Summary
Protokollen presenterer en kreftimmunterapimodell ved bruk av cellebasert tumorvaksinasjon med Flt3L-uttrykkende B16-F10 melanom. Denne protokollen demonstrerer prosedyrene, inkludert fremstilling av dyrkede tumorceller, tumorimplantasjon, cellebestråling, måling av tumorvekst, isolering av intratumorale immunceller og flowcytometrianalyse.
Abstract
Fms-lignende tyrosinkinase 3-ligand (Flt3L) er et hematopoietisk cytokin som fremmer overlevelse og differensiering av dendrittiske celler (DC). Det har blitt brukt i tumorvaksiner for å aktivere medfødt immunitet og forbedre antitumorresponser. Denne protokollen demonstrerer en terapeutisk modell ved bruk av cellebasert tumorvaksine bestående av Flt3L-uttrykkende B16-F10 melanomceller sammen med fenotypisk og funksjonell analyse av immunceller i tumormikromiljøet (TME). Prosedyrer for dyrkede tumorcellepreparater, tumorimplantasjon, cellebestråling, måling av tumorstørrelse, intratumoral immuncelleisolasjon og flowcytometrianalyse er beskrevet. Det overordnede målet med denne protokollen er å gi en preklinisk solid tumor immunterapi modell, og en forskningsplattform for å studere forholdet mellom tumorceller og infiltrerende immunceller. Immunterapiprotokollen som er beskrevet her, kan kombineres med andre terapeutiske modaliteter, for eksempel immunkontrollpunktblokkade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1 antistoffer) eller kjemoterapi for å forbedre kreftterapeutisk effekt av melanom.
Introduction
Kreftimmunterapi har blitt anerkjent som en lovende terapeutisk strategi basert på mindre giftige bivirkninger og mer holdbare responser. Flere typer immunterapier er utviklet, inkludert onkolytiske virusterapier, kreftvaksiner, cytokinbehandlinger, monoklonale antistoffer, adoptivcelleoverføring (CAR-T-celler eller CAR-NK) og immunkontrollpunktblokkade1.
For kreftvaksiner finnes det ulike former for terapeutiske vaksiner, som helcellebaserte vaksiner, protein- eller peptidvaksiner, og RNA- eller DNA-vaksiner. Vaksinasjon er avhengig av evnen til antigenpresenterende celler (APCs) til å behandle tumorantigener, inkludert tumorspesifikke antigener, og presentere dem i immunogen form til T-celler. Dendrittiske celler (DCs) har vært kjent for å være de mest potente APCene og antas å spille en viktig rolle i antitumorimmunitet 2,3. Disse cellene tar opp og behandler tumorantigener, og migrerer deretter til drenerende lymfeknuter (dLN) for å prime og aktivere tumorspesifikke T-effektorceller (Teff) gjennom engasjement av T-cellereseptoren (TCR) og kostimulatoriske molekyler. Dette resulterer i differensiering og utvidelse av tumorspesifikke cytotoksiske T-celler (CTL), som infiltrerer svulsten og dreper tumorceller4. Følgelig representerer aktivering og modning av DCs attraktive strategier for å stimulere immunitet mot tumorantigener.
Flt3L er kjent for å fremme modning og utvidelse av funksjonelt modne DCer som uttrykker MHC klasse II, CD11c, DEC205 og CD86 proteiner5. Intratumoral, men ikke intravenøs, administrering av en adenovirusvektor som inneholder Flt3L-genet ( Adv-Flt3L ) har vist seg å fremme immunterapeutisk aktivitet mot ortrotopiske svulster6. Flt3L har også blitt brukt i tumorcellebaserte vaksiner som består av bestrålte B16-F10-celler som stabilt uttrykker retroviralt transducert Flt3L som en måte å øke krysspresentasjonen av tumorantigener av DCs og dermed øke antitumorresponsen. Protokollen for B16-Flt3L tumorvaksinasjon beskrevet her er basert på en studie publisert av Dr. James Allisons gruppe7. I dette papiret rapporterte de at en B16-Flt3L-vaksine kombinert med CTLA-4-blokkering synergistisk induserte avvisningen av etablert melanom, noe som resulterte i økt overlevelse.
Målet med denne protokollen er å gi en preklinisk immunterapimodell for melanom. Her beskrives detaljerte prosedyrer for hvordan man forbereder og implanterer tumorvaksiner, og hvordan man analyserer sammensetningen og funksjonen til intratumorale immunceller fra solid tumor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle musene som ble brukt i studien ble vedlikeholdt og plassert i vivariumet til La Jolla Institute for Immunology (LJI) under spesifikke patogenfrie forhold med kontrollert temperatur og fuktighet. Dyreforsøk ble utført med 8-14 uker gamle kvinnelige C57BL / 6 mus i henhold til retningslinjer og protokoller godkjent av LJI Animal Care Committee.
1. Forberedelse av dyrkede tumorceller for implantasjon
- Kultur B16-F10 melanomceller i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) som inneholder 10% varmeinaktivert FBS, 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 1 mM MEM ikke-essensielle aminosyrer og 100 U / ml hver av penicillin og streptomycin. Oppretthold cellelinjen ved 37 °C under 5 % CO2.
- Frø 1,5-2 x 106 B16-F10 celler i en 175T kolbe og kultur i 2 dager. Høst celler når de er 75% -80% sammenflytende.
- Fjern kulturmediet og vask kolben en gang med PBS. Aspirer PBS og tilsett 5 ml 0,25% trypsin-EDTA etterfulgt av hardt tapping av kanten av kulturflasken.
- Tilsett 15 ml kulturmedium for å nøytralisere trypsin-EDTA og hell innholdet i kolben i et 50 ml sentrifugerør. Vask oppvaskflaten med 10 ml PBS og hell i samme 50 ml rør.
- Sentrifuger cellene i 5 minutter ved 200 x g. Kast supernatanten og bryt cellepelleten ved å trykke fingeren på bunnen av røret.
- Tilsett kalde 10 ml PBS og pipet cellesuspensjonen forsiktig; Deretter teller du celler manuelt ved hjelp av hemocytometer. Hold cellene på is før injeksjon.
2. Tumor implantasjon
- Gass bedøver mus med 5% isofluran ved gasstrømningshastighet på 1,0 l per minutt i avtrekkshetten. Endre strømningshastigheten til vedlikeholdsdosen på 2 % isofluran når musene er fullstendig bedøvet. For denne protokollen ble bedøvelse utført av veterinæren i henhold til institusjonens retningslinjer for dyrepleie og bruk.
- Barber håret på venstre flanke av musene og steriliser injeksjonsstedet ved hjelp av alkoholservietter. Intradermalt (i.d.) implantat B16-F10 tumorceller ved 5 x 105 celler i 50 μL kald PBS i venstre flanke ved bruk av en 30 G nål.
MERK: Dosen av implanterte B16-F10 tumorceller må kanskje justeres i området 0,5-5 x 105 celler for vellykket tumorutvikling. - Etter implantasjon måler du tumorlengden og bredden tre ganger i uken ved hjelp av en elektronisk digital tykkelse. Beregn tumorvolumet (mm3) ved hjelp av formelen:
Tumorvolum (mm3) = bredde2 × lengde × 0,5
Behandle mus med tumorvaksine når svulster har nådd en størrelse på ≥2 mm.
MERK: Svulster kan vanligvis måles på dag 3 etter implantasjon av 5 x 105 tumorceller. Raskere B16-F10 tumorveksthastighet ble observert hos mannlige C57BL / 6, Rag1-/-, eller Rag2-/-γc-/-mus. En lignende observasjon ble beskrevet i andre studier8. Det anbefales å holde musens kjønn konsistent. Vær imidlertid oppmerksom på at NIH legger vekt på kjønn som en viktig biologisk variabel i biomedisinsk forskning.
3. Vaksineforberedelse og injeksjon av Flt3L-uttrykkende B16-F10 (B16-Flt3L) celler
- Oppretthold B16-Flt3L-cellene i DMEM som inneholder 8% varmeinaktivert FBS, 2 mM glutamin og 100 U / ml hver av penicillin og streptomycin ved 37 ° C under 5% CO2.
- Frø 1 x 106 B16-Flt3L celler i en 175T kolbe og kultur i 2 dager. Høst celler når de er 75% -80% sammenflytende som beskrevet i trinn 1.3 til 1.6 og suspendere i 1 ml kald PBS.
- Bestråle celler ved 150 Gy dose gammastråler ved bruk av røntgen Irradiator med 160 kV og 25 mA parameterinnstilling. Tell og kontroller cellens levedyktighet ved trypanblå farging før injeksjon.
- Gass bedøver mus som beskrevet tidligere og steriliserer injeksjonsstedet ved hjelp av alkoholservietter. Intradermalt injiser musene med 1 x 10 6 bestrålte B16-Flt3L-celler i 50 μL kald PBS på samme flanke som den opprinnelige tumorimplantasjonen, ~ 1 cm fra stedet for primærtumoren på dagene 3,6 og 9 etter den første celleimplantasjonen.
- Merk vaksineinjeksjonsstedene med en farget penn for å skille den fra den primære svulsten.
MERK: Hvis 0,5 x 105 B16-F10-celler først implanteres, anbefales det å utføre vaksinebehandling på dagene 8, 11 og 14.
4. Intratumoral immuncelleisolasjon
- Ofre mus ved hjelp av CO2 og cervikal dislokasjon i avtrekkshetten ved slutten av forsøket (på dag 15 etter tumorimplantasjon; Figur 1).
- Fjern svulsten kirurgisk med huden fra hver mus og legg den i 24-brønnsplate med 1 ml 10% FBS / RPMI-1640 medium. Tørk svulstene med et papirhåndkle før du veier det.
- Skjær svulstene i små biter. Tilsett 2 ml fordøyelsesbuffer (100 μg/ml TL Liberase og 200 μg/ml DNase I i RPMI-1640 medium) og inkuber i 25 minutter ved 37 °C.
- Tilsett 10 ml 10% FBS / RPMI-1640 medium for å stoppe fordøyelsen. Overfør cellene ved hjelp av en 25 ml serologisk pipette og bruk stempelet på en 1 ml sprøyte til å male vev på en 40 μm cellesil.
- Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspend pelleten i 5 ml 40% tetthetsgradientspesifikt medium i PBS, fortynnet til 1x konsentrasjon).
- Tilsett cellesuspensjonen sakte på toppen av 5 ml 80 % tetthetsgradientspesifikt medium som inneholder PBS. Sentrifuger cellene ved 325 x g med lav bremseinnstilling i 23 minutter ved romtemperatur (RT).
- Etter sentrifugering samler du forsiktig leukocyttlaget ved grensesnittet mellom 40% og 80% tetthetsgradientspesifikt medium og passerer det gjennom en 40 μm cellesil. Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Inkuber pelleten i 2 ml lysisbuffer for røde blodlegemer (RBC) i 5 minutter ved RT. Etter inkubasjon, tilsett 10 ml 10% FBS / RPMI-1640 medium for å slukke RBC-lysebufferen.
- Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspend cellene i 0,5 ml 10% FBS / RPMI-1640 medium og telle totalt antall celler før bruk for videre analyse.
MERK: Samle milten eller dLN som kontroller for gatingstrategi for immuncelleundergrupper ved flowcytometrianalyse. Følg celleisolasjonsmetoden som beskrevet ovenfor med følgende endringer: Bruk stempelet på en 1 ml sprøyte til å male vev på et 70 μm maskefilter. Vask vevet med 10% FBS / RPMI-1640 medium for å få enkeltcellesuspensjoner. Lyse RBC som beskrevet.
5. Flowcytometri analyse
MERK: Celler samlet fra leukocyttlaget inneholder immunceller og tumorceller. To uavhengige fargepaneler anbefales.
- Flekker på overflaten
- Overfør cellene til en 96-brønns V-form-bunnplate. Vask cellene med PBS og beis dem med celle levedyktighet fargestoff (50-100 μL / brønn) i 15 min ved RT.
- Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Flekk overflatemarkørene med blandede antistoffer (detaljert fortynning er gitt i materialtabell) i FACS-buffer (1% FBS og 0,05% NaN3 i PBS) i 30 minutter på is (50-100 μL / brønn).
- Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 minutter og vask dem med FACS-buffer to ganger.
- Fest cellene med cellefikseringsbuffer (50-100 μL / brønn) i 35 minutter på is. Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 minutter og vask dem to ganger med FACS-buffer.
- Oppbevar prøvene i FACS-buffer (150-200 μL / rør) ved 4 ° C og beskytt mot lys. Oppnå prøvene på et flowcytometer. For DCer og T-celler populasjon, følg gating strategier gitt i figur 2B og figur 3A.
MERK: For farging av myeloide DCer anbefales inkubering av FC-blokkering (Rat anti-mus CD16/CD32) i 15 minutter på is før inkubasjon av overflateantistoffer (trinn 5.1.2).
- Cytokinanalyse ved ex vivo restimulering
- Plate cellene i komplett medium (RPMI-1640 supplert med 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7,2-7,6, 0,1 mM ikke-essensiell aminosyre, 1 mM natriumpyruvat, 100 U / ml hver penicillin og streptomycin, 50 μM 2-merkaptoetanol og 2 mM L-glutamin) og stimuler med 50 ng / ml PMA pluss 1 μM ionomycin i nærvær av proteintransporthemmer i 4 timer ved 37 ° C under 5% CO2.
- Utfør overflatefarging for overflatemarkører som beskrevet ovenfor i trinn 5.1.
- Tilsett permeabiliseringsløsningen (50-100 μL / brønn) og inkuber i 5 minutter ved RT for intracellulær farging. Inkuber cellene med antistoffer som er spesifikke for cytokiner eller nukleære proteiner i permeabiliseringsløsning (50-100 μL / brønn) i 60 minutter på is eller over natten ved 4 ° C.
- Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 minutter og vask dem med FACS-buffer to ganger. Oppbevar prøvene ved 4 °C og beskytt mot lys. Oppnå prøvene på et flowcytometer.
MERK: Antistofffortynning må kanskje justeres etter behov for å oppnå optimal farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En synlig svart prikk av de implanterte B16-F10-cellene observeres vanligvis på hudoverflaten ~ 3 dager etter tumorimplantasjon. Mus behandles med tumorvaksinen 3, 6 og 9 dager etter at tumorknuten har nådd en størrelse på ≥2 mm. Vi observerte en signifikant reduksjon i tumorvekst i vaksinerte mus gruppe ~ 2 uker etter tumorimplantasjon (figur 1). På slutten av forsøket isolerte vi de intratumorale immuncellene og analyserte deres antall og celleoverflatemarkøruttrykk, samt cytokinproduksjon etter en kort in vitro-stimulering som beskrevet ovenfor. Celler samlet fra leukocyttlaget inneholder fortsatt mange tumorceller, noe som gjør det noe vanskelig å lett definere lymfocyttpopulasjonen. Bruk av parallelle splencytter anbefales derfor for riktig gating av intratumorale immuncelleundergrupper i flowcytometrianalyse (figur 2A). Her vises gatingstrategier for CD103 + CD11c + DC, CD8 +, CD4 + og Treg (figur 2B og figur 3A) sammen med kompensasjonsmatrisen (tabell 1 og tabell 2). Representative data for oppnådde tellinger og hyppighet av hver populasjon er også gitt i figur 2C og figur 3B.
Intratumoral CD103 + CD11c + DCs, som representerer de mest potente tumorantigenbehandlings- og presentasjonscellene9,10, fra vaksinerte mus, viste et signifikant forhøyet uttrykk for den kostimulatoriske liganden CD86 (figur 4). Vaksinerte mus viste også en økning i tumorinfiltrerende CD8+ og CD4+Foxp3− T-celler (figur 5A), samt i CD8+GzmB+ og IFN-γ+ CTLer (figur 5B). Disse resultatene tyder på at denne tumorvaksinasjonen fremmer DC-modning og induserer sterkere antitumorimmunitet.
Figur 1: Analyse av tumorvekst i terapeutisk modell av cellebasert tumorvaksine ved bruk av Flt3L-uttrykkende B16-F10 melanomceller. Kvinnelige C57BL/6-mus ble implantert i.d. med B16-F10-celler (5 x 105) og injisert med bestrålte (150 Gy) B16-Flt3L-celler (1 x 106) på et tilstøtende sted på samme flanke. Pilspissene angir tidspunktene for vaksinering. Kumulative data fra fire eksperimenter vises (Control, n = 12; B16-Flt3L, n = 10). Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse ved toveis gjentatte målinger ANOVA test med Bonferroni post-test. *P < 0,05; ***P < 0,001. Dette tallet er endret fra11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Gatingstrategier for lymfocytter og CD103+CD11c+DCer. (A) Gating strategier av lymfocytter i milt og tumor prøver. (B) Gating strategier for intratumoral CD103 + CD11c + DCs i tumorprøve. (C) Ervervede tellinger og frekvens av hver populasjon fra en representativ uvaksinert kontrollmus vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Gateing-strategier for CD8+, CD4+ og Treg. (A) Gating strategier av T-celler i tumorprøve. (B) Ervervede tellinger og frekvens av hver populasjon fra en representativ uvaksinert kontrollmus vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: CD86 overflateuttrykk på CD103+ intratumorale DCer. Ekspresjon rapporteres som median fluorescensintensitet (MFI) normalisert til gjennomsnittlig MFI i kontrollgruppen (= 1). Kontroll, n = 8; B16-Flt3L, n = 10. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse ved uparret Student t-test. **P < 0,01. Dette tallet er endret fra11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Analyse av intratumorale T-celler hos kontroll- og vaksinerte mus. (A) Oppregning av tumorinfiltrerende CD8+ (venstre) og ikke-Treg CD4+ (høyre) per gram tumorvev. (B) Oppregning av intratumorale GzmB+ (venstre) og IFNγ+ (høyre) CD8+ T-celler. Kontroll, n = 11; B16-Flt3L, n = 10. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse ved uparret Student t-test. *P < 0,05; **P < 0,01. Dette tallet er endret fra11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Kompensasjonsmatrise i figur 2. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Kompensasjonsmatrise i figur 3. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her er basert på studien av Allisons gruppe. De viste at kombinasjonen av B16-Flt3L-vaksine med CTLA-4-blokkering viste en synergistisk effekt på overlevelse og tumorvekst, mens ingen reduksjon av tumorvekst ble sett hos mus som fikk B16-Flt3L-vaksinen eller anti-CTLA-4-antistoffbehandlingen alene7. Nylige studier har avslørt en ny Treg-inneboende CTLA4-PKCη signalvei som spiller en viktig obligatorisk rolle i å regulere den kontaktavhengige undertrykkende aktiviteten til Treg11. Både B16-Flt3L-vaksinebehandling alene eller vaksinekombinasjon med Treg-spesifikk PKCη-delesjon reduserte signifikant veksten av tumor når høyere antall (0,5-5 x 105) av B16-F10 melanomceller enn i Allisons studie (1 x 104) celler ble implantert. Subtile forskjeller i kilden til melanomceller eller mus kan utgjøre denne forskjellen. Derfor anbefales det å titrere antall implanterte tumorceller. Økt infiltrasjon av CD8+ T-celler i primærtumor ble tilsvarende observert i forrige studie7. I tillegg observerte vi økt CD86-uttrykk på intratumoral CD103 + CD11c + DCs, noe som sannsynligvis står for en sterkere aktivering og utvidelse av tumorinfiltrerende CD8 + CTLer.
Denne protokollen, ved hjelp av en cellebasert tumorvaksine som uttrykker Flt3L, er praktisk og grei å bruke, og fungerer som en pålitelig modell for å studere intratumorale immuncelleinfiltrater, inkludert DCs. For eksempel er PKCη-signalering nødvendig for den kontaktavhengige undertrykkende aktiviteten til Treg. Dermed viste Prkch−/− Treg høyere konjugeringseffektivitet med APC-er i et Treg -DC in vitro-kokultursystem, noe som indikerer en defekt i Prkch−/− Tregs evne til å bryte kontakten og koble seg fra vedlagte DCer 12. B16-Flt3L-vaksinasjon rekrutterer sannsynligvis mer modne DCer som presenterer tumorspesifikke antigener mer effektivt, og det er derfor sannsynlig å lette observasjonen av samspillet mellom tumorinfiltrerende Treg og DC ved levende celleavbildning.
Å holde tilstrekkelig avstand mellom primærtumor og tumorvaksine er et viktig trekk ved denne protokollen. Denne fysiske separasjonen er kritisk for å gi rom for vekst av den primære svulsten og unngå potensiell fusjon mellom de to tumorimplantatene. Alternativt kan tumorvaksinen implanteres i motsatt flanke i forhold til primærtumor, da dette også ble rapportert å hemme tumorvekst7. En begrensning av studien er mangelen på en kommersiell kilde til B16-Flt3L cellelinje, men det samme konseptet kan brukes på andre tumortyper, for eksempel TRAMP-C2 prostataadenokarsinomer7.
Selv om protokollen beskrevet her bruker B16-F10 melanomceller som tumormodell, kan de underliggende prinsippene tilpasses og modifiseres etter behov for å etablere immunterapeutiske modeller for andre solide svulster. Videre kan vaksinasjonsprotokollen vi brukte lett kombineres med andre terapeutiske modaliteter, for eksempel CTLA-4- eller PD-1-basert sjekkpunktblokkade, for å oppnå additive eller synergistiske effekter som potensielt kan resultere i mer potent antitumorimmunitet og økt overlevelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Stephen Schoenberger for å gi B16-Flt3L-celler og personalet på LJI-dyret og flowcytometrifasilitetene for utmerket støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
| 30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
| B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
| GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| Antibodies | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
References
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Banchereau, J., et al.
- Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
- Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
- Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280 (2004).
- Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
- Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
- Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).
- Salmon, H., et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Liu, H. Y., et al. Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).
- Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).
