Summary
Protokollen præsenterer en kræftimmunterapimodel ved hjælp af cellebaseret tumorvaccination med Flt3L-ekspressive B16-F10 melanom. Denne protokol demonstrerer procedurerne, herunder forberedelse af dyrkede tumorceller, tumorimplantation, cellebestråling, måling af tumorvækst, isolering af intratumorale immunceller og flowcytometrianalyse.
Abstract
Fms-lignende tyrosinkinase 3 ligand (Flt3L) er et hæmatopoietisk cytokin, der fremmer overlevelse og differentiering af dendritiske celler (DC'er). Det er blevet brugt i tumorvacciner til at aktivere medfødt immunitet og forbedre antitumorresponser. Denne protokol demonstrerer en terapeutisk model ved anvendelse af cellebaseret tumorvaccine bestående af Flt3L-ekspressive B16-F10 melanomceller sammen med fænotypisk og funktionel analyse af immunceller i tumormikromiljøet (TME). Procedurer for dyrkning af tumorcelleforberedelse, tumorimplantation, cellebestråling, måling af tumorstørrelse, intratumoral immuncelleisolering og flowcytometrianalyse er beskrevet. Det overordnede mål med denne protokol er at tilvejebringe en præklinisk solid tumorimmunterapimodel og en forskningsplatform til at studere forholdet mellem tumorceller og infiltrerende immunceller. Immunterapiprotokollen beskrevet her kan kombineres med andre terapeutiske modaliteter, såsom immunkontrolpunktblokade (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1 antistoffer) eller kemoterapi for at forbedre den kræftterapeutiske virkning af melanom.
Introduction
Cancer immunterapi er blevet anerkendt som en lovende terapeutisk strategi baseret på dens mindre giftige bivirkninger og mere holdbare reaktioner. Der er udviklet flere typer immunterapier, herunder onkolytiske virusterapier, kræftvacciner, cytokinterapier, monoklonale antistoffer, adoptivcelleoverførsel (CAR-T-celler eller CAR-NK) og immunkontrolpunktblokade1.
For kræftvacciner er der forskellige former for terapeutiske vacciner, såsom hele cellebaserede vacciner, protein- eller peptidvacciner og RNA- eller DNA-vacciner. Vaccination er afhængig af antigenpræsenterende cellers (APC'ers) evne til at behandle tumorantigener, herunder tumorspecifikke antigener, og præsentere dem i en immunogen form for T-celler. Dendritiske celler (DC'er) har været kendt for at være de mest potente APC'er og menes at spille en vigtig rolle i antitumorimmunitet 2,3. Disse celler optager og behandler tumorantigener og migrerer derefter til de drænende lymfeknuder (dLN) for at prime og aktivere tumorspecifikke T-effektor (Teff) celler gennem engagement af T-cellereceptoren (TCR) og costimulatoriske molekyler. Dette resulterer i differentiering og udvidelse af tumorspecifikke cytotoksiske T-celler (CTL), som infiltrerer tumoren og dræber tumorceller4. Derfor repræsenterer aktivering og modning af DC'er attraktive strategier til at stimulere immunitet mod tumorantigener.
Flt3L er kendt for at fremme modning og udvidelse af funktionelt modne DC'er, der udtrykker MHC klasse II, CD11c, DEC205 og CD86 proteiner5. Intratumoral, men ikke intravenøs, administration af en adenovirusvektor, der inkorporerer Flt3L-genet (Adv-Flt3L), har vist sig at fremme immunterapeutisk aktivitet mod ortrotopiske tumorer6. Flt3L er også blevet anvendt i tumorcellebaserede vacciner bestående af bestrålede B16-F10-celler, der stabilt udtrykker retroviralt transduceret Flt3L som en måde at forbedre krydspræsentationen af tumorantigener af DC'er og dermed øge antitumorresponserne. Protokollen for B16-Flt3L tumorvaccination beskrevet her er baseret på en undersøgelse offentliggjort af Dr. James Allisons gruppe7. I dette papir rapporterede de, at en B16-Flt3L-vaccine kombineret med CTLA-4-blokade synergistisk inducerede afvisning af etableret melanom, hvilket resulterede i øget overlevelse.
Målet med denne protokol er at tilvejebringe en præklinisk immunterapimodel for melanom. Her beskrives detaljerede procedurer for, hvordan man forbereder og implanterer tumorvacciner, og hvordan man analyserer sammensætningen og funktionen af intratumorale immunceller fra fast tumor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus, der blev brugt i undersøgelsen, blev vedligeholdt og anbragt i vivarium fra La Jolla Institute for Immunology (LJI) under specifikke patogenfrie forhold med kontrolleret temperatur og fugtighed. Dyreforsøg blev udført med 8-14 uger gamle hunmus C57BL/6 i henhold til retningslinjer og protokoller godkendt af LJI Animal Care Committee.
1. Forberedelse af dyrkede tumorceller til implantation
- Kultur B16-F10 melanomceller i Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) indeholdende 10% varmeinaktiveret FBS, 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 1 mM MEM ikke-essentielle aminosyrer og 100 U / ml hver af penicillin og streptomycin. Cellelinjen holdes ved 37 °C under 5 % CO2.
- Frø 1,5-2 x 106 B16-F10 celler i en 175T kolbe og kultur i 2 dage. Høst celler, når de er 75% -80% sammenflydende.
- Dyrkningsmediet fjernes, og kolben vaskes én gang med PBS. Aspirer PBS og tilsæt 5 ml 0,25% trypsin-EDTA efterfulgt af hårdt tryk på kanten af kulturkolben.
- Tilsæt 15 ml kulturmedium for at neutralisere trypsin-EDTA og hæld kolbens indhold i et 50 ml centrifugerør. Vask opvaskefladen med 10 ml PBS og hæld i det samme 50 ml rør.
- Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 200 x g. Kassér supernatanten og bryd cellepelleten ved at fingerklikke på bunden af røret.
- Tilsæt kolde 10 ml PBS og pipet forsigtigt cellesuspensionen; Tæl derefter manuelt celler ved hjælp af hæmocytometer. Hold cellerne på is før injektion.
2. Implantation af tumor
- Gasbedøvelse af mus med 5% isofluran ved gasstrømningshastighed på 1,0 L pr. Minut i røghætten. Skift strømningshastigheden til vedligeholdelsesdosis på 2% isofluran, når musene er fuldt bedøvet. For denne protokol blev bedøvelse udført af dyrlægen efter de institutionelle retningslinjer for dyrepleje og brug.
- Barber håret på musenes venstre flanke og steriliser injektionsstedet ved hjælp af alkoholservietter. Intradermalt (i.d.) implantat B16-F10 tumorceller ved 5 x 105 celler i 50 μL kold PBS i venstre flanke ved hjælp af en 30 G nål.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at justere dosis af implanterede B16-F10 tumorceller i området 0,5-5 x 105 celler for en vellykket tumorudvikling. - Efter implantation måles tumorlængden og bredden tre gange om ugen ved hjælp af en elektronisk digital tykkelse. Beregn tumorvolumenet (mm3) ved hjælp af formlen:
Tumorvolumen (mm3) = bredde2 × længde × 0,5
Behandl mus med tumorvaccine, når tumorer har nået en størrelse på ≥2 mm.
BEMÆRK: Tumorer kan normalt måles på dag 3 efter implantation af 5 x 105 tumorceller. Hurtigere B16-F10 tumorvækstrate blev observeret hos mandlige C57BL / 6, Rag1-/-eller Rag2-/-γc-/-mus. En lignende observation blev beskrevet i andre undersøgelser8. Det anbefales at holde musenes køn konsistent. Bemærk dog, at NIH lægger vægt på køn som en vigtig biologisk variabel i biomedicinsk forskning.
3. Vaccineforberedelse og injektion af Flt3L-ekspressive B16-F10 (B16-Flt3L) celler
- B16-Flt3L-cellerne i DMEM indeholder 8% varmeinaktiveret FBS, 2 mM glutamin og 100 U/ml hver af penicillin og streptomycin ved 37 °C under 5% CO2.
- Frø 1 x 106 B16-Flt3L celler i en 175T kolbe og kultur i 2 dage. Høst celler, når de er 75% -80% sammenflydende som beskrevet i trin 1.3 til 1.6 og suspender i 1 ml kold PBS.
- Bestråle celler ved 150 Gy dosis gammastråler ved hjælp af røntgenbestråler med 160 kV og 25 mA parameterindstilling. Tæl og kontroller cellens levedygtighed ved trypanblå farvning før injektion.
- Gas bedøver mus som beskrevet tidligere og steriliserer injektionsstedet ved hjælp af alkoholservietter. Invatermt injicere musene med 1 x 10 6 bestrålede B16-Flt3L-celler i 50 μL kold PBS på samme flanke som den oprindelige tumorimplantation, ~ 1 cm væk fra stedet for den primære tumor på dag 3,6 og 9 efter den oprindelige celleimplantation.
- Marker vaccineinjektionsstederne med en farvet pen for at skelne den fra den primære tumor.
BEMÆRK: Hvis 0,5 x 105 B16-F10-celler oprindeligt implanteres, anbefales det at udføre vaccinebehandling på dag 8, 11 og 14.
4. Intratumoral immuncelleisolering
- Ofre mus ved hjælp af CO2 og cervikal dislokation i røghætten i slutningen af eksperimentet (på dag 15 efter tumorimplantation; Figur 1).
- Fjern kirurgisk tumoren med huden fra hver mus og læg den i 24-brøndsplade med 1 ml 10% FBS / RPMI-1640 medium. Tør tumorerne ved hjælp af et papirhåndklæde, inden du vejer det.
- Skær tumorerne i små stykker. Der tilsættes 2 ml fordøjelsesbuffer (100 μg/ml TL Liberase og 200 μg/ml DNase I i RPMI-1640 medium) og inkuberes i 25 minutter ved 37 °C.
- Tilsæt 10 ml 10% FBS / RPMI-1640 medium for at stoppe fordøjelsen. Overfør cellerne ved hjælp af en 25 ml serologisk pipette, og brug stemplet på en 1 ml sprøjte til at male væv på en 40 μm cellesi.
- Centrifuger cellerne ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Pelleten resuspenderes i 5 ml med 40 % densitetsgradientspecifikt medium i PBS, fortyndet til 1x koncentration).
- Cellesuspensionen tilsættes langsomt oven på 5 ml 80% densitetsgradientspecifikt medium indeholdende PBS. Centrifuge cellerne ved 325 x g med lav bremseindstilling i 23 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Efter centrifugering opsamles leukocytlaget forsigtigt ved grænsefladen mellem 40% og 80% densitetsgradientspecifikt medium og føres gennem en 40 μm cellesi. Centrifuger cellerne ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Inkuber pelleten i 2 ml røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer i 5 minutter ved RT. Efter inkubation tilsættes 10 ml 10% FBS / RPMI-1640 medium for at slukke RBC-lysisbufferen.
- Centrifuger cellerne ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender cellerne i 0,5 ml 10% FBS / RPMI-1640 medium og tæl det samlede antal celler før brug til yderligere analyse.
BEMÆRK: Saml milten eller dLN som kontroller til gatingstrategi for immuncelleundergrupper ved flowcytometrianalyse. Følg celleisoleringsmetoden som beskrevet ovenfor med følgende ændringer: Brug stemplet på en 1 ml sprøjte til at male væv på et 70 μm maskefilter. Vask vævet med 10% FBS / RPMI-1640 medium for at få encellesuspensioner. Lys RBC som beskrevet.
5. Analyse af flowcytometri
BEMÆRK: Celler indsamlet fra leukocytlaget indeholder immunceller og tumorceller. To uafhængige farvningspaneler anbefales.
- Overfladefarvning
- Overfør cellerne til en 96-brønds V-form-bundplade. Vask cellerne med PBS og pletter dem med cellelevedygtighedsfarve (50-100 μL/brønd) i 15 minutter ved RT.
- Centrifuger cellerne ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Plet overflademarkørerne med blandede antistoffer (detaljeret fortynding findes i materialetabellen) i FACS-buffer (1% FBS og 0,05% NaN3 i PBS) i 30 minutter på is (50-100 μL/ brønd).
- Centrifuger cellerne ved 500 x g i 5 minutter og vask dem med FACS-buffer to gange.
- Fix cellerne med cellefikseringsbuffer (50-100 μL / brønd) i 35 min på is. Centrifuger cellerne ved 500 x g i 5 minutter og vask dem to gange med FACS-buffer.
- Prøverne opbevares i FACS-buffer (150-200 μL/rør) ved 4 °C, og der beskyttes mod lys. Anskaf prøverne på et flowcytometer. For DC'er og T-celler population, følg gating strategier angivet i figur 2B og figur 3A.
BEMÆRK: Til farvning af myeloide DC'er anbefales inkubering af FC-blokker (Rat anti-mouse CD16/CD32) i 15 minutter på is før overfladeantistofinkubation (trin 5.1.2).
- Cytokinanalyse ved ex vivo-restimulering
- Plade cellerne i komplet medium (RPMI-1640 suppleret med 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7,2-7,6, 0,1 mM ikke-essentiel aminosyre, 1 mM natriumpyruvat, 100 U / ml hver penicillin og streptomycin, 50 μM 2-mercaptoethanol og 2 mM L-glutamin) og stimulere med 50 ng / ml PMA plus 1 μM ionomycin i nærværelse af proteintransporthæmmer i 4 timer ved 37 ° C under 5% CO2.
- Udfør overfladefarvning for overflademarkører som beskrevet ovenfor i trin 5.1.
- Tilsæt permeabiliseringsopløsningen (50-100 μL/brønd) og inkuber i 5 minutter ved RT til intracellulær farvning. Inkubere cellerne med antistoffer, der er specifikke for cytokiner eller nukleare proteiner i permeabiliseringsopløsning (50-100 μL/brønd) i 60 minutter på is eller natten over ved 4 °C.
- Centrifuger cellerne ved 500 x g i 5 minutter og vask dem med FACS-buffer to gange. Prøverne opbevares ved 4 °C, og der beskyttes mod lys. Anskaf prøverne på et flowcytometer.
BEMÆRK: Antistoffortynding skal muligvis justeres efter behov for at opnå optimal farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En synlig sort prik af de implanterede B16-F10-celler observeres normalt på hudoverfladen ~ 3 dage efter tumorimplantation. Mus behandles med tumorvaccinen 3, 6 og 9 dage efter, at tumorknuden har nået en størrelse på ≥2 mm. Vi observerede en signifikant reduktion i tumorvækst hos vaccinerede mus ~ 2 uger efter tumorimplantation (figur 1). I slutningen af eksperimentet isolerede vi de intratumorale immunceller og analyserede deres antal og celleoverflademarkørekspression samt cytokinproduktion efter en kort in vitro-stimulering som beskrevet ovenfor. Celler indsamlet fra leukocytlaget indeholder stadig mange tumorceller, hvilket gør det noget vanskeligt at let definere lymfocytpopulationen. Derfor anbefales det at anvende parallelle splenocytter til korrekt gating af intratumorale immuncelleundergrupper i flowcytometrianalyse (figur 2A). Her vises gatingstrategier for CD103+CD11c+DC, CD8+, CD4+ og Treg (figur 2B og figur 3A) sammen med kompensationsmatrixen (tabel 1 og tabel 2). Repræsentative data om erhvervede tællinger og hyppighed af hver population findes også i figur 2C og figur 3B.
Intratumoral CD103 + CD11c + DC'er, som repræsenterer de mest potente tumorantigenbehandlings- og præsentationsceller9,10, fra vaccinerede mus viste en signifikant forhøjet ekspression af den costimulatoriske ligand CD86 (figur 4). Vaccinerede mus viste også en stigning i tumorinfiltrerende CD8+ og CD4+Foxp3− T-celler (figur 5A) samt i CD8+GzmB+ og IFN-γ+ CTL'er (figur 5B). Disse resultater tyder på, at denne tumorvaccination fremmer DC-modning og inducerer stærkere antitumorimmunitet.
Figur 1: Analyse af tumorvækst i en terapeutisk model af cellebaseret tumorvaccine ved hjælp af Flt3L-ekspressive B16-F10 melanomceller. Hunmus med C57BL/6 blev implanteret med B16-F10-celler (5 x 105) og injiceret med bestrålede (150 Gy) B16-Flt3L-celler (1 x 106) på et tilstødende sted på samme flanke. Pilespidserne angiver tidspunkterne for vaccination. Kumulative data fra fire eksperimenter er vist (Kontrol, n = 12; B16-Flt3L, n = 10). Data præsenteres som middelværdien ± SEM. Statistisk analyse ved tovejs gentagne målinger ANOVA test med Bonferroni post-test. *P < 0,05; ***P < 0,001. Dette tal er ændret fra11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Gatingstrategier for lymfocytter og CD103+CD11c+DC'er. (A) Gating strategier af lymfocytter i milt og tumor prøver. (B) Gatingstrategier for intratumoral CD103 + CD11c + DC'er i tumorprøve. (C) Erhvervede tællinger og hyppighed af hver population fra en repræsentativ uvaccineret kontrolmus er vist. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Gating-strategier for CD8+, CD4+ og Treg. (A) Gating strategier af T-celler i tumorprøve. (B) Erhvervede tællinger og hyppighed af hver population fra en repræsentativ uvaccineret kontrolmus er vist. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: CD86 overfladeekspression på CD103+ intratumorale DC'er. Ekspression rapporteres som median fluorescensintensitet (MFI) normaliseret til gennemsnitlig MFI i kontrolgruppen (= 1). kontrol, n = 8; B16-Flt3L, n = 10. Data præsenteres som middelværdien ± SEM. Statistisk analyse af uparret Student's t-test. **P < 0,01. Dette tal er ændret fra11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Analyse af intratumorale T-celler i kontrol og vaccinerede mus . (A) Opregning af tumorinfiltrerende CD8+ (venstre) og ikke-Treg CD4+ (højre) pr. gram tumorvæv. (B) Opregning af intratumorale GzmB + (venstre) og IFNγ+ (højre) CD8 + T-celler. kontrol, n = 11; B16-Flt3L, n = 10. Data præsenteres som middelværdien ± SEM. Statistisk analyse af uparret Student's t-test. *P < 0,05; **P < 0,01. Dette tal er ændret fra11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Kompensationsmatrix i figur 2. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Kompensationsmatrix i figur 3. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her er baseret på undersøgelsen fra Allisons gruppe. De viste, at kombinationen af B16-Flt3L-vaccine med CTLA-4-blokade viste en synergistisk effekt på overlevelsesrate og tumorvækst, mens der ikke sås nogen reduktion af tumorvækst hos mus, der fik B16-Flt3L-vaccinen eller anti-CTLA-4-antistofbehandling alene7. Nylige undersøgelser har afsløret en ny Treg-iboende CTLA4-PKCη signalvej, der spiller en vigtig obligatorisk rolle i reguleringen af den kontaktafhængige undertrykkende aktivitet af Treg11. Både B16-Flt3L-vaccinebehandling alene eller vaccinekombination med Treg-specifik PKCη-deletion reducerede signifikant væksten af tumor, når højere antal (0,5-5 x 105) B16-F10 melanomceller end i Allisons undersøgelse (1 x 104) celler blev implanteret. Subtile forskelle i kilden til melanomceller eller mus kan forklare denne forskel. Derfor anbefales det at titrere antallet af implanterede tumorceller. Øget infiltration af CD8+ T-celler i den primære tumor blev ligeledes observeret i den tidligere undersøgelse7. Derudover observerede vi øget CD86-ekspression på intratumoral CD103 + CD11c + DC'er, hvilket sandsynligvis tegner sig for en stærkere aktivering og udvidelse af tumorinfiltrerende CD8 + CTL'er.
Denne protokol, der bruger en cellebaseret tumorvaccine, der udtrykker Flt3L, er praktisk og ligetil at bruge og fungerer som en pålidelig model til undersøgelse af intratumorale immuncelleinfiltrater, herunder DC'er. For eksempel er PKCη-signalering påkrævet for den kontaktafhængige undertrykkende aktivitet af Treg. Prkch−/− Treg udviste således højere konjugationseffektivitet med APC'er i et Treg-DC in vitro-kokultursystem, hvilket indikerer en defekt i Prkch−/− Tregs evne til at bryde kontakten og løsrive sig fra vedhæftede DC'er12. B16-Flt3L-vaccination rekrutterer sandsynligvis mere modne DC'er, der præsenterer tumorspecifikke antigener mere effektivt, og det vil således sandsynligvis lette observation af interaktionen mellem tumorinfiltrerende Treg og DC ved levende cellebilleddannelse.
At holde en tilstrækkelig afstand mellem den primære tumor og tumorvaccinen er et vigtigt træk ved denne protokol. Denne fysiske adskillelse er afgørende for at give plads til vækst af den primære tumor og undgå potentiel fusion mellem de to tumorimplantater. Alternativt kan tumorvaccinen implanteres i den modsatte flanke i forhold til den primære tumor, da dette også blev rapporteret at hæmme tumorvækst7. En begrænsning af undersøgelsen er manglen på en kommerciel kilde til B16-Flt3L cellelinje, men det samme koncept kan anvendes på andre tumortyper, for eksempel TRAMP-C2 prostata adenocarcinomer7.
Selvom protokollen beskrevet her bruger B16-F10 melanomceller som en tumormodel, kan de underliggende principper tilpasses og modificeres efter behov for at etablere immunterapeutiske modeller for andre solide tumorer. Desuden kan den vaccinationsprotokol, vi brugte, let kombineres med andre terapeutiske modaliteter, f.eks. CTLA-4- eller PD-1-baseret checkpoint-blokade, for at opnå additive eller synergistiske virkninger, der potentielt kan resultere i mere potent antitumorimmunitet og øget overlevelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Stephen Schoenberger for at have leveret B16-Flt3L-celler og personalet på LJI-dyre- og flowcytometrifaciliteterne for fremragende support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
| 30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
| B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
| GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| Antibodies | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
References
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Banchereau, J., et al.
- Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
- Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
- Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280 (2004).
- Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
- Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
- Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).
- Salmon, H., et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Liu, H. Y., et al. Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).
- Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).
