Introduction
רוב זיהומי HIV החדשים ברחבי העולם להתעורר באמצעות שידור הטרוסקסואלים, עם נשים המייצגות 47% מזיהומים חדשים ב2011 (1 UNAIDS). הבנה בדרכי המין הנשית (FGT), אחד מפורטלי הכניסה העיקריים ל-HIV ופתוגנים מועברים במגע מיני אחרים, הוא בעל חשיבות גבוהה בדרך למציאת אסטרטגיות יעילה למניעת זיהום. תגובה חיסונית ברירית איברי המין הם בבירור ייחודיות ושונים מאלו שנמדדו בדם היקפי 2. עם זאת, ידע הנוכחי של הדינמיקה החיסונית בFGT מוגבל במקרה הטוב. עד כה, מחקרים של הסביבה החיסונית ברירית התמקדו בעיקר ברקמות הקשורים בטן הלימפה (גאלט), שבו התברר שיש לי האירועים המוקדמים ברקמות הריריות בעקבות זיהום השפעה חזקה על התקדמות מחלה לאחר 3,4. איסוף דגימות מרירית איברי המין מהווה אתגר גדול ולפחות בחלקו אחראי לאקk הבנה של אימונולוגיה של FGT. פתרון החידה מהדינמיקה החיסונית בין המארח והפתוגן בהקשר של הסביבה ברורה שהיא FGT מחייב שיטות יעילה לאיסוף וניתוח של דגימות מאזור זה.
FGT מחולק לשני חלקים: מערכת הרבייה העליונה הכוללת חצוצרות, רירית הרחם וendocervix, ודרכים נמוכות יותר המכילה את ectocervix והנרתיק (נסקר על ידי Kaushic אח' 5). זה עדיין לא ברור מה תרומתו היחסית של אתרים השונים אלה היא הידבקות ב-HIV, אבל הוא האמין כי שני האתרים יכולים לתרום לכניסת ה-HIV 6. תאי T מייצגים 40-50% מleucocytes בקטעים העליונים ותחתונים הרבייה, ואילו מקרופאגים מהווים כ 10% (בדיקה ב-רודריגז גרסיה ואח' 2). ניתן לאתר תאי T בנרתיק, צוואר הרחם, ורירית הרחם. המקרופאגים הם חזקים יותר localized ברירית הרחם ורקמת חיבור myometrial מצוואר הרחם, למרות שהם יכולים להיות מזוהים בשתי הרקמות. לבסוף, תאים הדנדריטים plasmacytoid (PDC) ותאים לנגרהנס יכולים גם להתגלות ברקמות FGT. הפנוטיפ והפרופורציות של אוכלוסיות חיסוניים והרגישות שלהם להידבקות ב-HIV עשויים להשתנות חשוב פי מחזורים הורמונליים, השימוש באמצעי מניעה הורמונליים, וגינוזיס חיידקים או פעילות מינית 5,7-9.
מגוון שיטות פותחו כדי ללמוד את האוכלוסיות וסביבה חיסוניים של FGT. ביופסיה צוואר הרחם, צוואר הרחם וcytobrushes lavages הצרויקו (CVL) 10-12 הם נפוץ ביותר על פני הספרות. CVL אוסף ידי שטיפת PBS הוא השיטה הפשוטה ומאפשר הלימוד של חלבוני ויסות מערכת החיסון, אך תוצאות בתשואה נמוכה מאוד של תאים, ולכן הוא אינו מתאים ללימוד אוכלוסיות תאים חיסוניים של FGT 13. דגימות CVL הן, לעומת זאת, very שימושי להערכת הסביבה החיסונית של FGT ידי מדידת הביטוי של ציטוקינים שונים, כמוקינים או גורמים מיקרוביאלית באמצעות שיטות כגון ELISA, מערך חרוז ציטוקינים 14 או ספקטרומטריית מסת 15,16. אפיון של תדרים חיסוניים תא, פנוטיפים ופונקציות יכול להיות מושגת על ידי איסוף תאים חד גרעיניים בצוואר הרחם (CMC) על ידי cytobrush צוואר הרחם או על ידי דגימת ביופסיה בצוואר הרחם.
דגימת ביופסיה צוואר הרחם היא שיטה פולשנית המגבירה את אי הנוחות וסיכון לדימום ולוקח 2-11 ימים כדי להחלים לאחר ההליך בהתאם למצב החיסונית של האישה 12. מצד השני, cytobrushes צוואר הרחם, למרות התשואה נמוכה יותר של תאים שנאספו, היא שיטה פחות פולשנית ונוחה יותר לאיסוף תאים חיסוניים מFGT. שני שיטות יכולות להגיע לאותה תשואה של leucocytes CD45 +, אבל שתי cytobrushes צוואר הרחם רציף נחוצות כדי להשיג את אותה הכמות של תאים הכיל in ביופסיה אחת 13. יחד עם זאת, דגימת cytobrush עדיין מספקת מספר מקובל של תאים (כ -5,000 CD45 + תאים / cytobrush) עבור vivo phenotyping נוסף לשעבר על ידי cytometry זרימה 14. כמו כן, אפיון פונקציונלי יכול להתבצע על דגימות אלה, כגירוי וזרימת cytometry תאית או qPCR בוצעו באמצעות CMCs נגזר cytobrush לזהות תגובות HIV-ספציפיות חיסוניים 17 או ה תא קיטוב 18. התרחבות של אוכלוסיית תאי T עשויה גם להקל על מחקרים פונקציונליים עם CMCs 19.
חשוב לציין כי ביופסיות וcytobrushes לטעום מנות שונות של FGT. ביופסיות נגזרות מהחלק העליון של האפיתל ו stroma של ectocervix 12,13, בעוד cytobrushes צוואר הרחם לדגום את מערכת ההפעלה בצוואר הרחם, איסוף תאים שמקורם האפיתל של endocervix ומן הסתם אזור טרנספורמציה. דגימות Cytobrush לכן לדגום מחדשגיון מורכב משכבה יחידה של אפיתל עמודים, בעוד ביופסיות, כוללות אזור בשורה של אפיתל מרובדת קשקש 5. כתוצאה מכך, האופי של אוכלוסיות יקוציט שנאספו על ידי ביופסיה וcytobrush צוואר הרחם שונה. ביופסיות לאסוף שיעור גבוה יותר של תאי CD3 + T, ואילו cytobrushes לגרום לאוסף של שיעור גבוה יותר של מונוציטים CD14 + / מקרופאגים 13.
לומד אימונולוגיה של FGT כבר עניין לשנים רבות ו20-22 שצברנו מומחיות רבה בחקר CMCs נגזר cytobrush. המחקרים שלנו מתמקדים בעיקר בלימוד seronegative HIV-נגוע, נגוע ונחשף ב-HIV (HESN) עובדי מין נשיים מניירובי, קניה. HIV משכפל מעדיף בתאי T מופעלים 23 ונמוכות מספרים של תאים מופעלים שיכול להיות ממוקד על ידי HIV בFGT יכולים לתרום להגנה מפני רכישת ה-HIV. בקנה אחד עם השערה זו, כמה Studies תיאר הפעלה חיסונית נמוך יותר בקרב עובדי תעשיית מין HESN שנמצאים בחשיפה גבוהה לאיידס עדיין יישאר נגוע 24,25, והפנוטיפ שקט זה נצפה גם בFGT 14. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לעיבוד והערכת הפעלת תאי T בדגימות CMC נגזרות מcytobrushes צוואר הרחם על ידי vivo לשעבר cytometry זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שמירה על אתיקה: לוחות האתיקה המחקריות של שניהם מאוניברסיטת מניטובה וקניאטה הלאומית בית חולים / אוניברסיטת ניירובי אישרו מחקר זה וכתב הסכמה מהדעת התקבלה מכל משתתפי המחקר.
1. הכנת מדיה וCMC אוסף צינורות
- הכן ופר פוספט פתרון (PBS) (137.93 mM NaCl, 2.67 מ"מ KCl, 8.1 מ"מ Na 2 HPO 4, 1.47 מ"מ KH 2 PO 4). החיטוי על סטריליות. זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
- טרום aliquot 5 מיליליטר PBS לתוך צינור 50 מיליליטר בז (אחד לדגימה שנאסף) ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד למועד איסוף דגימה.
- תווית 2-4 cryovials או 1.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות לדגימה לאסוף שטיפה לאחסון.
- הכן תקשורת תרבית תאים: RPMI 1640 1% פניצילין / סטרפטומיצין / amphotericin B + (ריכוז סופי 100 יחידות / מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר ו250 ng / ml, respectivאיליי, ללא FCS / FBS הוסיף.
2. איסוף דגימות Cytobrush
איסוף דגימות cytobrush הוא הליך פולשני שחייבת להתבצע על ידי MD או גינקולוג מיומנים.
- איסוף תאי צוואר הרחם מונונוקלארים (CMC) באמצעות שני cytobrush ומגרד עץ או פלסטיק. לאסוף CMC מהמשתתף בבדיקת ספקולום ידי הוספת המגרד ומסתובב סביב מערכת ההפעלה צוואר הרחם (איור 1). הכנס את cytobrush לתוך מערכת ההפעלה האנדוצרוויקאלית, לסובב 360 °, ואת המקום באופן מיידי שני cytobrush והמגרד לתוך הצינור הבז 50 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של PBS.
- שמור על דגימות קרח / על 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד. כדי לשמור על כדאיות תא, דוגמאות תהליך תוך 2 שעות של אוסף.
- במידת האפשר, לאסוף דגימות דם מתאימים בvacutainers הפרין העליון הירוק לתא הדם היקפי mononuclear בידוד (PBMC) לשמש כמשווה / שליטה לניתוח CMC.
3. בידוד של CMCs
לבצע עיבוד דגימה במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2, בתוך ארון בטיחות ביולוגי סטרילי עם כפפות כפולות.
- במהלך איסוף, דגימות CMC יכולות להיות מזוהמות בדם. תכלול דגימות עם זיהום דם גלוי מהמחקר כדי למנוע הכללה של בלבול PBMC במדגם הסופי. בשל המספר הנמוך של לימפוציטים שבודדו דגימות CMC, זיהום דם קטין יכול בקלות להכריע את מרכיב הלימפוציטים CMC.
- צינורות בז ורטקס המכילים את שני cytobrush ומגרד ל45 שניות לנתק תאים מהמברשות. דוגמאות עשויות להיות קצף בתהליך זה; זה נורמלי.
- השתמש cytobrush לגרד כל חומר שנותר מן המגרד, וזורקים את המגרד לפתרון אקונומיקה. לאסוף את כל תאים שנותרו צמודים למברשת / המגרד, השתמש כפפה טרי לסחוט המגרד בין האגודל לאצבע.להחליק במורד המברשת, המאפשר לתאים וPBS להיות שנאספו באותו צינור מיליליטר 50. מחק את cytobrush לפתרון אקונומיקה, וזורקים את הכפפה.
חשוב: השתמש בכפפות חדשות עבור כל דגימה. - להתאים מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר לצינור בז טרי 50 מיליליטר. בעזרת פיפטה העברה, לאסוף את ההשעיה PBS התאים מצינור המדגם ולסנן דרך המסננת לתוך הצינור הטרי.
- הוסף 5 מיליליטר של RPMI 1640 לצינור המדגם המקורי. באמצעות פיפטה ההעברה, לשטוף את הצדדים של צינור המדגם עם RPMI, ולהעביר דרך המסנן לצינור האיסוף החדש. שטוף את החלק התחתון של מסנן הניילון עם RPMI גם כן.
- צנטריפוגה הדגימות 10 דקות ב 514 x גרם. זה חיוני כדי להשאיר את בלם צנטריפוגות מבמהלך שלב זה, על מנת למנוע דחיקה של גלולה CMC.
- בעדינות להסיר את supernatant מהצינור, נזהר שלא להפריע גלולה. גודל גלולה יהיה משתנה מאוד; בכךלי דוגמאות, גלולה היא די גדולה בשל נוכחותם של מספר הגדול של תאי אפיתל, ואילו במקרים אחרים, גלולה היא בקושי נראית ושקופה מאוד.
- Resuspend את הכדור על ידי תסיסה עדינה של הצינור הבז. הוסף 5 מיליליטר של PBS לשטוף את המדגם.
- שוב צנטריפוגות במשך 10 דקות ב XG 514 עם בלם לא צנטריפוגות.
- להשליך בזהירות את supernatant מחדש להשעות גלולה כאמור לעיל. התאים מוכנים או הקפאה (באמצעות פרוטוקול הקפאת PBMC), גירוי או cytometry זרימת phenotyping.
4. מכתים משטח CMC וזרימת cytometry
- Resuspend את הכדור מהצעד 3.10 בחסימת פתרון 100 μl ולהעביר או לתוך צלחת 96 היטב או צינור FACS. פתרון החסימה (לחסום קולטני Fcγ) מתכון הוא כדלקמן: IgG עכבר 1.8 μl (ריכוז סופי 0.2 מיקרוגרם / μl), 5 FBS μl ו93.2 μl FACS לשטוף (PBS 2% FBS).צביעה יכולה להתבצע בצלחת גם אם 96 גדלי גלולה קטנים מספיק, אבל ייתכן שתצטרך להתבצע בצינורות FACS אם כדורים הם גדולים באופן שיגרתי. חשוב לכיל נוגדנים בהתאם.
- חסום את הדגימות עבור 10 דקות ב/ קרח ב 4 ° C.
- לשטוף את התאים עם FACS של שטפי (FBS +2% PBS) 100 μl בצלחות 96 היטב, או 500 μl בצינורות FACS. צנטריפוגה ב XG 600 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם על נמוך (או כבוי, אם הגדרת בלם נמוכה אינה זמינה).
- הסר את supernatant מחדש להשעות את התא גלולה על ידי תסיסה. תוסיף כתם כדאיות (צבע כדאיות בשידור חי המלח ניתן לתקן). הכן את צבע כדאיות פי הוראות יצרן. זה ייתכן שיהיה צורך טיטרציה לשימוש בכל התקנת המעבדה / cytometer. דגירה במשך 30 דקות בחושך ב 4 ° C.
- לשטוף את התאים של PBS 100 μl/500 μl (לצינורות צלחת / FACS 96 היטב). צנטריפוגה ב XG 600 עבור 10 דקות עם נמוך / לא בלם. הסר supernatant ותאי resuspend.
- דגירה התאים עם הקוקטייל של נוגדני סמן פני השטח, בהיקף כולל של 100 μl. חשוב: ייעל ולכייל כל תזרים cytometry פנל לפני לדגום מכתים. דגירה תאים עבור 30 דקות בחושך ב 4 ° C.
- חזור על שלב 4.5. אם מכתים בצלחת, תאי העברה 96 היטב לצינור FACS ולדלל את נפח סופי של μl 750 של FACS לשטוף מכיל paraformaldehyde 1% (PFA) (או CytoFix, בדילול מלא 1 ב 4). המשך לרכישת נתונים על cytometer זרימה.
5. איסוף והכנה של צוואר הרחם בנרתיק שטיפה (CVL)
- לפני cytobrush דגימה, להשתמש במזרק כדי לשטוף endocervix עם 2 מיליליטר של PBS סטרילי ולשאוב את שטיפה מfornix האחורי.
- לאסוף את דגימת שטיפת aspirated לתוך צינור בז 15 מיליליטר ולשמור על קרח / על 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד.
- צנטריפוגה מדגם ב XG 400 במשך 7 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר.
- שיתוףllect supernatant, aliquot המדגם לתוך 1 מיליליטר או 500 aliquots μl, ולאחסן ב -70 ° C. Aliquots יכולים להיות מופשרים לELISA או ניתוח מערך חרוז של חלבוני CVL, אך להימנע מהקפאה / הפשרה מחזורים מרובים.
- אם תרצה, resuspend את הכדור של פסולת הסלולר בRNA מאוחר יותר כדי למדוד ביטוי RNA על ידי ביצוע הפרוטוקול של היצרן.
6. רכישת נתונים
- להכין סט של צינורות פיצוי התואם את פנל הנוגדנים. הפעל את צינורות הפיצוי להתאים חפיפה ספקטרלית. הפעל את הדגימות על כל זרימת ססגוניות cytometer שמוגדר עבור הנוגדנים מצומדות fluorochrome בשימוש בלוח.
- לרכוש מדגם PBMC הראשון כדי להתאים קדימה פיזור (FSC) וצד פיזור מתח (SSC) על מנת לזהות את אוכלוסיית הלימפוציטים. נסה לשמור אותם ב100 על כל ציר בקנה מידה ליניארי. פועל שליטת PBMC יקל באופן משמעותי כדי למצוא את אוכלוסיית הלימפוציטים CMC.
- סף FSC עבור דגימות CMC ייתכן שיהיה הצורך מוגבר בהשוואה לדגימות PBMC בשל למרוח את ציר SSC בערכי FSC נמוכים.
- מערבולת בצינור אחד לפני הרכישה. לרכוש את כל הצינור על מנת למקסם את מספר אירועי שער הלימפוציטים שנאספו. לנטר את המכונה בזהירות כדי למנוע סתימה.
- לייצא את הנתונים לתכנית ניתוח התזרים cytometric כגון FlowJo.
7. Gating אסטרטגיה
- בחר צד פיזור קדימה גבוה (FSC-H) / אזור קדימה פיזור הצד (FSC-) כדי לקבוע את אוכלוסיית הגופייה.
- בחר זמן לעומת סמן פלואורסצנטי (כמו בדוגמא של FITC) כדי לשלוט על האיכות של הרכישה. שינוי בקצב זרימה עשוי להציג את הממצאים בנתונים. תכלול כל אזור שמראה פער בקצב זרימה.
- לזהות את אוכלוסיית הלימפוציטים בעלילת SSC-A/FSC-A. השתמש בשליטת PBMC כדי להקל על זיהוי. שים לב שאוכלוסיית הלימפוציטים CMC לא יכולה להיות ברורה כמו שליטת PBMC. </ Li>
- השער בSSC-A/viability לצבוע להוציא תאים מתים מהתאים חיים. תאים מתים שאינו יכולים לשלב באופן ספציפי הנוגדנים, אשר יציגו ממצאים.
- שער בSSC-A/CD3 לזהות את אוכלוסיית תאי T. מהשער הזה, לזהות את האוכלוסיות מסוג CD4 + ו CD8 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרימת multiparameter cytometry הוא כלי רב עוצמה כדי לנתח את פנוטיפים ופונקציות של תת תא ברקמות uncharacterized בעבר. ניתוח של דגימות CMC יכול להניב מידע על שני הלימפוציטים ואוכלוסיות מונוציטים עם אסטרטגיות gating מתאימות.
אסטרטגית gating נציג CMC, בהשוואה לפרופיל PBMC מתאים, מוצגת באיור 2. FSC-לעומת עלילת FSC-H מאפשר ההרחקה של כפילויות תא, אשר נפוצו מאוד בדגימות CMC לעומת PBMC, גם לאחר הסינון (איור 2 א). בקרת איכות כוללת את ההסרה של זרימת הנפקות של gating על זמן, שבו שינויים בקצב זרימה או חפצים בשל גושי מדגם יכולים להיות מזוהים (איור 2) בקלות. זיהוי של האוכלוסיות לימפוציטים / מונוציטים הוא יחסית דומה בשני PBMC ודגימות CMC (איור 2). הרחקה של תאים מתים בצבע כדאיות מונעת הכללהתאים של אפופטוטיים שאינם דווקא לקחו את conjugates נוגדן פלואורסצנטי. כדאיות היא נמוכה יותר בהשוואה לדגימות CMC PBMC, ויכולה להיות מאוד משתנה ממדגם למדגם (איור 2).
ניתוח זה יתמקד בPhenotyping אוכלוסיית הלימפוציטים T, אך דגימות CMC מכילות גם מונוציטים. לאחר gating על אוכלוסיית מונוציטים, תאים מגודרות המבוסס על צבע כדאיות וערוץ מזבלה (איור 3 א). ערוץ המזבלה מכיל נוגדנים נגד CD56, CD3 ו CD19, וgating על תאי ערוץ שלילי מזבלה יהיה לחסל כל זיהום הלימפוציטים באוכלוסיית מונוציטים. אז יכולים להיות מזוהים תאים בהתבסס על הביטוי של סמנים כגון CD16 וCD11c. אוכלוסיית הלימפוציטים CD3 + מצטמצמת בדרך כלל באופן יחסי בין CMC לעומת PBMC (איור 3 ב, טבלת 1). השיעור הגבוה של תאי אפיתל, גרנולוציטים וCD3 + CD45 + leucocytes שאינו כלולים בדגימות CMC דominates על אוכלוסיית תאי T. תאים מסוג CD4 + T (חציון: 55.30%, IQR: 50.53% -68.18%) ותאי CD8 + T (חציון: 25.60%, IQR: 21.50% -33.80%) נמצאים ביחס נמוך יותר (קרוב יותר 2:1 בין CMC) בהשוואה ליחס 5:01 נצפה בקרב דגימות PBMC בריאים מעוקבת עובד המין המסחרית בקניה (איור 3 ג, טבלת 1). כמו בדם, זיהום HIV משפיע על הפרופורציות של CD4 + ותאי CD8 + T בין CMC, ירידה מסוג CD4 +: יחס CD8 + ל0.7 (חציון: 0.7, IQR: .31-2.45) (איור 3 ג, טבלת 1). עם זאת, אין זה נדיר לצפות בשיעור גבוה יותר של תאי CD8 + T בין אוכלוסיות CMC מאנשים בריאים (איור 3 ג). מעניין, הרחיב-CD4-CD8 (כפול שלילי, DN) T אוכלוסיית תא ביחס לתדירות תא PBMC DN T ניתן להבחין בין דגימות CMC רבות של אנשים הנישאים HIV (טבלת 1). תוצאות אלו דומות לאלו שהושגו עבור דגימות עורלה 26, althoאיכס תאים אלה מתאפיינים בצורה גרועה.
סמנים פנוטיפי תא T טיפוסיים לכמת בקלות בין CMCs אך עשוי להיות שונה מPBMCs; איור 4 מדגים את זיהוי של אוכלוסייה + CD161 + + (MAIT) CD8 שהוא נבדל בPBMCs אבל כמעט נעדר בCMCs (איור 4 א). ביטוי של סמני הפעלת CD69 וHLA DR, CCR5 סמן הגירה או סמן תשישות PD-1 יכול להיות מזוהה על CD4 + או CD8 + אוכלוסיות (איור 4) באופן ברור.
כימות של הריכוז של ציטוקינים / כמוקינים בCVL ניתן לנתח במקביל לצביעת CMC. זה מאפשר למתאם בין סביבת CVL ציטוקינים (פרו דלקתי לעומת immunoregulatory) ואת הפנוטיפ של CMCs. גם נתונים אלה יכולים לשמש כדי לקבוע אם התדירות של ביטוי הקולטן chemokine על CMCs קשורה לביטוי היחסי של כל אחד פלזמה או כמוקינים CVL 14. טבלה 2 </ Strong> מציין את הריכוז הממוצע של analytes ציטוקינים וchemokine בCVL שנאסף מנשות בריאות וassayed ידי ערכות מערך חרוז ציטוקינים Milliplex.
איור 1. אנטומיה של מערכת הרבייה הנשית. א) להציג חתך של דרכי הנשית רבייה, המציגה את מערכת היחסים של הנרתיק למערכת ההפעלה החיצונית של צוואר הרחם, תעלת צוואר הרחם וחלל רחם. ב) להציג זווית קדמית של צוואר הרחם, המציג את מערכת ההפעלה החיצונית, וקדמי והאחורי fornix אזורים בשעת 12:00 ו6:00, בהתאמה. לשכפל באישור מReusch et 27 אל. מגרד צוואר הרחם הוא הסתובב סביב מערכת ההפעלה צוואר הרחם לאסוף CMC, בעוד cytobrush מוכנס לתוך תעלת צוואר הרחם ולסובב כדי לאסוף CMC נוסף. lavages נרתיק צוואר הרחם (CVL)נאספים על ידי שטיפת endocervix עם PBS ואיסופו מfornix האחורי.
איור 2. Gating ובקרת איכות של דגימות CMC. א) זיהוי של גופיות על ידי FSC-לעומת עלילת FSC-H מדגים את אחוז הנמוך של singlets בדגימות CMC בהשוואה לדגימות PBMC, גם אחרי דוגמאות בידוד CMC מבוסס מסנן. B) של דגימות באיכות גבוהות ועניות מוצגות במשך כמה איכות צעדי שליטה. Gating של זמן לעומת הקרינה (או SSC / FSC) יכול לזהות בעיות קצב זרימה ולהשתמש בם כדי להוציא אירועים שעלולים לגרום לחפצים מכתים. אוכלוסיית הלימפוציטים מבוססת על FSC מול SSC יכולה או לא יכולה להיות מזוהה בקלות בהתאם למדגם. הכללתו של צבע כדאיות היא חיונית, כפי שכמה דגימות עשויות להכיל תאי קיימא פחות מ -50%. Viabili צבעי ty (אמין-reactive) להכתים תאים מתים יותר בהירים מאשר בתאים חיים, ואובדן שלמות הממברנה על המוות של תאים מאפשר לצבוע לגשת לקבוצות האמינים על חלבונים בתוך התא. תאי קיימא מזוהים ולכן על ידי gating על האוכלוסייה לצבוע שלילי הכדאיות.
איור 3. זיהוי של תת תא T. א) CD3 + האוכלוסייה בין דגימות CMC הוא בדרך כלל חלק קטן יותר מהשער הלימפוציטים בהשוואה לדגימות PBMC. דגימות CMC גם משתנים יותר בגודל של אוכלוסיית תאי T, כפי שמוצגים. ב ') מסוג CD4 +, CD8 + ואוכלוסיות תאי CD4-CD8-T מזוהים בקלות בשני CMC ודגימות PBMC. CD4: יחס תא CD8 T יכול להשתנות ממדגם לדגום בקרב CMCs, כפי שמוצג. הנתונים שמוצגים נאספו מהנשים נגוע ב-HIV.
o: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 4. פנוטיפים תא T בדגימות CMC. א) ברירית הקשורים תאי T בלתי משתנה (MAIT) CD8 + CD161 + + אוכלוסייה שמזוהית בקלות בדגימות PBMC הוא כמעט נעדר לחלוטין בCMCs. תאי CD8 + CD161 + T עשויים להיות מזוהה בשני הדגימות. ב ') ביטוי תערוכת CMCs של סמנים פנוטיפי כוללים CD69, HLA DR, CCR5 וPD-1. גייטס היו סגור המבוסס על הקרינה מינוס אחד פקדים (FMO). הנתונים שמוצגים נאספו מהנשים נגוע ב-HIV.
| CMCs | PBMCs | |||||
| אוכלוסייה | HIV + (n = 34) | HIV-(n = 44) | ערך P | HIV + (n = 28) | HIV-(n = 35) | ערך P |
| חציון (IQR) | חציון (IQR) | חציון (IQR) | חציון (IQR) | |||
| % לימפוציטים בשידור חי | 85,65 (60.25-92.63) | 88,70 (74.85-95.38) | 0.1193 | - | - | |
| % + CD3 בשער הלימפוציטים חי | 5,94 (0.90-16.80) | 1,44 (0.39-8.46) | 0.0303 | 41,15 (17.08-62.10) | 41,90 (20.40-51.30) | 0.4231 |
| ב ערך p | <0.0001 | <0.0001 | ||||
| % + CD8 בCD3 + שער | 43,20 (25.75-66.00) | 25,60 (21.50-33.80) | 0.001 | 30,05 (22.75-38.78) | 14,60 (8.01-24.80) | <0.0001 |
| ב ערך p | 0.0291 | <0.0001 | ||||
| % + CD4 בCD3 + שער | 31,10 (20.45-63.10) | 55,30 (50.53-68.18) | 0.0003 | 56,10 (50.10-61.28) | 77,20 (65.90-92.80) | <0.0001 |
| ב ערך p | 0.002 | <0.0001 | ||||
| CD4 יחס: CD8 | 0.71 (0.31-2.45) | 2,09 (1.55-3.01) | 0.0003 | 1,92 (1.44-2.39) | 5.34 (2.66-10.77) | <0.0001 |
| ב ערך p | 0.004 | <0.0001 | ||||
| % DN בCD3 + שער | 10,40 (6.36-14.30) | 10,70 (6.76-19.10) | 0.4793 | 9,58 (6.65-15.98) | 7,01 (5.26-8.07) | 0.0032 |
ערך p | .8338 | 0.0006 | | ||||
טבלת 1. פרופורציות יחסית של תת תא T בCMCs וPBMCs. CMCsamples מ44 נישאי HIV ו34 עובדי מין נשיים נישאי HIV ודגימות PBMC מ35 נישאי HIV ו28 נישאי איידס הושוו לשיעורם היחסי של תאי חיים, תאי CD3 + T ומסוג CD4 +, CD8 + ו CD8-CD4-DN תת תא T. הנתונים מוצגים כחציון (-25 -75 ה רבעוני, IQR). הבדלים בין הקבוצות חושבו על ידי מבחן מאן ויטני. ערכי p מציינים את התוצאה של השוואה בין + איידס ו-HIV-או ב CMC וPBMC נתונים.
| אנליטי | אומר (dev Std.) | |
| pg / ml | pg / ml | |
| MIP-3a | 35.5 (90.6) | 2.9 |
| מיג | 1447 (3026) | 19.4 |
| ITAC | 2.7 (6.3) | 0.8 |
| Fractalkine | 51.6 (69.5) | 10.6 |
| IFN-A2 | 24.0 (12.0) | 40.6 |
| IFN-g | 3.9 (14.2) | 0.3 | IL-1a | 268,4 (721,3) | 6.4 |
| IL-1b | 46.8 (126.2) | 0.7 |
| IL-1RA | 4967,0 (3597) | 5.5 |
| IL-2 | 0.9 (2.6) | 0.6 |
| IL-6 | 14.8 (30.5) | 0.7 |
| IL-7 | 6.3 (10.1) | 0.1 |
| IL-8 | 1491 (2126) | 0.3 |
| 4.5 (8.6) | 0.5 | |
| IL-15 | 1.4 (2.7) | 0.7 |
| IL-17 | 1.1 (2.2) | 0.3 |
| IP-10 | 381.4 (1100) | 2.2 |
| MCP-1 | 129.4 (340.4) | 1.6 |
| MCP-3 | 5.9 (7.1) | 3.7 |
| MDC | 84.2 (94.6) | 6.9 |
| MIP-1a 20.9 (28.9) | 6.4 | |
| MIP-1b | 28.5 (42.6) | 8.9 |
| sCD40L | 10.8 (19.3) | 9 |
| SIL-2Ra | 8.4 (9.8) | 7.7 |
| TNF- | 1.9 (4.1) | 0.1 |
טבלה 2. ביטוי של ציטוקינים וכמוקינים בCVL. דוגמאות מ51 משתתפים נגוע ב-HIV (לא HESN) של העוקבה עובד מין הנשית במחזור האמצע חודשי היו assayed לריכוז ציטוקינים / chemokine באמצעות חרוז ציטוקין האדם / Chemokine Milliplex MAP ערכת מערך על פי היצרןפרוטוקול של הלילה, assayed בשני עותקים. IFN: אינטרפרון; MCP: חלבון chemotactic מונוציטים; MDC: כמוקינים מקרופאג נגזרים, s: מסיס; TNF: גידול גורם נמק; MIP: חלבון דלקתי מקרופאג; ITAC: chemoattractant אלפא תא אינטרפרון inductible T; מיג: monokine הנגרם על ידי אינטרפרון גמא; IP-10; חלבון inductible אינטרפרון. ערכים מתחת לגבול הגילוי חולקו בשווי של חצי להגביל את הגילוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לאור פערים הגדולים בידע בנוגע לחסינות בדרכי המין הנשית (FGT), ניתוח פנוטיפי של CMCs יכול לספק מגוון רחב של תובנות אוכלוסיות לימפוציטים מרובות בצוואר הרחם. בשילוב עם ניתוח proteomic ומדידות עומס נגיפיים בשטיפת צוואר הרחם, חסינות לזיהומים המועברים במגע מיני (STI) של ופתוגנים אחרים יכולה להיות גזור באוכלוסיות שונות.
שיקולים טכניים - CMCs: הבידוד והצביעה מוצלחת של דגימות CMC יכולים להיות מאתגרים. אופטימיזציה של פרוטוקול אוסף CMC הדגישה את היעילות של איסוף CVL הראשון, ואחרי מגרד צוואר הרחם ולבסוף cytobrush. חשוב להגדיל את גודל מדגם מתוכנן בהשוואה לאלו שמחושבים למחקרים היקפיים דם עקב הסבירות המוגברת של הדרת מדגם עבור מגוון רחב של סיבות, שיידונו להלן.
בדיקה של התשוקהזרימת ד פנל על דגימות CMC הוא קריטי לפני ללמוד חניכה. חשוב לפקח autofluorescence תא בדגימות CMC, במיוחד בשער מונוציטים. autofluorescence CMC בכמה ערוצים יכול להיות מורם בהשוואה לPBMCs, אשר עשוי להשפיע gating ויחסי אות לרעש. יתר על כן, מתח אופטימלי צריך להיות אישר לדגימות CMC אם נקבע בעבר על דגימות PBMC.
כדי לשמור על שלמות נתונים, חשוב להוציא דגימות עם זיהום דם או בלבול מועבר במגע מיני. הכללתו של צבע כדאיות תא בcytometry זרימת הפנל היא חיונית כדי לא לכלול תאים מתים שאינו במיוחד לקחת את נוגדני ניאון. בעוד שרוב דוגמאות הן קיימא מאוד, אין זה נדיר שלא לכלול 10-20% מתאים על ידי צבע כדאיות. אם ניתוח של תת קבוצה המבוסס על CD4 וביטוי CD8 מתוכנן, חשוב להשיג לפחות 100 CD3 אירועים + להמשיך בניתוח. דגימות שנאספו מהנשים שונות, ואפילו מאותה אישה t נקודות זמן שונים, יכול להניב מספרים סלולריים שונים בהרבה 13.
ניתוח cytometric הזרימה של לימפוציטים ברירית הוא לעתים קרובות קל יותר ומוצלח יותר אם מדגם שליטת PBMC ניתן להפעיל בו זמנית עם דגימות CMC. בחלק מדגימות CMC, אוכלוסיית הלימפוציטים קשה לזהות על ידי FSC / gating SSC, אבל הכללה של מדגם PBMC תיתן מושג טוב יותר של איפה שער. אפילו בדגימות ללא הלימפוציטים ברורים FSC / אוכלוסיית SSC, ניתן לזהות CD3 הברור + אוכלוסיות. אם רכישת נתונים מופרעת על ידי בעיות טכניות (cytometer סתימת הצריכה, בועות וכו ') gating על הקרינה לאורך זמן יכול להסיר חפצי איסוף נתונים תוך שהוא מאפשר ניתוח מדגם. בקרות מתאימות כגון הקרינה מינוס אחד צינורות (FMO) עבור מיקום שער ייתכן שתצטרכנה להתבצע על תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMC) כאשר מספר התאים הנדרשים הוא מהותי מדי לשימוש דגימות cytobrush.
ontent "> מחקרים רבים הדגימו את זיהוי של תגובות תא T אנטיגן הספציפי בין דגימות CMC. ייצור ציטוקינים CMC יכול גם להיגרם על ידי PMA / Ionomycine, PHA, IFNγ ואנטי CD3 גירוי. אחת המגבלות העיקריות של הגירויים CMC הוא מספר תאים, אשר מפחית את מספר התנאים ובקרות שניתן לבצע לדגימה. היא גם חיונית כדי לפקח בזהירות ולנקוט בצעדים נוספים על מנת למנוע זיהום תרבית תאים. מערכת המין היא לא אתר סטרילי, ובמקרים מסוימים אנטיביוטיקה נוספת יש להוסיף לתקשורת ותרבות, כדי למנוע צמיחת יתר של חיידקים. למרות שניתן cryopreserved CMCs עם הפסד קטן של כדאיות, החלמה היא כ 50%, מה שהופך את דגימות cryopreserved מועמדים עניים ללימודי גירוי אלא אם כן הרחבת תא מתוכננת 10.שיקולים טכניים - CVLs: אוסף של CVL בדרך כלל תוצאות בכרך מדגם מוגבלUme, מניעת הניתוח של מספר רב של ריכוזי חלבון על ידי ELISA חוזר ונשנה. Assay אלטרנטיבה הוא מערך חרוז ציטוקינים, המבוסס על פלטפורמת Luminex או פלטפורמת cytometry הזרימה. ערכות מרובבות זמינות ממספר מקורות מסחריים, המאפשרות הכימות של עד 30 analytes בקטן מאוד נפח דגימה (לעתים קרובות ~ μl 25). אופטימיזציה של מבחני אלה חשפה זיהוי אופטימלי של analytes באמצעות פרוטוקול הדגירה הלילה. חלק analytes כי הם detectible בדגימות פלזמה / סרום אינו detectible בCVL. יש לציין, ריכוז של דגימות CVL באמצעות עמודות ספין לא שפר את זיהוי של כל analytes, טוען כי אין תועלת לריכוז מדגם לפני הפעלת assay מערך חרוז.
ערפלנים ספציפיים לרירית איברי המין: מחקרים של אימונולוגיה FGT חייבים לדאוג להכיר ולהסביר כמה משתנים מבלבלים ככל האפשר. שעות המחזור חודשיכמו עכשיו הוכח להשפיע חסינות דם היקפית 28, וסביר להניח שמפעיל השפעות גדולות יותר על הפנוטיפ CMC והרכב תא, כמו גם חלבונים שנאספו מדגימות CVL 29. סנכרון איסוף דגימה לשלב מחזור חודשי הוא הדרך המועדפת להפחתת שונות נתונים, בין אם היא נמדדת על ידי רמות אסטרוגן / פרוגסטרון או ימים מאז היום הראשון של הווסת האחרונה. השימוש באמצעי מניעה הורמונליים גם משפיע מאוד על הסביבה הרירית והשפעתו צריכה להילקח בחשבון בעת תכנון או ניתוח מחקר. שינוי של הפלורה בנרתיק וכתוצאה מכך בקטריאלי (BV) גם משנה את הסביבה החיסונית ופנוטיפים סלולריים. ניתן לאבחן BV על ידי צביעת גראם וציון נוג'נט ניתן הוקם כדי לשלוט על ההשפעה של בלבול BV.
פעילות מינית יש גם השפעה עמוקה על אימונולוגיה באברי המין, שכן allo-תגובות לזרע יכולה לגרום לשינויים מהירים ודרמטיים בcelפנוטיפ ליטר וסחר בנשים. ואכן, Lajoie et al. תיאר הבדלים בהרכב חלבון CVL בין עובדת מין ואוכלוסיות עובד שאינו מין, עם שינויים המתרחשים בשנים הראשונות לאחר תחילת עבודת מין.
לבסוף, מנהגים תרבותיים כגון שטיפה יציגו וריאציה נוספת לדגימה של רירית. בהתאם למגיב משמש (אקונומיקה, חומרי ניקוי, מיץ לימון, וכו '), שטיפה עשויה להפחית את התדירות / הפנוטיפ של אוכלוסיות תאים, או לשנות autofluorescence בהשוואה לדוגמאות אחרות. באופן אידיאלי, שטיפה לפני cytobrush דגימה צריכה להיות מיואש בקרב תורמים.
יישומים עתידיים: בנוסף למניב תובנה חשובה לתוך רגולציה של חסינות רירית במהלך השתנות חודשי / הורמונליים, זיהום חיידקים / ויראלי ולפני / אחרי גיל המעבר, ניתוח של דגימות הריריות הוא רלוונטי במיוחד למחקרי חיסון נגד מחלות מין / פתוגנים הריריים. במקרה של HIV,שבו מטרה העיקרית של מחקרי חיסון היא לעורר נוגדנים הריריים או תגובת תא T, פיתוח של מבחני מבוססים-CMC ישחק תפקיד מכריע בקביעת קושרת של הגנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S.
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
