Avlägsnande av insektspuparium: En metod för pupalutredning

Overview

Denna artikel beskriver en teknik för att ta bort en insekts puparium samtidigt som den inre poppan är intakt och därför lämplig för vidare undersökning. Exempelprotokollet visar proceduren med Drosophila guttifera; Denna teknik är dock tillämplig på andra Drosophila arter.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Fukutomi et al., Metoder för iscensättning av pupalperioder och mätning av vingpigmentering av Drosophila guttifera, J. Vis. Exp. (2018).

1. Ta bort puparium

ANMÄRKNING Pupae av Drosophila täcks av en struktur som kallas puparium. En insekt av Muscomorpha (flugor) kastar inte sin larv nagelband vid poppning; istället härdar det nagelbandet efter apolys och använder det som ett skyddande lock av poppan, pupariet. En pupa som bor inuti ett puparium har en sann pupal nagelband, som är mycket mjuk och bräcklig. Innan apolys sker runt P4(ii) fästs epitel och puparium tillsammans, och därför är det mycket svårt att ta bort puparium utan skador. Efter P5 är avlägsnande av puparium mödosamt, men användbart för morfologisk observation och definition av pupal steg. Processen utförs enligt följande.

1. Fäst en bit dubbelsidig tejp på en pappershandduk.
2. Placera en poppa på den dubbelsidiga tejp ventrala sidan uppåt (Figur 1A).
3. Placera utrymmet mellan pupariumens främre sida och den inre poppan. Ta tag i och ta bort pupariumet runt detta mellanrum med tång och exponera den främre sidan av poppans huvud.
4. Sätt in spetsen på en tång genom att flytta den parallellt med den främre bakre axeln. Lyft spetsen på tången för att lokalt bryta pupariumet. Upprepa denna åtgärd tills brotten når den bakre delen av pupariumet. Se till att det också bildas ett mellanrum mellan puparium- och pupalbenen och bryt pupariets ventrala sida och minimera skadorna på den inre poppen (figur 1B).
5. Efter att ha brutit pupariumet så mycket som möjligt, ta ut poppan med en fin pensel (#5/0) (Figur 1C).
6. Placera poppan på ett mjukpapper som har fuktats med ddH₂O och placerats i en petriskål av plast (diameter 60 mm x höjd 15 mm). Ta fotografier så snart som möjligt eftersom den exponerade poppan är sårbar och lätt blir torr.
    

Representative Results

Figur 1. Illustration av att ta bort puparium. A) Placera en pupa ventral sida upp på en bit dubbelsidig tejp. Ta bort den främre delen av pupariumet. B) Bryt pupariumet med tång från ventralsidan. (C) Efter att ha brutit pupariumet, ta ut poppan med en pensel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila guttifera	The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego	15130-1971.10	Drosophila guttifera,  a fruit fly species used in this article
NICETACK double sided tape	Nichiban	NW-15SF	Double sided tape,   for removing puparium
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20	Forceps,  for removing puparium
Van Gogh VISUAL Paint brush	Talens Japan	GWVR-#5/0	Paint brush,  for removing puparium
Stereomicroscope	Olympus	SZX16	Stereomicroscope,  for morphological observation
Digital camera	Olympus	DSE-330-A	Digital camera,  for imaging
Falcon standard tissue culture dish	Corning	353002	Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm)