Introduction
De meerderheid van de nieuwe hiv-infecties wereldwijd ontstaan door heteroseksuele overdracht, met vrouwen die 47% van de nieuwe infecties in 2011 (UNAIDS 1). Inzicht in de vrouwelijke geslachtsorganen (FGT), een van de belangrijkste toegangspoort portals voor HIV en andere seksueel overdraagbare ziekteverwekkers, is van groot belang op de weg naar het vinden van efficiënte strategieën om infectie te voorkomen. Immuunreacties op de genitale slijmvliezen zijn duidelijk uniek en verschillen van die gemeten in het perifere bloed 2. Echter, de huidige kennis van het immuunsysteem dynamiek de FGT hoogstens beperkt. Tot op heden, hebben de studies van het mucosale immuunsysteem milieu grotendeels gericht op de darm-geassocieerd lymfeweefsel (GALT), waar het duidelijk is geworden dat de vroege gebeurtenissen in mucosale weefsels na infectie hebben een sterke invloed op latere progressie van de ziekte 3,4. Monsters van het genitale slijmvlies vormt een grote uitdaging en is ten minste gedeeltelijk verantwoordelijk voor de lack aan inzicht in de immunologie van de FGT. Oplossen van de puzzel van het immuunsysteem dynamiek tussen gastheer en pathogeen in het kader van de verschillende milieu dat de FGT vereist efficiënte methoden voor het verzamelen en analyseren van monsters van deze locatie.
De FGT is verdeeld in twee delen: het bovenste voortplantingsorganen dat de eileiders, endometrium en endocervix en de onderste luchtwegen die de ectocervix bevat en de vagina bevat (beoordeeld door Kaushic et al. 5). Het is nog onduidelijk wat de relatieve bijdrage van deze verschillende locaties is voor HIV-infectie, maar aangenomen wordt dat beide sites kunnen bijdragen aan HIV ingang 6. T-cellen vertegenwoordigen 40-50% van de leukocyten in de bovenste en onderste voortplantingsstelsel, terwijl macrofagen omvatten ongeveer 10% (beoordeeld in Rodriguez-Garcia et al. 2). T-cellen kunnen worden gedetecteerd in de vagina, cervix en endometrium. Macrofagen sterker localized in het endometrium en het myometrium bindweefsel dan de baarmoederhals, hoewel zij kunnen worden gedetecteerd in beide weefsels. Tenslotte kan plasmacytoïde dendritische cellen (pDCs) en Langerhans-cellen worden gedetecteerd in FGT weefsels. Het fenotype en verhoudingen van immune populaties en de gevoeligheid voor HIV-infectie belangrijk variëren hormonale cycli, het gebruik van hormonale anticonceptiemiddelen, bacteriële vaginose of seksuele activiteiten 5,7-9.
Diverse werkwijzen zijn ontwikkeld om het immuunsysteem bevolking en omgeving van de FGT bestuderen. Cervicale biopsie, cervicale cytobrushes en cervicovaginal lavages (CVL) 10-12 worden het meest gebruikt in de literatuur. CVL collectie PBS spoeling de eenvoudigste werkwijze en maakt de studie van immuun modulerende eiwitten maar resulteert in extreem lage celopbrengst, en is daarom niet geschikt voor het bestuderen van de immuuncel populaties van de FGT 13. CVL monsters, anderzijds, very nuttig voor de beoordeling immune omgeving van de FGT door het meten van de expressie van verschillende cytokinen, chemokinen of antimicrobiële factoren behulp van methoden zoals ELISA, cytokine bead matrix 14 of massaspectrometrie 15,16. Karakterisering van immuuncellen frequenties fenotypes en functies kunnen worden gerealiseerd door het verzamelen van cervicale cellen (CMC) door cervicale cytobrush of cervicale biopsie bemonstering.
Cervicale biopsie sampling is een invasieve methode die het ongemak en risico van bloeden verhoogt en duurt 2-11 dagen om te genezen na de procedure, afhankelijk van de immuunstatus van de vrouw 12. Anderzijds, cervicale cytobrushes, ondanks de lagere opbrengst aan cellen gewonnen, is een minder invasief en meer handige methode om immuuncellen te verzamelen van de FGT. Beide methoden kunnen dezelfde opbrengst van CD45 + leukocyten bereiken, maar twee opeenvolgende cervicale cytobrushes nodig zijn om dezelfde hoeveelheid cellen bevatte vinden in een biopsie 13. Toch cytobrush sampling geeft nog een aanvaardbaar aantal cellen (ongeveer 5.000 CD45 + cellen / cytobrush) voor verdere ex vivo fenotypering van flowcytometrie 14. Ook functionele karakterisering kan worden uitgevoerd op deze monsters uitgevoerd, zoals stimulatie en intracellulaire flowcytometrie of qPCR zijn uitgevoerd met behulp van cytobrush afgeleid CMC HIV-specifieke immuunrespons 17 of Th cel polarisatie 18 identificeren. Uitbreiding van de populatie T-cellen kunnen ook functionele studies met CMC 19 vergemakkelijken.
Het is belangrijk op te merken dat de biopsieën en cytobrushes proeven van verschillende gedeelten van de FGT. Biopsies afkomstig van de superieure deel van het epitheel en stroma van de ectocervix 12,13, terwijl cervicale cytobrushes proeven van de baarmoederhals, het verzamelen cellen afkomstig van het epitheel van endocervix en vermoedelijk de transformatie zone. Cytobrush monsters proeven dus een reGion samengesteld uit een enkele laag van cilinderepitheel, terwijl biopten, omvatten een gebied omzoomd door een geschubde gelaagd epitheel 5. Dientengevolge, de aard van de leukocyt populaties door cervicale biopsie en cytobrush verzameld verschilt. Biopten verzamelen van een groter deel van de CD3 + T-cellen, terwijl cytobrushes resulteren in collectie van een groter deel van CD14 + monocyten / macrofagen 13.
Het bestuderen van de immunologie van de FGT heeft een belang al vele jaren 20-22 en we hebben veel expertise met de studie van cytobrush afgeleide CMC geaccumuleerd. Onze studies richten zich vooral op de studie van HIV-geïnfecteerde, niet-geïnfecteerde en HIV-blootgestelde seronegatieve (HESN) vrouwelijke sekswerkers uit Nairobi, Kenia. HIV voorkeur repliceert in geactiveerde T-cellen 23 en lagere aantallen van geactiveerde cellen die kunnen worden gericht door HIV in de FGT zou kunnen bijdragen tot de bescherming tegen HIV overname. In lijn met deze hypothese, diverse studies hebben lagere immuunactivatie onder HESN sekswerkers die zeer blootgesteld aan HIV beschreven Nog blijven geïnfecteerde 24,25 en dit latente fenotype wordt ook waargenomen in de FGT 14. We beschrijven hier methodologie voor verwerking en evaluatie van T-cellen activatie CMC monsters verkregen uit cervicale cytobrushes door ex vivo flowcytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek verklaring: Het onderzoek ethiek van bestuur van zowel de Universiteit van Manitoba en Kenyatta National Hospital / Universiteit van Nairobi keurde deze studie en schriftelijk toestemming is verkregen van alle deelnemers aan de studie.
1. Voorbereiding van de media en CMC Collection Tubes
- Bereid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2PO 4). Autoclaaf voor steriliteit. Dit kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele maanden.
- Pre-monster 5 ml PBS in 50 ml Falcon buis (een per monster af te halen) en bewaar bij 4 º C tot monstername tijd.
- Label 2-4 cryovials of 1,5 ml microcentrifugebuisjes per monster lavage voor opslag verzamelen.
- Bereid celkweekmedium: RPMI 1640 + 1% penicilline / streptomycine / amfotericine B (eindconcentratie 100 eenheden / ml, 100 ug / ml en 250 ng / ml, respectieely, zonder FCS / FBS toegevoegd.
2. Verzameling van Cytobrush Monsters
Het verzamelen van cytobrush monsters is een niet-invasieve procedure die moet worden uitgevoerd door een getrainde MD of gynaecoloog.
- Verzamel cervicale cellen (CMC) met behulp van zowel een cytobrush en een houten of plastic schraper. Verzamel CMC van de deelnemer onder speculum onderzoek door het plaatsen van de schraper en roteren om de baarmoederhals (figuur 1). Steek de cytobrush in het endocervicale os, draaien 360 °, en zij plaatst zowel de cytobrush en schraper in de 50 ml falcon buis met 5 ml PBS.
- Blijf monsters op ijs / bij 4 º C tot verwerking. Levensvatbaarheid van de cellen, het verwerken van monsters te handhaven binnen 2 uur na afname.
- Indien mogelijk, verzamel afgestemd bloedmonsters in groene top heparine vacutainers perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) geïsoleerd om te dienen als een comparator / controle voor CMC analyse.
3. Isolatie van CMC
Voer monster verwerking in een bioveiligheidsniveau 2 laboratorium, in een steriele bioveiligheid kast met dubbele handschoenen.
- Tijdens de inzameling, kan CMC monsters verontreinigd met bloed. Monsters met zichtbaar bloed verontreiniging van het onderzoek uitsluiten, om de verstorende opname van PBMC in de uiteindelijke steekproef voorkomen. Vanwege het lage aantal lymfocyten geïsoleerd van CMC monsters, kunnen minder ernstige verontreiniging bloed gemakkelijk de CMC lymfocyt component overweldigen.
- Vortex falcon buizen met zowel de cytobrush en schraper voor 45 seconden om cellen te distantiëren van de borstels. Monsters kunnen schuimend worden tijdens dit proces; dit is normaal.
- Gebruik de cytobrush om alle resterende materiaal af te schrapen de schraper en de schraper dient het naar een bleekmiddel oplossing. Om cellen gehecht is aan de borstel / schraper verzamelt, gebruikt een nieuwe handschoen naar de schraper tussen de duim en wijsvinger knijpen.Glijden de borstel, waardoor de cellen en PBS af te halen in dezelfde 50 ml tube. Gooi de cytobrush in een bleekmiddel oplossing, en de handschoen gooi.
BELANGRIJK: Gebruik een nieuwe handschoen voor elk monster. - Monteer een 100 um nylon cel zeef om een frisse 50 ml Falcon buis. Met behulp van een overdracht pipet, het verzamelen van de PBS-celsuspensie uit het monster buis en filteren door de zeef in de nieuwe buis.
- Voeg 5 ml RPMI 1640 de oorspronkelijke monsterbuis. De overdracht pipet was de zijkanten van de monsterbuis met RPMI en overdracht via het filter op de nieuwe verzamelbuis. Was de onderkant van het nylon filter met RPMI ook.
- Centrifugeer de monsters gedurende 10 min bij 514 x g. Het is cruciaal om de centrifuge rem van verlaten tijdens deze stap, om loskomen van de CMC pellet voorkomen.
- Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof uit de tube, en zorg dat de pellet niet storen. Korrelgrootte zal zeer variabel zijn; in zome monsters, de pellet is vrij groot door de aanwezigheid van grote aantallen epitheelcellen, terwijl in andere gevallen de pellet nauwelijks zichtbaar en zeer transparant.
- Resuspendeer de pellet door voorzichtig schudden van de falcon buis. Voeg 5 ml PBS om het monster te wassen.
- Centrifugeer opnieuw gedurende 10 min bij 514 xg zonder centrifuge rem.
- Gooi voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet als hierboven. De cellen zijn klaar voor of cryopreservatie (met behulp van een PBMC cryopreservatieprotocol), stimulatie of flowcytometrie fenotypering.
4. CMC Surface kleuring en flowcytometrie
- Resuspendeer de pellet uit stap 3,10 100 ui blokkerende oplossing en overdracht wordt in een 96-well plaat of FACS buis. De blockingbuffer (om Fcy receptoren blokkeren) recept is als volgt: 1,8 pl muis IgG (uiteindelijke concentratie 0,2 ug / ul) 5 ui FBS en 93,2 pi FACS wassen (PBS +2% FBS).Kleuring kan in een plaat met 96 putjes worden uitgevoerd als pellet klein genoeg zijn, maar moet in FACS buisjes worden uitgevoerd als pellets routinematig groot. Het is belangrijk dat antilichamen dienovereenkomstig titreren.
- Blokkeer de monsters gedurende 10 min op ijs / bij 4 ° C.
- Was de cellen met 100 ul FACS wassen (PBS +2% FBS) in 96-well platen of 500 gl in FACS buisjes. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 min bij 4 ° C met de rem op lage (of uit, als een lage rem instelling niet beschikbaar is).
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet door roeren. Voeg levensvatbaarheid Stain (Live Dead fixable levensvatbaarheid kleurstof). Bereid levensvatbaarheid kleurstof volgens de instructies van de fabrikant. Het moet worden getitreerd voor gebruik in elk laboratorium / cytometer opstart. Incubeer gedurende 30 min in het donker bij 4 ° C.
- Was de cellen μl/500 100 pi PBS (96-well plaat / FACS buizen). Centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 minuten met een lage / geen rem. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen.
- Incubeer de cellen met de cocktail oppervlakte marker antilichamen, in een totaal volume van 100 pl. BELANGRIJK: Optimaliseer en titreer elk flowcytometrie panel voorafgaand aan kleuring proeven. Incubeer cellen gedurende 30 min in het donker bij 4 ° C.
- Herhaal stap 4.5. Als kleuring in een 96-well plaat, overdracht cellen om een FACS buis en verdund tot een eindvolume van 750 pi FACS wassen met 1% paraformaldehyde (PFA) (of Cytofix, verdund 1 op 4). Ga verder met data-acquisitie op een flowcytometer.
5. Verzamelen en bereiden van cervicovaginaal Lavage (CVL)
- Vóór de bemonstering Cytobrush, door met een spuit de endocervix wassen met 2 ml steriele PBS en zuig de lavage van de achterste fornix.
- Verzamel de aangezogen lavage monster in een 15 ml falcon buis en blijf op ijs / bij 4 º C tot verwerking.
- Centrifugeer monster bij 400 xg gedurende 7 min om celafval te verwijderen.
- Collect de supernatant monster het monster in 1 ml of 500 ul porties en bewaar bij -70 ° C. Monsters kunnen worden ontdooid voor ELISA of bead array analyse van CVL eiwitten, maar vermijd meerdere vries / dooi cycli.
- Desgewenst resuspendeer de pellet van cellulair afval in RNA Volgende RNA expressie meten volgens het protocol van de fabrikant.
6. Data Acquisition
- Bereid een reeks buizen vergoeding die overeenkomt met het paneel antilichaam. Voer de compensatie buizen spectrale overlap aan te passen. Voer de monsters op een meerkleurig flowcytometer die is geconfigureerd voor het fluorochroom geconjugeerde antilichamen die in het paneel.
- Schaf een PBMC monster eerste voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) voltage aan te passen om de lymfocytenpopulatie detecteren. Probeer ze te houden op 100 op elke as op een lineaire schaal. Het runnen van een PBMC controle zal het aanzienlijk gemakkelijker om de CMC lymfocytenpopulatie vinden.
- De FSC drempel voor CMC monsters moeten worden verhoogd ten opzichte van PBMC monsters vanwege smeren van de SSC-as bij lage FSC waarden.
- Vortex elke buis voordat u tot aanschaf. Het verwerven van de gehele buis het aantal lymfocytpoort gebeurtenissen verzameld maximaliseren. Bewaken van de machine zorgvuldig om verstopping te voorkomen.
- De gegevens te exporteren naar een flowcytometrische analyse programma zoals FlowJo.
7. Gating Strategie
- Selecteer Doorsturen zijwaartse verstrooiing hoog (FSC-H) / Forward zijwaartse verstrooiing gebied (FSC-A) om de singlet bevolking te bepalen.
- Selecteer Tijd versus TL-marker (zoals bijvoorbeeld FITC) om te controleren voor de kwaliteit van de overname. Verandering in de stroomsnelheid kunnen artefacten in de data te introduceren. Uitsluiten geen gebied dat verschil in debiet toont.
- Identificeer de lymfocytpopulatie op SSC-A/FSC-A perceel. Gebruik een PBMC controle om de identificatie te vergemakkelijken. Merk op dat de CMC lymfocyt populatie niet zo duidelijk als de PBMC besturing lopen. </ Li>
- Gate aan SSC-A/viability kleurstof om dode cellen te sluiten van levende cellen. Dode cellen kunnen niet-specifiek omvatten de antilichamen, die artefacten zal introduceren.
- Gate aan de SSC-A/CD3 aan de T-celpopulatie te identificeren. Uit deze poort identificeren het CD4 + en CD8 + populaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multiparameter flowcytometrie is een krachtig hulpmiddel om de fenotypes en functies van celondergroepen ontleden in voorheen uncharacterized weefsels. Analyse van CMC monsters kunnen informatie over zowel lymfocyten en monocyten populatie opleveren met de juiste gating strategieën.
Een representatieve CMC gating strategie, vergeleken met een PBMC profiel, weergegeven in figuur 2. Het FSC-A versus FSC-H plot maakt de uitsluiting van cel doubletten, die veel voorkomen in CMC monsters vergeleken PBMC, ondanks filtratie (Figuur 2A). Kwaliteitscontrole omvat het verwijderen van flow problemen door gating op tijd, waar veranderingen in de stroomsnelheid of artefacten als gevolg van sample klonten gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd (Figuur 2B). Identificatie van de lymfocyten / monocyten populaties relatief vergelijkbaar in beide PBMC en CMC monsters (Figuur 2B). Uitsluiting van dode cellen door levensvatbaarheid kleurstof voorkomt opnamevan apoptotische cellen die niet specifiek zijn opgenomen fluorescent antilichaam conjugaten. Levensvatbaarheid lager in CMC monsters ten opzichte van PBMC, en kan zeer variabel zijn van monster tot monster (Figuur 2B).
Deze analyse zal zich richten op fenotypering T lymfocyten bevolking, maar CMC monsters monocyten bevatten ook. Na gating op de monocyten populatie, worden cellen gated gebaseerd op een levensvatbaarheid kleurstof en een dump kanaal (figuur 3A). De dump kanaal bevat antilichamen tegen CD56, CD3 en CD19, en gating op dump kanaal-negatieve cellen zullen elke lymfocyt verontreiniging in de monocyten populatie te elimineren. Cellen kunnen vervolgens worden geïdentificeerd op basis van expressie van merkers zoals CD16 en CD 11 c. De CD3 + lymfocyten populatie is typisch gereduceerd in verhouding tot CMC vergeleken met PBMC (figuur 3B, tabel 1). Het hoge aandeel van epitheelcellen, granulocyten en niet CD3 + CD45 + leukocyten in CMC monsters dominates via T-cel populatie. CD4 + T-cellen (mediaan: 55.30%, IQR: 50.53% -68,18%) en CD8 + T-cellen (mediaan: 25.60%, IQR: 21,50% -33,80%) gevonden bij een lagere verhouding (dichter bij 2:01 tussen CMC) vergeleken met de verhouding 5:1 waargenomen bij gezonde PBMC monsters van commerciële geslachtsarbeider cohort Kenia (figuur 3C, tabel 1). Zoals in het bloed, HIV infectie beïnvloedt de verhoudingen van CD4 + en CD8 + T-cellen bij CMC, verminderen de CD4 +: CD8 + ratio 0.7 (mediaan: 0,7, IQR: 0,31-2,45) (figuur 3C, tabel 1). Het is echter niet ongewoon om een groter deel van CD8 + T-cellen van de CMC populatie van gezonde individuen (Figuur 3C) waarnemen. Interessant een uitgebreide CD4-CD8-(dubbel negatief, DN) T-cel populatie ten opzichte PBMC DN T-cel frequentie kan worden waargenomen bij vele CMC monsters van HIV-negatieve individuen (tabel 1). Deze resultaten zijn vergelijkbaar met die verkregen voorhuid monsters 26, hoewelugh deze cellen zijn slecht gekarakteriseerd.
Typische T cel fenotypische merkers zijn gemakkelijk gekwantificeerd onder CMC kan echter uit PBMC, Figuur 4 toont de identificatie van een CD8 + CD161 + + (MAIT) populatie die verschillend in PBMC maar bijna afwezig CMC's (figuur 4A) is. Expressie van activering markers CD69 en HLA DR, migratie marker CCR5 of uitputting marker PD-1, is duidelijk herkenbaar op CD4 + of CD8 + populaties (Figuur 4B).
Kwantificering van de concentratie van cytokinen / chemokinen CVL kan worden geanalyseerd parallel aan CMC kleuring. Dit maakt correlatie tussen de CVL cytokine milieu (ontstekingsbevorderende versus immuunregulerende) en het fenotype van CMC. Ook kunnen deze gegevens worden gebruikt om te bepalen of de frequentie van chemokine receptor expressie op CMC is gerelateerd aan de relatieve expressie van of plasma of CVL chemokinen 14. Tabel 2 </ Strong> geeft de gemiddelde concentratie van cytokine en chemokine analyten in CVL verzameld van gezonde vrouwen en getest door Milliplex cytokine kraal serie kits.
Figuur 1. Anatomie van het vrouwelijke voortplantingssysteem. A) Dwarsdoorsnede van het vrouwelijke voortplantingssysteem, die de relatie van de vagina externe baarmoederhals, cervicale kanaal en baarmoederholte. B) Vooraanzicht hoek bekijken van de cervix, die de externe os en de anterieure en posterieure fornix regio om 12:00 en 06:00, respectievelijk. Overgenomen met toestemming van Reusch et al. 27. De cervicale schraper wordt geroteerd rond de baarmoederhals om CMC te verzamelen, terwijl de cytobrush in het cervicale kanaal is geplaatst en geroteerd om extra CMC te verzamelen. Cervicovaginaal spoelsels (CVL)worden verzameld door het wassen van de endocervix met PBS en het verzamelen van het uit de achterste fornix.
Figuur 2. Gating en kwaliteitscontrole van CMC monsters. A) identificatie van singlets door FSC-A versus FSC-H plot toont het lage percentage van singlets in CMC monsters ten opzichte van PBMC samples, zelfs na-filter op basis van CMC isolement. B) Voorbeelden van hoge en lage kwaliteit monsters worden getoond voor verschillende kwaliteit controle stappen. Gating van Time versus fluorescentie (of SSC / FSC) kan debiet problemen te identificeren en worden gebruikt om gebeurtenissen die kunnen leiden tot vlekken artefacten te sluiten. Een lymfocyt populatie gebaseerd op FSC versus SSC al dan niet gemakkelijk geïdentificeerd afhankelijk van het monster. Opname van een levensvatbaarheid kleurstof is van cruciaal belang, zoals sommige monsters minder dan 50% levensvatbare cellen kan bevatten. Viability (amine-reactief) kleurstoffen vlekken dode cellen helderder dan levende cellen, verlies van membraanintegriteit op celdood kan de kleurstof om aminegroepen op eiwitten in de cel. Levensvatbare cellen worden daarom geïdentificeerd door gating op de levensvatbaarheid kleurstof-negatieve populatie.
Figuur 3. Identificatie van T-cel subsets. A) De CD3 + bevolking onder CMC monsters algemeen een kleiner deel van de lymfocytpoort opzichte van PBMC monsters. CMC monsters zijn ook meer variabel in de grootte van de T-celpopulatie, zoals afgebeeld. B) CD4 +, CD8 + en CD4-CD8-T-celpopulaties worden gemakkelijk geïdentificeerd in zowel CMC en PBMC monsters. CD4: CD8 T-cel-verhouding kan variëren van monster tot monster onder CMC's, zoals weergegeven. De getoonde gegevens verzameld van HIV-niet-geïnfecteerde vrouwen.
Figuur 4. T cel fenotypes CMC monsters. A) De mucosale geassocieerde invariante T-cellen (MAIT) CD8 + CD161 + + populatie die gemakkelijk geïdentificeerd in PBMC monsters bijna geheel afwezig in CMC. De CD8 + CD161 + T-cellen worden geïdentificeerd beide monsters. B) CMC vertonen expressie van fenotypische merkers zoals CD69, HLA-DR, CCR5 en PD-1. Gates werden getrokken op basis van fluorescentie min een (FMO) controles. De getoonde gegevens verzameld van HIV-niet-geïnfecteerde vrouwen.
| CMC | PBMCs | |||||
| Bevolking | HIV + (n = 34) | HIV-(n = 44) | P-waarde een | HIV + (n = 28) | HIV-(n = 35) | P-waarde een |
| mediaan (IQR) | mediaan (IQR) | mediaan (IQR) | mediaan (IQR) | |||
| % Live-lymfocyten | 85,65 (60,25-92,63) | 88,70 (74.85-95.38) | 0,1193 | - | - | |
| % CD3 + in levende lymfocytpoort | 5,94 (0.90-16.80) | 1,44 (0,39-8,46) | 0.0303 | 41.15 (17,08-62,10) | 41.90 (20,40-51,30) | 0,4231 |
| p-waarde b | <0,0001 | <0,0001 | ||||
| % CD8 + in CD3 + poort | 43.20 (25,75-66,00) | 25.60 (21,50-33,80) | 0.001 | 30.05 (22,75-38,78) | 14,60 (8.01-24.80) | <0,0001 |
| p-waarde b | 0.0291 | <0.0001 | ||||
| % CD4 + in CD3 + poort | 31.10 (20,45-63,10) | 55,30 (50,53-68,18) | 0.0003 | 56.10 (50,10-61,28) | 77.20 (65,90-92,80) | <0,0001 |
| p-waarde b | 0.002 | <0,0001 | ||||
| Verhouding CD4: CD8 | 0,71 (0,31-2,45) | 2,09 (1,55-3,01) | 0.0003 | 1,92 (1,44-2,39) | 5,34 (2.66-10.77) | <0,0001 |
| p-waarde b | 0.004 | <0,0001 | ||||
| % DN in CD3 + poort | 10,40 (6.36-14.30) | 10.70 (6,76-19,10) | 0,4793 | 9,58 (6.65-15.98) | 7,01 (5,26-8,07) | 0.0032 |
p-waarde | 0,8338 | 0.0006 | | ||||
Tabel 1. Relatieve verhoudingen van T-cel subsets in CMC en PBMC. CMCsamples vanaf 44 hiv-negatieve en 34 HIV-positieve prostituees en PBMC monsters van 35 hiv-negatieve en 28 hiv-positieven werden vergeleken voor hun relatieve aandeel van levende cellen, CD3 + T-cellen en CD4 +, CD8 + en CD8-CD4-DN T-cel subsets. De gegevens worden gepresenteerd als mediaan (25 e -75 e interquartile, IQR). Verschillen tussen groepen werden berekend door Mann-Whitney test. p waarden geven het resultaat van een vergelijking tussen een HIV + en HIV-bom CMC en PBMC gegevens.
| Analyte | Betekenen een (Std dev.) | |
| pg / ml | pg / ml | |
| MIP-3a | 35,5 (90,6) | 2.9 |
| MIG | 1447 (3026) | 19.4 |
| ITAC | 2.7 (6.3) | 0.8 |
| Fractalkine | 51,6 (69,5) | 10.6 |
| IFN-a2 | 24,0 (12,0) | 40.6 |
| IFN-g | 3.9 (14.2) | 0.3 | IL-1a | 268,4 (721,3) | 6.4 |
| IL-1b | 46,8 (126,2) | 0.7 |
| IL-1ra | 4967,0 (3597) | 5.5 |
| IL-2 | 0.9 (2.6) | 0.6 |
| IL-6 | 14,8 (30,5) | 0.7 |
| IL-7 | 6,3 (10,1) | 0.1 |
| IL-8 | 1491 (2126) | 0.3 |
| 4.5 (8.6) | 0.5 | |
| IL-15 | 1.4 (2.7) | 0.7 |
| IL-17 | 1.1 (2.2) | 0.3 |
| IP-10 | 381.4 (1100) | 2.2 |
| MCP-1 | 129,4 (340,4) | 1.6 |
| MCP-3 | 5.9 (7.1) | 3.7 |
| MDC | 84,2 (94,6) | 6.9 |
| MIP-1a 20,9 (28,9) | 6.4 | |
| MIP-1b | 28,5 (42,6) | 8.9 |
| sCD40L | 10.8 (19.3) | 9 |
| Sil-2RA | 8.4 (9.8) | 7.7 |
| TNF-a | 1.9 (4.1) | 0.1 |
Tabel 2. Expressie van cytokines en chemokines in CVL. Monsters van 51 HIV-niet-geïnfecteerde (niet-HESN) deelnemers van het vrouwelijke geslacht werknemer cohort halverwege de menstruele cyclus werden getest op cytokine / chemokine concentratie met behulp van de Milliplex MAP Human Cytokine / Chemokine kraal array-kit volgens de fabrikant'S nachts protocol, in tweevoud. IFN: interferon; MCP: monocyten chemotactische eiwit; MDC: macrofaag afgeleide chemokinen, s: oplosbaar; TNF: tumor necrosis factor; MIP: macrofaag inflammatoire eiwit; ITAC: interferon inductible T cel alfa chemoaantrekkende; MIG: monokine geïnduceerd door interferon-gamma; IP-10; interferon inductible eiwit. een Waarden beneden de detectiegrens kregen een waarde van de helft van de detectielimiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gezien de grote hiaten in de kennis met betrekking tot de immuniteit bij de vrouwelijke geslachtsorganen (FGT), kan fenotypische analyse van CMC's een breed scala aan inzichten in meerdere lymfocytenpopulaties op de baarmoederhals. In combinatie met proteomics analyse en viral load metingen in cervicale lavage, kan immuniteit voor seksueel overdraagbare aandoeningen (soa) s en andere ziekteverwekkers worden ontleed in verschillende populaties.
Technische overwegingen - CMC: De isolatie en succesvolle kleuring van CMC monsters kan een uitdaging zijn. Optimalisatie van de CMC verzamelprotocol is de doeltreffendheid van eerste verzamelen CVL, gevolgd door cervicale schraper en uiteindelijk de cytobrush benadrukt. Het is belangrijk geplande steekproeven verhogen vergeleken met die berekend perifeer bloed studies door de verhoogde waarschijnlijkheid van uitsluiting monster om verschillende redenen, hieronder besproken.
Het testen van het verlangend stroom panel op CMC monsters is van cruciaal belang voorafgaand aan de start te bestuderen. Het is belangrijk om te controleren cel autofluorescentie CMC monsters, met name in de monocyt poort. CMC autofluorescentie in sommige kanalen kunnen worden verhoogd vergeleken met PBMC's, die van invloed kunnen gating en signaal-ruisverhoudingen. Bovendien moet een optimale voltages worden bevestigd voor CMC monsters indien deze reeds eerder bepaald op PBMC monsters.
Om data-integriteit te behouden, is het belangrijk om monsters met bloed besmetting of verwarrende soa uit te sluiten. De opname van een cellevensvatbaarheid kleurstof in de flowcytometrie paneel essentieel dode cellen die niet-specifiek nemen fluorescente antilichamen sluiten. Terwijl de meeste monsters zeer rendabel, is het niet ongewoon om 10-20% van de cellen sluiten dat levensvatbaarheid kleurstof. Als deelanalyse gebaseerd op CD4 en CD8-expressie is gepland, is het belangrijk ten minste 100 CD3 + gebeurtenissen doorgaan met analyse. Monsters van verschillende vrouwen, en zelfs van dezelfde vrouw een t verschillende tijdstippen, kan enorm verschillend aantal cellen opleveren 13.
Flowcytometrische analyse van mucosale lymfocyten is vaak makkelijker en succesvoller als een PBMC controle monster tegelijk draaien met de CMC monsters. In sommige CMC monsters, de lymfocytenpopulatie is moeilijk vast te stellen door de FSC / SSC gating, maar opname van de PBMC monster zal een beter idee van waar te poort geven. Zelfs in monsters zonder een duidelijke lymfocyt FSC / SSC bevolking, kan onderscheiden CD3 + populatie worden geïdentificeerd. Als de data-acquisitie wordt onderbroken door technische problemen (cytometer intake verstopping, bellen, etc.) gating op fluorescentie verloop van tijd kan het verzamelen van gegevens artefacten te verwijderen terwijl u toch monster analyse. Passende controles zoals fluorescentie min een (FMO) buizen voor de poort plaatsing mogelijk moeten worden uitgevoerd op perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) wanneer het aantal cellen nodig is, is te groot om te cytobrush samples gebruiken.
NHOUD "> Studies hebben de detectie van antigeen-specifieke T cel responsen tussen CMC monsters aangetoond. CMC cytokineproductie kan ook worden geïnduceerd door PMA / Ionomycine, PHA, IFNy en anti-CD3 stimulering. Een van de belangrijkste beperkingen van CMC is stimulaties aantal cellen, waardoor het aantal voorwaarden en controles die per monster kan worden uitgevoerd vermindert. Ook is het van cruciaal belang om zorgvuldig te controleren en neemt extra maatregelen om de celcultuur besmetting te voorkomen. De geslachtsorganen is geen steriele locatie, en in sommige gevallen extra antibiotica moet worden toegevoegd aan kweekmedia om bacteriële overgroei te voorkomen. Hoewel CMC worden gecryopreserveerd met weinig verlies van levensvatbaarheid, herstel ongeveer 50%, waardoor gecryopreserveerd monsters slechte kandidaten voor stimulatie studies tenzij celexpansie gepland 10.Technische overwegingen - CVLS: Collectie van CVL resulteert meestal in beperkte steekproef volume, waardoor de analyse van een groot aantal eiwitconcentraties door herhaalde ELISA. Een alternatieve test is de cytokine bead matrix, gebaseerd op het Luminex platform of flowcytometrie platform. Multiplexed kits zijn verkrijgbaar bij verschillende commerciële bronnen, waardoor de kwantificering van maximaal 30 analyten in een extreem klein monstervolume (meestal ~ 25 pi). Optimalisatie van deze testen heeft optimale detectie van analyten geopenbaard met de overnacht incubatie protocol. Sommige analyten die waarneembaar zijn in plasma / serum monsters zijn niet waarneembaar in CVL. Met name concentratie van CVL monsters met behulp spinkolommen niet verbeterde detectie van een analyten, suggereert dat er geen voordeel voor monsterconcentratie vóór het uitvoeren van de assay bead matrix.
Confounders specifiek voor de genitale slijmvlies: Studies van FGT immunologie moet zorgen te erkennen en rekening te houden met zo veel verwarrende variabelen mogelijk. De menstruatiecyclus hzoals nu aangetoond dat perifere bloed immuniteit 28 beïnvloeden, en waarschijnlijk meer invloed uitoefent op CMC fenotype en celsamenstelling en de vanuit CVL monsters 29 eiwitten. Synchroniseren monstername naar menstruele cyclus fase is de beste manier om data variabiliteit te verminderen, hetzij gemeten door oestrogeen / progesteron niveaus of dagen sinds de eerste dag van de laatste menstruatie. Het gebruik van hormonale anticonceptie ook grote invloed op de mucosale milieu en het effect ervan moet rekening worden gehouden bij het ontwerpen of analyseren van een studie. Wijziging van de vaginale flora waardoor bacteriële vaginose (BV) wijzigt ook het immuunsysteem milieu en cellulaire fenotypes. BV kan worden gediagnosticeerd door Gram kleuring en een Nugent score kan worden vastgesteld om te controleren voor het verstorende effect van de BV.
Seksuele activiteit heeft ook een grote invloed op de genitale immunologie, omdat allo-reacties op sperma snelle en dramatische veranderingen in de cel kan inducerenl fenotype en mensenhandel. Inderdaad, Lajoie et al.. hebben beschreven verschillen in CVL eiwitsamenstelling tussen prostituee en niet-prostituee bevolking, met veranderingen die zich in de eerste jaren na de start van sekswerk.
Ten slotte zal de culturele praktijken zoals douchen verdere variatie in mucosale bemonstering introduceren. Afhankelijk van het gebruikte reagens (bleekmiddel, detergens, limoensap, enz.), kunnen douchen de frequentie / fenotype van celpopulaties verminderen of veranderen autofluorescentie vergelijking met andere monsters. Idealiter zou douchen vóór de bemonstering Cytobrush worden ontmoedigd tussen donoren.
Toekomstige toepassingen: Naast hetgeen belangrijk inzicht in de regulatie van mucosale immuniteit tijdens de menstruele / hormonaal variabiliteit, virale / bacteriële infecties en voor / na de menopauze, analyse van mucosale monsters is bijzonder relevant voor vaccinstudies tegen soa / mucosale pathogenen. In het geval van HIV,wanneer een belangrijk doel vaccin studies is een mucosale antilichaam of T cel respons op te wekken, wordt ontwikkeling van CMC-gebaseerde testen een belangrijke rol spelen bij het bepalen correlaten van bescherming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S.
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
