 subisce l'oligomerizzazione tramite associazione dei suoi DED, con conseguente formazione di filamenti DED, seguita dall'attivazione e dall'elaborazione della procaspasi-8. Questo innesca una cascata di caspasi, che porta alla morte cellulare (Figura 1)3,4. Pertanto, la procaspasi-8 è una caspasi iniziatrice centrale della via estrinseca dell'apoptosi estrinseca mediata da CD95 o TRAIL-R, attivata alla corrispondente piattaforma macromolecolare, DISC.
Due isoforme di procaspasi-8, vale a dire procaspasi-8a (p55) e -8b (p53), sono note per essere reclutate nel DISC5. Entrambe le isoforme comprendono due DED. DED1 e DED2 si trovano nella parte N-terminale della procaspasi-8a/b seguita dai domini catalitici p18 e p10. L'analisi dettagliata al microscopio crioelettronico (cryo-EM) dei DED della procaspasi-8 ha rivelato l'assemblaggio delle proteine della procaspasi-8 in strutture filamentose chiamate filamenti DED4,6. Sorprendentemente, le catene lineari di procaspasi-8 sono state inizialmente suggerite per essere impegnate nella dimerizzazione seguita dall'attivazione della procaspasi-8 al DISC. Ora, è noto che quelle catene sono solo una sottostruttura del filamento DED procaspasi-8, quest'ultimo composto da tre catene assemblate in una tripla elica3,4,6,7.
Dopo la dimerizzazione al filamento DED, i cambiamenti conformazionali nella procaspasi-8a / b portano alla formazione del centro attivo della procaspasi-8 e alla sua attivazione3,8. Segue la lavorazione della procaspasi-8, che è mediata da due percorsi: il primo passa attraverso la generazione di un prodotto di scissione p43/p41 e il secondo attraverso la generazione iniziale di un prodotto di scissione p30. La via p43/p41 è iniziata dalla scissione della procaspasi-8a/b ad Asp374, con conseguente scissione di p43/p41 e p12 (Figura 2). Inoltre, questi frammenti sono autocatalizzati in asp384 e Asp210/216, dando origine alla formazione dell'eterotetramero attivo caspasi-8, p102/p1829,10,11. Inoltre, è stato dimostrato che in parallelo alla via di lavorazione p43/p41, la procaspasi-8a/b viene scissa anche ad Asp216, il che porta alla formazione del prodotto di scissione C-terminale p30, seguito dalla sua proteolisi a p10 e p1810 (Figura 2).
L'attivazione della procaspasi-8a/b al filamento DED è strettamente regolata da proteine denominate c-FLIP12. Le proteine c-FLIP si trovano in tre isoforme: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS)e c-FLIPRaji (c-FLIPR). Tutte e tre le isoforme contengono dueD nella loro regione N-terminale. c-FLIPL ha anche un dominio C-terminale cataliticamente inattivo simile alla caspasi12,13. Entrambe le isoforme corte di c-FLIP-c-FLIPS e c-FLIPR-agiscono in modo anti-apoptotico interrompendo la formazione di filamenti DED al DISCO6,14,15. Inoltre, c-FLIPL può regolare l'attivazione della caspasi-8 in modo dipendente dalla concentrazione. Ciò può comportare effetti sia pro- che anti-apoptotici16,17,18. Formando l'eterodimero cataliticamente attivo procaspasi-8/c-FLIPL, c-FLIPL porta alla stabilizzazione del centro attivo della procaspasi-8 e alla sua attivazione. La funzione pro- o anti-apoptotica di c-FLIPL dipende direttamente dalla sua quantità ai filamenti DED e dalla successiva quantità di eterodimeri assemblati di procaspasi-8/c-FLIPL 19. Concentrazioni basse o intermedie di c-FLIPL al DISC provocano quantità sufficienti di eterodimeri procaspasi-8/c-FLIPL al filamento DED, che supporta l'attivazione della caspasi-8. Al contrario, l'aumento delle quantità di c-FLIPL porta direttamente ai suoi effetti anti-apoptotici al DISC20.
Nel complesso, l'attivazione e l'elaborazione della procaspasi-8a/b al DISC è un processo altamente regolamentato che coinvolge diverse fasi. Questo documento discute la misurazione dell'elaborazione della procaspasi-8 direttamente sul DISC e l'analisi della composizione di questo complesso. Questo sarà presentato utilizzando CD95 DISC come complesso DR esemplare.
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Protocol
Gli esperimenti sulle cellule T sono stati eseguiti secondo l'accordo etico 42502-2-1273 Uni MD.
1. Preparare le cellule per l'esperimento
NOTA: Il numero medio di cellule per questa immunoprecipitazione è 1 × 107. Le cellule aderenti devono essere seminate un giorno prima dell'esperimento in modo che ci siano 1 × 107 cellule il giorno dell'esperimento.
- Preparazione delle cellule aderenti per l'esperimento
- Seme 5-8 × 106 cellule aderenti in 20 ml di mezzo (vedi la tabella dei materiali per la composizione) per ogni condizione in piatti da 14,5 cm un giorno prima dell'inizio dell'esperimento.
- Il giorno dell'esperimento, assicurarsi che le cellule siano confluenti all'80-90% e aderenti al piatto. Scartare il mezzo e aggiungere mezzo fresco alle cellule aderenti.
- Preparazione delle celle di sospensione per l'esperimento
- Posizionare con attenzione 1 × 107 celle di sospensione in 10 ml di terreno di coltura (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) per condizione in piatti da 14,5 cm immediatamente prima dell'inizio dell'esperimento.
- Se si utilizzano cellule primarie, isolare le cellule T primarie secondo la procedura precedentemente descritta21. Trattare le cellule T primarie con 1 μg/mL di fitoemoagglutinina per 24 ore, seguite da 25 U/mL di trattamento IL2 per 6 giorni.
- Posizionare con attenzione 1 × 108 cellule T primarie in 10 ml di terreno di coltura (vedere la tabella dei materiali per la composizione) per condizione in piatti da 14,5 cm immediatamente prima dell'inizio dell'esperimento.
NOTA: si raccomanda questo numero maggiore di cellule T primarie, poiché queste cellule sono più piccole.
2. Stimolazione CD95L
- Stimolare le cellule con CD95L (prodotto come descritto in precedenza20 o disponibile in commercio (vedi la Tabella dei materiali)).
NOTA: La concentrazione del CD95L e il tempo di stimolazione dipendono dal tipo cellulare13,15,22,23,24,25. Preparare una condizione di stimolazione due volte per generare un campione di "controllo delle perline" in parallelo.- Stimolare le cellule aderenti con la concentrazione selezionata di CD95L. Tenere la piastra ad angolo e pipettare il ligando nel mezzo senza toccare le cellule aderenti.
- Stimolare le cellule in sospensione con CD95L pipettando la soluzione di ligando nella sospensione cellulare.
3. Raccolta cellulare e lisi
- Mettere le piastre cellulari sul ghiaccio.
NOTA: non scartare il supporto. Le cellule morenti galleggiano nel mezzo e sono importanti per l'analisi. - Aggiungere 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato freddo (PBS) alla sospensione cellulare e raschiare le cellule attaccate dalla piastra. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml.
- Lavare la capsula cellulare con 10 mL di PBS freddo due volte e posizionare la soluzione di lavaggio nello stesso tubo da 50 ml. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C.
- Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 1 mL di PBS freddo. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 ml.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 1 mL di PBS freddo.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 1 mL di tampone di lisi (contenente il 4% di cocktail inibitore della proteasi). Incubarlo per 30 minuti sul ghiaccio.
- Centrifugare il lisato alla massima velocità (~17.000 × g)per 15 min, 4 °C.
- Trasferire il surnatante (lisato) in un tubo pulito. Scartare il pellet. Prendere 50 μL del lisato in un altro tubo. Analizzare la concentrazione proteica mediante il test bradford e prelevare la quantità di lisato corrispondente a 25 μg di proteine in una fiala. Aggiungere il buffer di carico (vedere la tabella dei materiali per la composizione) al flaconcino. Conservare a -20 °C come controllo lisato.
4. Immunoprecipitazione (IP)
- Aggiungere 2 μL di anticorpi anti-APO-1 e 10 μL di perline di sefarosio della proteina A (preparate come raccomandato dal produttore) al lisato. Aggiungere solo 10 μL di perline a un tubo separato contenente lisato (campione stimolato) per generare un "controllo delle perline".
NOTA: utilizzare punte di pipetta con orifizi larghi tagliando le punte o acquistando punte speciali per IP durante la manipolazione delle perle di sefarosio della proteina A. - Incubare la miscela di lisato con anticorpi/perline di sefarosio della proteina A con una miscelazione delicata durante la notte a 4 °C. Centrifugare i lisati con anticorpi/proteine A perline di sefarosio a 500 × g per 4 min, 4 °C. Scartare il surnatante, aggiungere 1 ml di PBS freddo alle perline e ripetere questo passaggio almeno tre volte.
- Scartare il surnatante. Aspirare le perline preferibilmente con una siringa Hamilton da 50 μL.
5. Macchia occidentale
- Aggiungere 20 μL di tampone di carico 4x (vedere la tabella dei materiali per la composizione) alle perline e riscaldare a 95 °C per 10 min. Riscaldare i controlli lisati a 95 °C per 5 min.
- Caricare i lisati, gli IP e uno standard proteico su un gel di dodecil solfato di sodio (SDS) al 12,5% (vedere la tabella dei materiali per la preparazione del gel) ed eseguire con una tensione costante di 80 V.
- Trasferire le proteine dal gel SDS a una membrana di nitrocellulosa.
NOTA: Qui, la tecnica semi-secca, ottimizzata per le proteine di interesse, è stata utilizzata per il trasferimento oltre 12 min (25 V; 2,5 A = costante). Immergere la membrana di nitrocellulosa e due pile di trasferimento mini-size nel tampone di elettroforesi (vedere la tabella dei materiali per la composizione, preparare secondo le istruzioni del produttore) per alcuni minuti prima del western blotting. - Posizionare la membrana cancellata in una scatola e bloccarla per 1 ora in soluzione bloccante (0,1% Tween-20 in PBS (PBST) + 5% latte). Incubare la membrana con la soluzione bloccante sotto agitazione delicata.
- Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.
6. Rilevamento western blot
- Aggiungere il primo anticorpo primario alla diluizione indicata (vedere la Tabella dei materiali)alla membrana e incubarlo durante la notte a 4 °C con una delicata agitazione.
- Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.
- Incubare la membrana con 20 ml di anticorpo secondario (diluito 1:10.000 in PBST + 5% latte) con un delicato scuotimento per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.
- Eliminare pbST e aggiungere circa 1 mL di substrato di perossidasi di rafano alla membrana.
- Rilevare il segnale chemioluminescente (vedi la Tabella dei Materiali).
NOTA: Il tempo di esposizione e il numero di immagini catturate dipendono dalla quantità di proteine nella cellula e dalla specificità degli anticorpi utilizzati. Deve essere stabilito empiricamente per ciascun anticorpo utilizzato per la rilevazione.
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Representative Results
Per analizzare il reclutamento della caspasi-8 nel DISC e la sua elaborazione nel CD95 DISC, questo documento descrive un flusso di lavoro classico, che combina l'IP del CD95 DISC con l'analisi western blot. Ciò consente il rilevamento di diverse caratteristiche chiave dell'attivazione della caspasi-8 al DISC: l'assemblaggio della piattaforma macromolecolare attivante la caspasi-8, il reclutamento della procaspasi-8 al DISC e l'elaborazione di questa caspasi iniziatore (Figura 1 e Figura 2). Questo flusso di lavoro prevede il trattamento di cellule sensibili con CD95L in modo dipendente dal tempo, seguito dalla loro lisi, immunoprecipitazione utilizzando anticorpi anti-CD95 (anti-APO-1) e successiva analisi western blot (Figura 3).
Le cellule HeLa-CD95 del cancro cervicale sono state utilizzate come esempio per analizzare la formazione del DISCO26. La stimolazione di queste cellule con CD95L ha determinato un alto livello di formazione di CD95 DISC, monitorato tramite immunoprecipitazione CD95 (Figura 4). CD95, FADD, procaspasi-8, procaspasi-10 e c-FLIP sono stati osservati in queste immunoprecipitazioni CD95, indicando un'efficiente formazione di DISC. È importante sottolineare che i prodotti di scissione della procaspasi-8a / b: p43 / p41, p30 e p18 sono stati rilevati al DISC, il che indica l'attivazione della procaspasi-8 e la sua successiva elaborazione. In particolare, sono stati rilevati i prodotti di scissione della procaspasi-8 p43/p41 e p18, indicando le due fasi sopra menzionate del percorso di lavorazione p43. Inoltre, è stato rilevato il prodotto p30, indicando il percorso alternativo di lavorazione della caspasi-8. Inoltre, l'attivazione della procaspasi-8 al DISC è seguita dalla scissione dei suoi substrati come le proteine c-FLIP.
Infatti, i prodotti di scissione di c-FLIP-p43-FLIP e p22-FLIP-sono stati rilevati nelle immunoprecipitazioni, indicando l'attivazione della caspasi-8 (Figura 4). È importante sottolineare che né FADD, procaspasi-8, procaspasi-10 e c-FLIP, né i loro prodotti di scissione sono stati rilevati nei campioni di immunoprecipitazione da cellule non trattate, il che sottolinea la specificità dell'immunoprecipitazione DISC (Figura 4). Informazioni importanti possono essere ottenute da questi esperimenti quantificando le bande corrispondenti ai diversi prodotti di scissione della procaspasi-8 (Figura 4). Queste informazioni possono essere utilizzate nella modellazione matematica delle reti di apoptosi e forniscono approfondimenti quantitativi sulla regolazione del percorso.
Il livello di attivazione della caspasi-8 al DISC è modulato da c-FLIP. Quindi, le celle HeLa-CD95 che sovraesprimono c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15 sono state selezionate come secondo esempio (Figura 5). Gli effetti dell'isoforma c-FLIPL in questi esperimenti potrebbero essere osservati, con conseguente diverso tasso di elaborazione della procaspasi-8a/b rispetto a p43/p41 al DISC rispetto alla corrispondente proteolisi della procaspasi-8 al DISC nelle cellule HeLa-CD95 parentali, come descritto da Hillert et al. 15. Simile alle osservazioni nella Figura 4,nessun reclutamento di FADD, procaspasi-8, procaspasi-10, proteine c-FLIP e dei loro prodotti di scissione è stato rilevato nelle immunoprecipitazioni da cellule HeLa-CD95-FL senza trattamento con CD95L, che supporta la specificità di queste immunoprecipitazioni. Ulteriori prove della specificità delle immunoprecipitazioni sono l'assenza del reclutamento di procaspasi-3 e poli(ADP-ribosio)polimerasi 1 (PARP1) nel DISCO, che è stato osservato nelle immunoprecipitazioni trattate con CD95L (Figura 5). Queste proteine non fanno parte del complesso e la loro assenza nei segnali di immunoprecipitazione può servire come prova per l'assenza di legame non specifico di abbondanti proteine cellulari.
Infine, le immunoprecipitazioni di CD95 DISC da cellule in sospensione sono state eseguite come terzo esempio, ad esempio cellule T primarie attivate (Figura 6). Queste cellule sono anche caratterizzate da alti livelli di CD95, FADD, procaspasi-8, procaspasi-10 e c-FLIP che sono stati osservati nelle immunoprecipitazioni anti-CD95 insieme ai loro prodotti di scissione (Figura 6). Il rilevamento di prodotti di scissione della procaspasi-8 nelle immunoprecipitazioni indica l'attivazione e l'elaborazione di questa caspasi iniziatrice nell'immunoprecipitazione DISC da cellule T primarie. Questi esperimenti indicano che il DISC può essere immunoprecipitato da molte cellule aderenti e in sospensione e che l'elaborazione e l'attivazione della caspasi-8 possono essere convalidate dall'analisi western blot.
Figura 1: Presentazione schematica della via di segnalazione CD95. CD95L attiva l'assieme DISC. Il DISCO comprende CD95, FADD, procaspasi-8/-10 e c-FLIP. FADD si lega a CD95 tramite il suo DD, mentre la procaspasi-8, la procaspasi-10 e i c-FLIP interagiscono tramite i loro DED, formando filamenti DED. La formazione dei filamenti DED funge da piattaforma per la dimerizzazione, l'elaborazione e la successiva attivazione della procaspasi-8. L'eterotetramero attivo caspasi-8, p182/p102, attiva la caspasi-3 per scissione, che porta all'apoptosi. Abbreviazioni: CD = cluster di differenziazione; CD95L = ligando CD95; DISC = complesso di segnalazione che induce la morte; DD = dominio della morte; FADD= dominio di morte associato a Fas; c-FLIP = interleuchina cellulare FADD-simile (IL)-1β-converting enzima-proteina inibitoria; DED = dominio dell'effettore di morte; c-FLIPL = c-FLIPLungo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Elaborazione della procaspasi-8 al DISC. Vengono mostrati due modi di elaborazione della procaspasi-8a / b al DISC. Il primo modo prevede la generazione p43/p41 seguita dalla formazione p18. Il secondo modo prevede la generazione p30 seguita dalla sua elaborazione a p18 e p10. I residui sono numerati secondo la sequenza di procaspasi-8a. Abbreviazioni: DED = dominio dell'effettore di morte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Presentazione schematica del setup sperimentale del DISC-IP. Le cellule sono stimolate con CD95L. Dopo la stimolazione, le cellule vengono raccolte e raccolte, seguite da diverse fasi di lavaggio. Le cellule vengono quindi lisate e i lisati vengono raccolti. Successivamente, le perle di proteina A-sefarosio e gli anticorpi anti-APO-1 (anti-CD95) sono stati aggiunti al lisato e incubati durante la notte. Dopo diverse fasi di lavaggio, le immunoprecipitazioni sono state analizzate mediante western blotting. Abbreviazioni: DISC = complesso di segnalazione che induce la morte; IP = immunoprecipitazione; CD95L = ligando CD95. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Formazione di CD95 DISC in cellule HeLa-CD95. Le cellule HeLa-CD95 sono state stimolate con 125 ng/mL CD95L per 30 minuti o 1 ora. CD95 DISC-IP sono stati effettuati utilizzando anticorpi anti-APO-1 (anti-CD95). La composizione degli IP è stata esaminata mediante analisi western blot utilizzando gli anticorpi per le proteine indicate. L'actina è stata utilizzata come controllo del carico. Vengono visualizzati gli input. La quantificazione dei prodotti di scissione della procaspasi-8 al DISC viene mostrata e normalizzata al segnale CD95. Abbreviazioni: l.e. = lunga esposizione; s.e. = esposizione breve; BC = IP di controllo con 'solo perline', senza l'aggiunta di anticorpi; CD95L = ligando CD95; DISC = complesso di segnalazione che induce la morte; IP = immunoprecipitazione; FADD = dominio di morte associato a Fas; c-FLIP = interleuchina cellulare FADD-simile (IL)-1β-converting enzima-proteina inibitoria; c-FLIPL = c-FLIPLungo; c-FLIPS = c-FLIPCorto; M = peso molecolare in kiloDalton (kDa). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Formazione di CD95 DISC in cellule c-FLIPL-sovraesprimendo HeLa-CD95. Le cellule HeLa-CD95-FL sono state stimolate con 250 ng/mL CD95L per i punti temporali indicati (1-3 h). CD95 DISC-IP sono stati effettuati utilizzando anticorpi anti-APO-1 (anti-CD95). La composizione degli IP è stata esaminata mediante analisi western blot e analizzata per le proteine indicate. L'actina è stata utilizzata come controllo del carico. Vengono visualizzati gli input. La quantificazione dei prodotti di scissione della procaspasi-8 al DISC viene mostrata e normalizzata al segnale CD95. Viene mostrato un esperimento rappresentativo su due. Abbreviazioni: l.e. = lunga esposizione; s.e. = esposizione breve; BC = IP di controllo con 'solo perline', senza l'aggiunta di anticorpi; CD95L = ligando CD95; DISC = complesso di segnalazione che induce la morte; IP = immunoprecipitazione; FADD = dominio di morte associato a Fas; c-FLIP = interleuchina cellulare FADD-simile (IL)-1β-converting enzima-proteina inibitoria; c-FLIPL = c-FLIPLungo; PARP1 = poli(ADP-ribosio)polimerasi 1; M = peso molecolare in kiloDalton (kDa). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Formazione di CD95 DISC in cellule T primarie. Le cellule T attivate primarie sono state stimolate con 500 ng/mL CD95L per 15 minuti e 30 minuti. CD95 DISC-IP sono stati effettuati utilizzando anticorpi anti-APO-1 (anti-CD95). La composizione degli IP è stata esaminata mediante analisi western blot e analizzata per le proteine indicate. L'actina è stata utilizzata come controllo del carico. La quantificazione dei prodotti di scissione della procaspasi-8 al DISC viene mostrata e normalizzata al segnale CD95. Vengono visualizzati gli input. Abbreviazioni: l.e. = lunga esposizione; s.e. = esposizione breve; ; CD95L = ligando CD95; DISC = complesso di segnalazione che induce la morte; IP = immunoprecipitazione; FADD = dominio di morte associato a Fas; c-FLIP = interleuchina cellulare FADD-simile (IL)-1β-converting enzima-proteina inibitoria; c-FLIPL = c-FLIPLungo; M = peso molecolare in kiloDalton (kDa). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo approccio è stato descritto per la prima volta da Kischkel et al.27 e da allora è stato sviluppato con successo da diversi gruppi. Diverse questioni importanti devono essere considerate per un'efficiente elaborazione disc-immunoprecipitazione e monitoraggio della caspasi-8 in questo complesso.
In primo luogo, è essenziale seguire tutte le fasi di lavaggio durante l'immunoprecipitazione. Particolarmente importanti sono le fasi finali di lavaggio delle perle di sefarosio e l'asciugatura delle perle di sefarosio. Questo deve essere fatto correttamente per aumentare il rapporto segnale/rumore dell'immunoprecipitazione, consentendo il rilevamento del reclutamento e dell'elaborazione della caspasi-8 presso il DISC. È importante sottolineare che, per tecniche analitiche molto sensibili, come la spettrometria di massa, una "fase di preclearizzazione", che include l'incubazione dei lisati con solo le perle di sefarosio o gli anticorpi di controllo dell'isotipo, può anche essere importante per ridurre il rumore. Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato che questa fase di preclearing non è essenziale per il rilevamento del reclutamento di caspasi-8 al DISC da parte del western blotting7,23. Tuttavia, come accennato, il lavaggio delle perline al termine dell'immunoprecipitazione è fondamentale per ottenere risultati affidabili. Il legame non specifico di abbondanti proteine cellulari alle perle di sefarosio può essenzialmente ridurre i segnali specifici dei componenti DISC principali. Come importante controllo per l'assenza del legame non specifico, potrebbe essere eseguita l'analisi western blot delle proteine, segnalate come non presenti al DISC. Un esempio di questa analisi è dato nella Figura 5, in cui non è stato osservato il reclutamento di PARP1 e caspasi-3 nell'immunoprecipitazione DISC. Ciò indica la specificità della particolare immunoprecipitazione e un lavaggio sufficiente delle perle di sefarosio durante l'esperimento.
In secondo luogo, è fondamentale eseguire controlli negativi come un controllo solo perline o un controllo immunoprecipitazione con un anticorpo con lo stesso isotipo dell'anticorpo utilizzato per l'immunoprecipitazione. Per gli anticorpi anti-APO-1, gli anticorpi anti-topo IgG3 possono essere utilizzati come controllo isotipico. In terzo luogo, è importante monitorare i risultati dell'immunoprecipitazione da campioni non trattati, in cui deve essere osservato solo CD95. Il rilevamento di FADD, c-FLIP o procaspasi-8 in questi campioni indica tipicamente la presenza di alcune carenze nel protocollo di immunoprecipitazione o nelle fasi di lavaggio. Ciò potrebbe dar luogo a ipotesi sull'associazione indipendente dalla stimolazione di FADD o c-FLIP con CD95, che potrebbero non essere del tutto corrette, e indicare invece difetti nell'immunoprecipitazione. In quarto luogo, per ogni immunoprecipitazione, gli input o lisati devono essere attentamente analizzati in parallelo per misurare l'espressione e le modificazioni post-traduzionali delle proteine core analizzate mediante immunoprecipitazione.
In quinto luogo, l'analisi time-dependent consente di seguire nel tempo i cambiamenti del complesso e fornisce un'altra importante conferma sulla specificità delle proteine reclutate nel complesso. A questo proposito, una questione importante è che ogni linea cellulare ha un diverso livello di espressione di CD95 e di componenti intracellulari di questo complesso. Di conseguenza, i tempi esatti della formazione del CD95 DISC devono essere attentamente stabiliti per ogni particolare tipo di cellula. Infine, la questione cruciale per l'analisi della dinamica DISC è il confronto della quantità di proteine in ciascuna immunoprecipitazione. Per le immunoprecipitazioni CD95 DISC eseguite utilizzando anticorpi anti-APO-1, la quantità di CD95 è una misura chiave della quantità uguale dei complessi confrontati. Questo potrebbe essere difficile perché l'intensità del segnale CD95 nelle immunoprecipitazioni è relativamente alta. Tuttavia, è necessario trovare l'intervallo di tempo ottimale per misurare il corrispondente segnale western blot. Un altro ostacolo è che CD95 è una proteina altamente glicosilata, che contribuisce anche alle difficoltà nella sua rilevazione in immunoprecipitazione a causa della presenza di un particolare pattern di diverse bande 'sfocate'28.
L'analisi disc-immunoprecipitazione fornisce una base ottimale per rilevare l'attivazione e l'elaborazione delle caspasi. In effetti, l'immunoprecipitazione combinata con il western blotting consente il rilevamento quantitativo dei prodotti di scissione della procaspasi-8a / b: p43 / p41, p30 e p18, come mostrato in questo studio (Figura 4, Figura 5e Figura 6). Questo, a sua volta, consente agli sperimentatori di seguire i cambiamenti nell'elaborazione della procaspasi-8a / b nel tempo e distinguere le diverse fasi di scissione della procaspasi-8. Questo approccio è stato utilizzato con successo per descrivere l'attivazione della caspasi-8 in modelli matematici e distinguere tra elaborazione della procaspasi-8 inter- e intramolecolare al DISC7,20,29. Inoltre, la misurazione dei prodotti di scissione della caspasi-8 mediante western blotting presenta chiari vantaggi rispetto ai saggi di attività della caspasi-8 convenzionali basati sul substrato IETD. In quest'ultimo caso, è ben noto che L'IETD funge anche da substrato per le altre caspasi. Quindi, vi è una crescente evidenza che il rilevamento dell'attività IETD indica un aumento generale dell'attività della caspasi nella cellula. Al contrario, l'uso dell'analisi western blot può aiutare ad assegnare specificamente le bande corrispondenti nella macchia occidentale alla caspasi-8, consentendo al ricercatore di essere sicuro che la caspasi-8 sia attivata in questo complesso. Inoltre, come accennato in precedenza, la misurazione dell'elaborazione della caspasi-8 presso il DISC presenta un eccellente strumento per la modellazione matematica e gli studi di biologia dei sistemi. Nel loro insieme, viene presentato un flusso di lavoro classico per consentire il monitoraggio di diverse fasi di attivazione ed elaborazione della procaspasi-8, essenziale per svelare i meccanismi molecolari della morte cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo la Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), il Center of Dynamic Systems (CDS), finanziato dal programma UE FESR (Fondo europeo di sviluppo regionale) e dal DFG (LA 2386) per sostenere il nostro lavoro. Ringraziamo Karina Guttek per aver supportato i nostri esperimenti. Riconosciamo il Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburgo) per averci fornito cellule T primarie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
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