Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Eksperimentell melanom immunterapimodell ved bruk av tumorvaksinasjon med et hematopoietisk cytokin
Chapters
Summary February 24th, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Protokollen presenterer en kreftimmunterapimodell ved bruk av cellebasert tumorvaksinasjon med Flt3L-uttrykkende B16-F10 melanom. Denne protokollen demonstrerer prosedyrene, inkludert fremstilling av dyrkede tumorceller, tumorimplantasjon, cellebestråling, måling av tumorvekst, isolering av intratumorale immunceller og flowcytometrianalyse.
Transcript
Denne protokollen gir klinisk solid tumor immunterapi modell og en forskningsplattform for å studere forholdet mellom tumorceller og infiltrerende immunceller. Denne cellebaserte tumorvaksinen er praktisk, enkel å bruke, og kan kombineres med andre terapeutiske modaliteter som sjekkpunktblokkade, for å oppnå additiv eller synergistisk effekt som kan resultere i mer potent og høy tumorimmunitet. Med på å demonstrere prosedyren vil være Ann Balancio, en forskningstekniker fra laboratoriet mitt.
Til å begynne med, kultur B16-F10 melanomceller i IMDM, som inneholder 10% varmeinaktiv FBS, 2 millimolar glutamin, 1 millimolar natriumpyruvat, 1 millimolar MEM ikke-essensielle aminosyrer og 100 enheter per milliliter hver av penicillin og streptomycin. Oppretthold cellelinjen ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Frø og høst B16-F10-cellene som beskrevet i tekstmanuskriptet.
Fjern kulturmediet og vask kolbene en gang med PBS. Aspirer PBS og tilsett 5 milliliter 0,25% trypsin-EDTA, etterfulgt av hardt tapping av kanten av kulturflasken. Tilsett 15 milliliter kulturmedium for å nøytralisere trypsin-EDTA og hell innholdet i kolben i et 50 milliliter sentrifugerør.
Vask oppvaskflaten med 10 ml PBS og hell i samme 50 milliliter sentrifugerør. Sentrifuger cellene i 5 minutter ved 200 RCF. Kast supernatanten og bryt cellepelleten ved å trykke fingeren på bunnen av røret.
Tilsett kalde 10 milliliter PBS og pipetter forsiktig cellesuspensjonen. Deretter teller du cellene manuelt ved hjelp av et hemocytometer. Hold cellene på is før injeksjon.
Intradermalt implantat 500.000 celler B16-F10 tumorceller i 50 mikroliter kald PBS i venstre flanke, ved hjelp av en 30 gauge nål. Dosen av implanterte B16-F10 tumorceller må kanskje justeres i et område på 50.000 til 500.000 celler for vellykket tumorutvikling. Etter implementering måler du tumorlengden og bredden tre ganger i uken ved hjelp av en elektronisk digital kaliper.
Beregn tumorvolumet og behandle musene med tumorvaksine når svulster har nådd en størrelse på to millimeter som beskrevet i tekstmanuskriptet. Ved hjelp av en røntgenbestråler satt til 160 kilovolt og 25 milliampere, bestråler celler ved 150 grå doser gammastråler. Tell og kontroller cellens levedyktighet ved trypanblå farging før injeksjon.
Intradermalt injisere musene med 1 million bestrålte B16-Flt3L-celler i 50 mikroliter kald PBS på samme flanke som den opprinnelige tumorimplantasjonen. Omtrent en centimeter fra stedet for primærtumoren på dagene 3, 6 og 9 etter den første celleimplantasjonen. Merk vaksineinjeksjonsstedene med en farget penn for å skille dem fra den primære svulsten.
Hvis 50.000 B16-F10-celler først ble implantert, anbefales det å utføre vaksinebehandling på dagene 8, 11 og 14. Kirurgisk fjernet svulsten med huden fra hver euthanized mus og satte den inn i en 24 brønnplate med 1 milliliter 10% FBS RPMI 1640 medium. Skjær svulstene i små biter i to milliliter fordøyelsesbuffer og inkuber i 25 minutter ved 37 grader Celsius.
Tilsett 10 milliliter 10% FBS RPMI 1640 medium for å stoppe fordøyelsen. Overfør cellene til en 40 mikrometer cellesil ved hjelp av en 25 milliliter serologisk pipette. Bruk deretter stempelet på en milliliter sprøyte for å male vevet.
Sentrifuger cellene ved 500 RCF i 5 minutter ved 4 grader Celsius. Resuspend pelleten i 5 milliliter 40% tetthetsgradientspesifikt medium i PBS fortynnet til 1x konsentrasjon. Legg cellesuspensjonen sakte på toppen av 5 milliliter 80% tetthetsgradientspesifikt medium som inneholder PBS.
Sentrifuge til cellene ved 325 RCF med lav bremseinnstilling i 23 minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugering samler du forsiktig leukocyttlaget ved grensesnittet mellom 40% og 80% tetthetsgradientspesifikt medium, og passerer det gjennom en 40 mikrometer cellesil. Sentrifuger cellene ved 500 RCF i 5 minutter ved 4 grader Celsius.
Inkuber pelleten i to milliliter av røde blodlegemer lysis buffer i fem minutter ved romtemperatur. Etter inkubasjon, tilsett 10 milliliter 10% FBS RPMI 1640 medium for å slukke RBC-lysebufferen. Sentrifuger cellene ved 400 RCF i 5 minutter ved 4 grader Celsius.
Resuspend cellene i 0, 5 milliliter 10% FBS RPMI 1640 medium, og telle totalt antall celler før bruk for videre analyse. Samle milten eller drenerende lymfeknuter som kontroller for gatingstrategien til immuncelleundergrupper ved flowcytometrianalyse. Følg celleisolasjonsmetoden som er beskrevet i tekstmanuskriptet.
En synlig svart prikk av de implanterte B16-F10-cellene ble vanligvis observert på hudoverflaten omtrent tre dager etter tumorimplantasjon. Mus ble behandlet med tumorvaksine tre, seks og ni dager etter at svulstknuten hadde nådd eller overskredet størrelsen på to millimeter. En signifikant tumorvekstreduksjon ble observert i den vaksinerte musegruppen omtrent to uker etter tumorimplantasjon.
Celler samlet fra leukocyttlaget inneholdt mange tumorceller, noe som gjør det vanskelig å lett definere lymfocyttpopulasjonen. Derfor ble splenocytt brukt parallelt, for riktig gating av intratumorale immuncelleundergrupper i flowcytometrianalyse. Gating-strategiene for CD103 positiv, CD11C positiv DC, CD8 positiv, CD4 positiv og Treg ble plottet sammen med kompensasjonsmatrisen.
Representative data om oppkjøpte kontoer og hyppighet av hver befolkning ble også gitt. Intratumoral CD103-positiv, CD11C-positiv DC fra vaksinerte mus, viste et signifikant forhøyet uttrykk for den kostimulerende liganden CD86. Vaksinerte mus viste også en økning i tumorinfiltrerende CD8-positive og CD4-positive, Foxp3-negative celler, samt i CD8-positive granzyme B-positive og interferon gamma-positive CTLer.
Hold tilstrekkelig avstand mellom primærtumoren og tumorvaksinen. Denne fysiske separasjonen er kritisk for å unngå potensiell fusjon mellom de to tumorimplantatene.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
