Summary
Protokollet presenterar en cancerimmunterapimodell med cellbaserad tumörvaccination med Flt3L-uttryckande B16-F10-melanom. Detta protokoll visar procedurerna, inklusive beredning av odlade tumörceller, tumörimplantation, cellbestrålning, mätning av tumörtillväxt, isolering av intratumorala immunceller och flödescytometrianalys.
Abstract
FMS-liknande tyrosinkinas 3-ligand (Flt3L) är ett hematopoetiskt cytokin som främjar överlevnad och differentiering av dendritiska celler (DC). Det har använts i tumörvacciner för att aktivera medfödd immunitet och förbättra antitumörsvar. Detta protokoll visar en terapeutisk modell med cellbaserat tumörvaccin bestående av Flt3L-uttryckande B16-F10 melanomceller tillsammans med fenotypisk och funktionell analys av immunceller i tumörmikromiljön (TME). Procedurer för odlad tumörcellsberedning, tumörimplantation, cellbestrålning, tumörstorleksmätning, intratumoral immuncellisolering och flödescytometrianalys beskrivs. Det övergripande målet med detta protokoll är att tillhandahålla en preklinisk solid tumörimmunterapimodell och en forskningsplattform för att studera förhållandet mellan tumörceller och infiltrerande immunceller. Immunterapiprotokollet som beskrivs här kan kombineras med andra terapeutiska modaliteter, såsom immunkontrollpunktsblockad (anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1-antikroppar) eller kemoterapi för att förbättra den cancerterapeutiska effekten av melanom.
Introduction
Cancerimmunterapi har erkänts som en lovande terapeutisk strategi baserad på dess mindre toxiska biverkningar och mer hållbara svar. Flera typer av immunterapier har utvecklats, inklusive onkolytiska virusterapier, cancervacciner, cytokinterapier, monoklonala antikroppar, adoptiv cellöverföring (CAR-T-celler eller CAR-NK) och immunkontrollpunktsblockad1.
För cancervacciner finns det olika former av terapeutiska vacciner, såsom helcellsbaserade vacciner, protein- eller peptidvacciner och RNA- eller DNA-vacciner. Vaccination är beroende av förmågan hos antigenpresenterande celler (APC) att bearbeta tumörantigener, inklusive tumörspecifika antigener, och presentera dem i immunogen form till T-celler. Dendritiska celler (DC) har varit kända för att vara de mest potenta APC: erna och tros spela en viktig roll i antitumörimmunitet 2,3. Dessa celler tar upp och bearbetar tumörantigener och migrerar sedan till de dränerande lymfkörtlarna (dLN) för att prima och aktivera tumörspecifika T-effektorceller (Teff) genom engagemang av T-cellreceptorn (TCR) och kostimulatoriska molekyler. Detta resulterar i differentiering och expansion av tumörspecifika cytotoxiska T-celler (CTL), som infiltrerar tumören och dödar tumörceller4. Följaktligen representerar aktivering och mognad av DC attraktiva strategier för att stimulera immunitet mot tumörantigener.
Flt3L är känt för att främja mognad och expansion av funktionellt mogna DCs som uttrycker MHC klass II, CD11c, DEC205 och CD86 proteiner5. Intratumoral, men inte intravenös, administrering av en adenovirusvektor som innehåller Flt3L-genen (Adv-Flt3L) har visat sig främja immunterapeutisk aktivitet mot orthrotopiska tumörer6. Flt3L har också använts i tumörcellsbaserade vacciner bestående av bestrålade B16-F10-celler som stabilt uttrycker retroviralt transducerad Flt3L som ett sätt att förbättra korspresentationen av tumörantigener av DC och därmed öka antitumörsvaren. Protokollet för B16-Flt3L tumörvaccination som beskrivs här är baserat på en studie publicerad av Dr James Allisons grupp7. I detta dokument rapporterade de att ett B16-Flt3L-vaccin i kombination med CTLA-4-blockad synergistiskt inducerade avstötningen av etablerat melanom, vilket resulterade i ökad överlevnad.
Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en preklinisk immunterapimodell för melanom. Här beskrivs detaljerade procedurer för hur man förbereder och implanterar tumörvacciner och hur man analyserar sammansättningen och funktionen av intratumorala immunceller från fast tumör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss som användes i studien upprätthölls och inrymdes i vivarium vid La Jolla Institute for Immunology (LJI) under specifika patogenfria förhållanden med kontrollerad temperatur och fuktighet. Djurförsök utfördes med 8-14 veckor gamla kvinnliga C57BL/6-möss enligt riktlinjer och protokoll godkända av LJI Animal Care Committee.
1. Beredning av odlade tumörceller för implantation
- Kultur B16-F10 melanomceller i Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) innehållande 10% värmeinaktiverad FBS, 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 1 mM MEM icke-essentiella aminosyror och 100 U / ml vardera av penicillin och streptomycin. Håll cellinjen vid 37 °C under 5 %CO2.
- Frö 1,5-2 x 106 B16-F10-celler i en 175T-kolv och odling i 2 dagar. Skörda celler när de är 75% -80% sammanflytande.
- Ta bort odlingsmediet och tvätta kolven en gång med PBS. Aspirera PBS och tillsätt 5 ml 0,25% trypsin-EDTA följt av hårt knackning av odlingskolvens kant.
- Tillsätt 15 ml odlingsmedium för att neutralisera trypsin-EDTA och häll innehållet i kolven i ett 50 ml centrifugrör. Tvätta diskytan med 10 ml PBS och häll i samma 50 ml rör.
- Centrifugera cellerna i 5 min vid 200 x g. Kassera supernatanten och bryt cellpelleten genom att fingra på rörets botten.
- Tillsätt kalla 10 ml PBS och rör försiktigt cellsuspensionen; Räkna sedan celler manuellt med hemocytometer. Håll cellerna på is före injektion.
2. Tumörimplantation
- Gasbedövning möss med 5% isofluran vid gasflödeshastighet på 1,0 L per min i dragskåpet. Ändra flödeshastigheten till underhållsdosen på 2% isofluran när mössen är helt bedövade. För detta protokoll utfördes bedövning av veterinären enligt riktlinjerna för institutionell djurvård och användning.
- Raka håret på mössens vänstra flank och sterilisera injektionsstället med alkoholservetter. Intradermalt (i.d.) implantat B16-F10 tumörceller vid 5 x 105 celler i 50 μL kall PBS i vänster flank med en 30 G nål.
OBS: Dosen av implanterade B16-F10-tumörceller kan behöva justeras i intervallet 0,5-5 x 105 celler för framgångsrik tumörutveckling. - Efter implantation mäta tumörlängden och bredden tre gånger i veckan med hjälp av en elektronisk digital bromsok. Beräkna tumörvolymen (mm3) med formeln:
Tumörvolym (mm3) = bredd2 × längd × 0,5
Behandla möss med tumörvaccin när tumörer har nått en storlek på ≥2 mm.
OBS: Tumörer kan vanligtvis mätas på dag 3 efter implantation av 5 x 105 tumörceller. Snabbare B16-F10 tumörtillväxthastighet observerades hos manliga C57BL/6, Rag1-/-, eller Rag2-/-γc-/-möss. En liknande observation beskrevs i andra studier8. Att hålla mössens kön konsekvent rekommenderas. Observera dock att NIH lägger tonvikten på kön som en viktig biologisk variabel i biomedicinsk forskning.
3. Vaccinberedning och injektion av Flt3L-uttryckande B16-F10 (B16-Flt3L) celler
- Behåll B16-Flt3L-cellerna i DMEM som innehåller 8% värmeinaktiverad FBS, 2 mM glutamin och 100 U / ml vardera penicillin och streptomycin vid 37 ° C under 5% CO2.
- Frö 1 x 106 B16-Flt3L-celler i en 175T-kolv och odling i 2 dagar. Skörda celler när de är 75%-80% sammanflytande enligt beskrivningen i steg 1.3 till 1.6 och suspendera i 1 ml kall PBS.
- Bestråla celler vid 150 Gy dos gammastrålar med hjälp av röntgenbestrålning med 160 kV och 25 mA parameterinställning. Räkna och kontrollera cellviabiliteten genom trypanblå färgning före injektion.
- Gasbedövning möss som beskrivits tidigare och sterilisera injektionsstället med alkoholservetter. Injicera mössen intradermalt med 1 x 10 6 bestrålade B16-Flt3L-celler i 50 μL kall PBS på samma flank som den ursprungliga tumörimplantationen, ~ 1 cm från platsen för den primära tumören på dag 3,6 och 9 efter den första cellimplantationen.
- Markera vaccininjektionsställena med en färgad penna för att skilja den från den primära tumören.
OBS: Om 0,5 x 105 B16-F10-celler initialt implanteras, rekommenderas att utföra vaccinbehandling på dag 8, 11 och 14.
4. Intratumoral immuncellisolering
- Offra möss med CO2 och cervikal dislokation i dragskåpet i slutet av experimentet (på dag 15 efter tumörimplantation; Figur 1).
- Ta bort tumören kirurgiskt med huden från varje mus och lägg den i 24-brunnsplatta med 1 ml 10% FBS / RPMI-1640 medium. Torka tumörerna med en pappershandduk innan du väger den.
- Skär tumörerna i små bitar. Tillsätt 2 ml digestionsbuffert (100 μg/ml TL-liberas och 200 μg/ml DNase I i RPMI-1640-mediet) och inkubera i 25 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt 10 ml 10% FBS / RPMI-1640-medium för att stoppa matsmältningen. Överför cellerna med en 25 ml serologisk pipett och använd kolven på en 1 ml spruta för att mala vävnad på en 40 μm cellsil.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C. Återsuspendera pelleten i 5 ml 40% densitetsgradientspecifikt medium i PBS, utspätt till 1x koncentration).
- Tillsätt cellsuspensionen långsamt ovanpå 5 ml 80% densitetsgradientspecifikt medium innehållande PBS. Centrifugera cellerna vid 325 x g med låg bromsinställning i 23 min vid rumstemperatur (RT).
- Efter centrifugering, samla försiktigt leukocytskiktet vid gränssnittet mellan 40% och 80% densitetsgradientspecifikt medium och passera det genom en 40 μm cellsil. Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Inkubera pelleten i 2 ml lysbuffert för röda blodkroppar (RBC) i 5 minuter vid RT. Efter inkubation, tillsätt 10 ml 10% FBS / RPMI-1640-medium för att släcka RBC-lysbufferten.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C. Återsuspendera cellerna i 0,5 ml 10% FBS / RPMI-1640-medium och räkna det totala antalet celler före användning för vidare analys.
OBS: Samla mjälten eller dLN som kontroller för gating strategi för immuncellundergrupper genom flödescytometrianalys. Följ cellisoleringsmetoden enligt beskrivningen ovan med följande ändringar: Använd kolven på en 1 ml spruta för att mala vävnad på ett 70 μm nätfilter. Tvätta vävnaden med 10% FBS / RPMI-1640 medium för att få encelliga suspensioner. Lyse RBC enligt beskrivningen.
5. Analys av flödescytometri
OBS: Celler som samlas in från leukocytskiktet innehåller immunceller och tumörceller. Två oberoende färgningspaneler rekommenderas.
- Ytfärgning
- Överför cellerna till en 96-brunns V-form-bottenplatta. Tvätta cellerna med PBS och färga dem med cellviabilitetsfärg (50-100 μL/brunn) i 15 min vid RT.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C. Färga ytmarkörerna med blandade antikroppar (detaljerad utspädning finns i materialtabellen) i FACS-buffert (1% FBS och 0,05% NaN3 i PBS) i 30 min på is (50-100 μL/ brunn).
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 min och tvätta dem med FACS-buffert två gånger.
- Fixera cellerna med cellfixeringsbuffert (50-100 μL/ brunn) i 35 min på is. Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 min och tvätta dem två gånger med FACS-buffert.
- Förvara proverna i FACS-buffert (150–200 μl/rör) vid 4 °C och skydda mot ljus. Skaffa proverna på en flödescytometer. För DC- och T-cellpopulation, följ grindstrategierna i figur 2B och figur 3A.
OBS: För färgning av myeloiska DCs rekommenderas inkubering av FC-blockerare (råtta antimus-CD16 / CD32) i 15 minuter på is före inkubation av ytantikroppar (steg 5.1.2).
- Cytokinanalys vid ex vivo-återstimulering
- Platta cellerna i komplett medium (RPMI-1640 kompletterat med 10% FBS, 10 mM HEPES, pH 7,2-7,6, 0,1 mM icke-essentiell aminosyra, 1 mM natriumpyruvat, 100 U / ml vardera penicillin och streptomycin, 50 μM 2-merkaptoetanol och 2 mM L-glutamin) och stimulera med 50 ng / ml PMA plus 1 μM jonomycin i närvaro av proteintransporthämmare i 4 timmar vid 37 ° C under 5% CO2.
- Utför ytfärgning för ytmarkörer enligt beskrivningen ovan i steg 5.1.
- Tillsätt permeabiliseringslösningen (50-100 μl/brunn) och inkubera i 5 min vid RT för intracellulär färgning. Inkubera cellerna med antikroppar specifika för cytokiner eller kärnproteiner i permeabiliseringslösning (50-100 μl/brunn) i 60 min på is eller över natten vid 4 °C.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g i 5 min och tvätta dem med FACS-buffert två gånger. Förvara proverna vid 4 °C och skydda mot ljus. Skaffa proverna på en flödescytometer.
OBS: Antikroppsutspädningen kan behöva justeras vid behov för att uppnå optimal färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En synlig svart prick av de implanterade B16-F10-cellerna observeras vanligtvis på hudytan ~ 3 dagar efter tumörimplantation. Möss behandlas med tumörvaccinet 3, 6 och 9 dagar efter att tumörknutan har nått en storlek på ≥2 mm. Vi observerade en signifikant minskning av tumörtillväxten hos vaccinerade mössgrupp ~ 2 veckor efter tumörimplantation (figur 1). I slutet av experimentet isolerade vi de intratumorala immuncellerna och analyserade deras antal och cellytmarköruttryck, samt cytokinproduktion efter en kort in vitro-stimulering enligt beskrivningen ovan. Celler som samlats in från leukocytskiktet innehåller fortfarande många tumörceller, vilket gör det något svårt att enkelt definiera lymfocytpopulationen. Därför rekommenderas användning av parallella splenocyter för korrekt gating av intratumorala immuncellsundergrupper i flödescytometrianalys (figur 2A). Här visas gatingstrategier för CD103 + CD11c + DC, CD8 +, CD4 + och Treg (figur 2B och figur 3A) tillsammans med kompensationsmatrisen (tabell 1 och tabell 2). Representativa uppgifter om förvärvade räkningar och frekvens för varje population finns också i figur 2C och figur 3B.
Intratumoral CD103 + CD11c + DCs, som representerar de mest potenta tumörantigenbehandlingarna och presenterar celler9,10, från vaccinerade möss visade ett signifikant förhöjt uttryck av den kostimulatoriska liganden CD86 (Figur 4). Vaccinerade möss visade också en ökning av tumörinfiltrerande CD8 + och CD4 + Foxp3 − T-celler (figur 5A), liksom i CD8 + GzmB + och IFN-γ + CTL (figur 5B). Dessa resultat tyder på att denna tumörvaccination främjar DC-mognad och inducerar starkare antitumörimmunitet.
Figur 1: Analys av tumörtillväxt i en terapeutisk modell av cellbaserat tumörvaccin med hjälp av Flt3L-uttryckande B16-F10-melanomceller. Kvinnliga C57BL/6-möss implanterades i.d. med B16-F10-celler (5 x 105) och injicerades med bestrålade (150 Gy) B16-Flt3L-celler (1 x 106) på en intilliggande plats på samma flank. Pilspetsarna anger tidpunkterna för vaccination. Kumulativa data från fyra experiment visas (Kontroll, n = 12; B16-Flt3L, n = 10). Data presenteras som medelvärdet ± SEM. Statistisk analys med tvåvägs upprepade mätningar ANOVA-test med Bonferroni efter test. *P < 0,05; ***P < 0,001. Denna siffra har modifierats från11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Gatingstrategier för lymfocyter och CD103 + CD11c + DCs. (A) Gating strategier för lymfocyter i mjälte och tumörprover. (B) Gating strategier för intratumoral CD103 + CD11c + DC i tumörprov. (C) Förvärvat antal och frekvens för varje population från en representativ ovaccinerad kontrollmus visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Gating-strategier för CD8+, CD4+ och Treg. (A) Gating strategier för T-celler i tumörprov. (B) Förvärvat antal och frekvens för varje population från en representativ ovaccinerad kontrollmus visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: CD86 ytuttryck på CD103+ intratumorala DCs. Uttrycket rapporteras som medianfluorescensintensitet (MFI) normaliserad till genomsnittlig MFI i kontrollgruppen (= 1). Kontroll, n = 8; B16-Flt3L, n = 10. Data presenteras som medelvärdet ± SEM. Statistisk analys med oparad Students t-test. **P < 0,01. Denna siffra har modifierats från11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Analys av intratumorala T-celler i kontroll och vaccinerade möss. (A) Uppräkning av tumörinfiltrerande CD8 + (vänster) och icke-Treg CD4 + (höger) per gram tumörvävnad. (B) Uppräkning av intratumorala GzmB + (vänster) och IFNγ + (höger) CD8 + T-celler. Kontroll, n = 11; B16-Flt3L, n = 10. Data presenteras som medelvärde ± SEM. Statistisk analys genom oparad Students t-test. *P < 0,05; **P < 0,01. Denna siffra har modifierats från11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Kompensationsmatris i figur 2. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Kompensationsmatris i figur 3. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här är baserat på studien av Allisons grupp. De visade att kombinationen av B16-Flt3L-vaccin med CTLA-4-blockad visade en synergistisk effekt på överlevnad och tumörtillväxt, medan ingen minskning av tumörtillväxt sågs hos möss som fick B16-Flt3L-vaccinet eller anti-CTLA-4-antikroppsbehandling ensam7. Nya studier har avslöjat en ny Treg-inneboende CTLA4-PKCη-signalväg som spelar en viktig obligatorisk roll för att reglera den kontaktberoende undertryckande aktiviteten hos Treg11. Både B16-Flt3L-vaccinbehandling ensam eller vaccinkombination med Treg-specifik PKCη-deletion minskade signifikant tumörtillväxten när högre antal (0,5-5 x 105) B16-F10-melanomceller än i Allisons studie (1 x 104) celler implanterades. Subtila skillnader i källan till melanomceller eller möss kan stå för denna skillnad. Därför rekommenderas titrering av antalet implanterade tumörceller. Ökad infiltration av CD8 + T-celler i den primära tumören observerades på liknande sätt i den tidigare studien7. Dessutom observerade vi ökat CD86-uttryck på intratumoral CD103 + CD11c + DCs, vilket sannolikt står för en starkare aktivering och expansion av tumörinfiltrerande CD8 + CTL.
Detta protokoll, som använder ett cellbaserat tumörvaccin som uttrycker Flt3L, är bekvämt och enkelt att använda och fungerar som en pålitlig modell för att studera intratumorala immuncellinfiltrat, inklusive DC. Till exempel krävs PKCη-signalering för den kontaktberoende undertryckande aktiviteten hos Treg. Således visade Prkch−/− Treg högre konjugeringseffektivitet med APC: er i ett Treg -DC in vitro-cokultursystem, vilket indikerar en defekt i Prkch-/− Tregs förmåga att bryta kontakten och koppla ur bifogade DCs12. B16-Flt3L-vaccination rekryterar sannolikt mer mogna DC som presenterar tumörspecifika antigener mer effektivt och därmed kommer det sannolikt att underlätta observation av interaktionen mellan tumörinfiltrerande Treg och DC genom levande cellavbildning.
Att hålla ett tillräckligt avstånd mellan den primära tumören och tumörvaccinet är ett viktigt inslag i detta protokoll. Denna fysiska separation är avgörande för att ge utrymme för tillväxt av den primära tumören och undvika potentiell fusion mellan de två tumörimplantaten. Alternativt kan tumörvaccinet implanteras i motsatt flank i förhållande till den primära tumören, eftersom detta också rapporterades hämma tumörtillväxt7. En begränsning i studien är avsaknaden av en kommersiell källa till B16-Flt3L-cellinje, men samma koncept kan tillämpas på andra tumörtyper, till exempel TRAMP-C2 prostata adenokarcinom7.
Även om protokollet som beskrivs här använder B16-F10 melanomceller som en tumörmodell, kan de underliggande principerna anpassas och modifieras vid behov för att upprätta immunterapeutiska modeller för andra solida tumörer. Dessutom kan vaccinationsprotokollet vi använde lätt kombineras med andra terapeutiska metoder, t.ex. CTLA-4- eller PD-1-baserad kontrollpunktsblockad, för att uppnå additiva eller synergistiska effekter som potentiellt kan resultera i mer potent antitumörimmunitet och ökad överlevnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Stephen Schönberger för att ha tillhandahållit B16-Flt3L-celler och personalen på LJI-djur- och flödescytometrianläggningarna för utmärkt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% heat-inactivated FBS | Omega Scientific | FB-02 | Lot# 209018 |
| 30G needle | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 well V-shape-bottom plate | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| B16 cell line expressing Fms-like tyrosine kinase 3 ligand (B16-Flt3L) | Gift of Dr. Stephen Schoenberger, LJI | Flt3L cDNAs were cloned into the pMG-Lyt2 retroviral vector, as in refernce 5, Supplemental Figure 1 | |
| B16-F10 cell lines | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Cytofix fixation buffer | BD Biosciences | BDB554655 | Cell fixation buffer (4.2% PFA) |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization Solution Kit |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10013CV | |
| Electronic digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo software | Tree Star | Flow cytometer data analysis | |
| GolgiStop (protein transport inhibitor) | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 dilution |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II cytometers | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| MEM nonessential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| penicillin and streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | density gradient specific medium |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max liquid | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 medium | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X-ray Irradiator | Rad Source Technologies | ||
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile cell strainer 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua fixable viability kit | BioLegend | 423101 | |
| Antibodies | |||
| Anti-mCD45 | BioLegend | 103135 | Clone: 30-F11 Fluorophore: BV570 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD3ε | BioLegend | 100327 | Clone: 145-2C11 Fluorophore: PerCP-Cy5.5 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD8 | BioLegend | 100730 100724 |
Clone: 53-6.7 Fluorophore: Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD4 | BioLegend | 100414 | Clone: GK1.5 Fluorophore: APC-Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mFoxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | Clone: FJK-16s Fluorophore: FITC Dilution: 1:100 |
| Anti-m/hGzmB | BioLegend | 372208 | Clone: QA16A02 Fluorophore: PE Dilution: 1:100 |
| Anti-mIFNg | BioLegend | 505826 | Clone: XMG1.2 Fluorophore: PE-Cy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD19 | BioLegend | 115543 | Clone: 6D5 Fluorophore: BV785 Dilution: 1:100 |
| Anti-mGr1 | BioLegend | 108423 | Clone: RB6-8C5 Fluorophore: APC/Cy7 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD11b | BioLegend | 101223 | Clone: M1/70 Fluorophore: Pacific blue Dilution: 1:100 |
| Anti-mF4/80 | BioLegend | 123114 | Clone: BM8 Fluorophore: PECy7 Dilution: 1:100 |
| Anti-mCD11c | BioLegend | 117328 | Clone: N418 Fluorophore: PerCP Cy5.5 Dilution: 1:100 |
| Anti-mMHCII | BioLegend | 107622 | Clone: M5/114.15.2 Fluorophore: AF700 Dilution: 1:400 |
| Anti-mCD103 | BioLegend | 121410 | Clone: 2E7 Fluorophore: Alexa Fluor 647 Dilution: 1:200 |
| Anti-mCD86 | BioLegend | 105007 | Clone: GL-1 Fluorophore: PE Dilution: 1:200 |
| FC-blocker (Rat anti-mouse CD16/CD32) | BD Biosciences | 553141 | Clone: 2.4G2 Dilution: 1:200 |
References
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
- Martinez-Lostao, L., Anel, A., Pardo, J. How do cytotoxic lymphocytes kill cancer cells. Clinical Cancer Research. 21 (22), 5047-5056 (2015).
- Maraskovsky, E., et al. Dramatic increase in the numbers of functionally mature dendritic cells in Flt3 ligand-treated mice: multiple dendritic cell subpopulations identified. Journal of Experimental Medicine. 184 (5), 1953-1962 (1996).
- Talmadge, J. E., et al. Intratumoral, injection of adenoviral Flt3 ligand has therapeutic activity in association with increased intratumoral levels of T cells but not dendritic cells. Blood. 104 (11), 5280 (2004).
- Curran, M. A., Allison, J. P. Tumor vaccines expressing flt3 ligand synergize with ctla-4 blockade to reject preimplanted tumors. American Association for Cancer Research. 69 (19), 7747-7755 (2009).
- Simon, S. R., Ershler, W. B. Hormonal influences on growth of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 74 (5), 1085-1088 (1985).
- Broz, M. L., et al. Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell. 26 (6), 938 (2014).
- Salmon, H., et al. Expansion and activation of CD103(+) dendritic cell progenitors at the tumor site enhances tumor responses to therapeutic PD-L1 and BRAF inhibition. Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).
- Liu, H. Y., et al. Leveraging the Treg-intrinsic CTLA4-PKCeta signaling pathway for cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy Cancer. 9 (9), 002792 (2021).
- Kong, K. F., et al. Protein kinase C-eta controls CTLA-4-mediated regulatory T cell function. Nature Immunology. 15 (5), 465-472 (2014).
