Introduction
غالبية الإصابات الجديدة بفيروس نقص المناعة البشرية في جميع أنحاء العالم من خلال نقل تنشأ الغيرية، وتمثل النساء 47٪ من الإصابات الجديدة في عام 2011 (برنامج الأمم المتحدة المشترك 1). فهم المسالك التناسلية للإناث (FGT)، واحدة من بوابات الدخول الرئيسية لفيروس نقص المناعة البشرية وغيره من مسببات الأمراض التي تنتقل بالاتصال الجنسي، له أهمية كبيرة على طريق إيجاد استراتيجيات فعالة لمنع العدوى. الاستجابات المناعية في الغشاء المخاطي التناسلية بشكل واضح فريدة من نوعها وتختلف عن تلك التي قيست في الدم المحيطي 2. ومع ذلك، والمعرفة الحالية لديناميات المناعة في FGT يقتصر في أحسن الأحوال. حتى الآن، ركزت دراسات البيئة المناعة المخاطية إلى حد كبير على الأمعاء المرتبطة الأنسجة اللمفاوية (GALT)، حيث أصبح من الواضح أن الأحداث في وقت مبكر من الأنسجة المخاطية بعد الإصابة يكون لها تأثير قوي على تطور المرض لاحقا 3،4. جمع عينات من الغشاء المخاطي التناسلية يمثل تحديا كبيرا، وهي مسؤولة جزئيا على الأقل في أمريكا اللاتينية والكاريبيك من فهم علم المناعة من FGT. حل اللغز من ديناميكية المناعة بين المضيف والممرض في سياق البيئة المتميزة التي هو FGT يتطلب أساليب فعالة لجمع وتحليل عينات من هذه اللغة.
ينقسم FGT إلى قسمين: الجهاز التناسلي العلوي الذي يتضمن أنابيب فالوب، بطانة الرحم وباطن عنق الرحم، والجهاز الذي يحتوي على أقل الجزء المهبلي من العنق والمهبل (استعرضها Kaushic آخرون 5). فإنه لا يزال من غير الواضح ما المساهمة النسبية لهذه المواقع المختلفة للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، ولكن يعتقد أن كلا الموقعين يمكن أن تسهم في إدخال فيروس نقص المناعة البشرية 6. خلايا T تمثل 40-50٪ من كريات الدم البيضاء في مساحات الإنجابية العلوي والسفلي، في حين تضم ما يقرب من 10٪ الضامة (إعادة النظر في رودريغيز غارسيا، وآخرون 2). ويمكن الكشف عن خلايا T في المهبل وعنق الرحم وبطانة الرحم و. الضامة هي أكثر locali بقوةزد في بطانة الرحم والنسيج الضام عضلة الرحم من عنق الرحم، على الرغم من أنها يمكن أن يتم الكشف عن في كل الأنسجة. أخيرا، الخلايا الجذعية بلازماوية (pDCs) وخلايا لانغرهانس يمكن أيضا أن يتم الكشف عن FGT في الأنسجة. النمط الظاهري ونسب السكان المناعة، وقابليتها للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية قد تختلف الأهم وفقا لدورات الهرمونية، واستخدام وسائل منع الحمل الهرمونية، التهاب المهبل الجرثومي أو أنشطة جنسية 5،7-9.
وقد تم تطوير أساليب متنوعة لدراسة السكان والبيئة المناعي من FGT. خزعة عنق الرحم، وعنق الرحم وcytobrushes lavages العنقية المهبلية (CVL) 10-12 هي الأكثر استخداما عبر الأدب. جمع CVL بواسطة PBS غسل هو أبسط طريقة ويسمح دراسة البروتينات المناعية تغييري ولكن النتائج في العائد خلية منخفضة للغاية، وبالتالي فهي ليست مناسبة لدراسة السكان الخلايا المناعية من FGT 13. عينات CVL هي، من ناحية أخرى، والخامسريها مفيدة لتقييم البيئة المناعي للFGT عن طريق قياس التعبير عن مختلف السيتوكينات، كيموكينات أو عوامل مضادة للميكروبات باستخدام أساليب مثل ELISA، خلوى حبة مجموعة 14 أو قياس الطيف الكتلي 15،16. لا يمكن أن يتحقق توصيف الترددات الخلايا المناعية، والظواهر وظائف الخلايا وحيدات النوى من خلال جمع عنق الرحم (CMC) من خلال عنق الرحم cytobrush أو عنق الرحم أخذ عينات الخزعة.
عنق الرحم أخذ عينات الخزعة هو أسلوب الغازية التي تزيد من مشقة وخطر النزيف ويأخذ 2-11 أيام للشفاء بعد إجراء اعتمادا على الوضع المناعي للمرأة 12. من ناحية أخرى، cytobrushes عنق الرحم، على الرغم من انخفاض العائد من الخلايا التي تم جمعها، هو وسيلة أقل الغازية وأكثر ملاءمة لجمع الخلايا المناعية من FGT. كلتا الطريقتين يمكن الوصول إلى نفس العائد من كريات الدم البيضاء CD45 +، ولكن اثنين cytobrushes عنق الرحم متتابعة ضرورية للحصول على نفس الكمية من الخلايا الموجودة طن واحد خزعة 13. مع ذلك، وأخذ العينات cytobrush لا يزال يوفر عددا مقبولا من خلايا (CD45 + حوالي 5،000 خلية / cytobrush) لمزيد من فيفو السابقين phenotyping بواسطة التدفق الخلوي 14. أيضا، وتوصيف وظيفي يمكن القيام بها على هذه العينات، حيث تم تنفيذ التحفيز وتدفق الخلايا الخلوي أو باستخدام QPCR المجالس البلدية للأطفال المستمدة cytobrush لتحديد الاستجابات المناعية فيروس نقص المناعة البشرية محددة 17 أو الاستقطاب الخلية ال 18. قد توسع من السكان الخلايا التائية أيضا تسهيل الدراسات الفنية مع المجالس البلدية للأطفال 19.
من المهم أن نلاحظ أن الخزعات وcytobrushes عينة أجزاء متميزة من FGT. وتستمد الخزعات من الجزء العلوي للظهارة وسدى من الجزء المهبلي من العنق 12،13، في حين cytobrushes عنق الرحم أخذ عينات من فوهة عنق الرحم، وجمع الخلايا المشتقة من ظهارة باطن عنق الرحم ويفترض أن منطقة التحول. لذا عينات عينة Cytobrush إعادةجيون تتألف من طبقة واحدة من ظهارة عمودية، في حين الخزعات، وتشمل منطقة مبطنة من قبل ظهارة الحرشفية الطبقية 5. ونتيجة لذلك، فإن طبيعة السكان الكرية البيضاء التي جمعتها خزعة عنق الرحم وcytobrush يختلف. الخزعات جمع نسبة أعلى من الخلايا CD3 + T، في حين cytobrushes يؤدي إلى مجموعة من نسبة أعلى من حيدات CD14 + / 13 الضامة.
وكانت دراسة علم المناعة من FGT مصلحة لسنوات عديدة 20-22 وتراكمت لدينا قدرا كبيرا من الخبرة مع دراسة المجالس البلدية للأطفال المستمدة cytobrush. تركز دراساتنا في الغالب على دراسة المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية، وغير مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية تتعرض سلبيين (الحصن) عاملات الجنس من نيروبي، كينيا. فيروس نقص المناعة البشرية يعيد تفضيلي في تنشيط خلايا تي 23 وانخفاض أعداد خلايا تنشيط التي يمكن أن تكون مستهدفة من قبل فيروس نقص المناعة البشرية في FGT يمكن أن تسهم في الحماية من فيروس نقص المناعة البشرية الاستحواذ. تمشيا مع هذه الفرضية، عدة ستوديوقد وصفت وفاق تنشيط جهاز المناعة أقل بين العاملات في تجارة الجنس الحصن الذين يتعرضون للغاية لفيروس نقص المناعة البشرية لا تزال حتى الآن غير مصاب 24،25، ويلاحظ هذا النمط الظاهري هادئة أيضا في FGT 14. هنا، نحن تصف منهجية لمعالجة وتقييم تفعيل الخلايا التائية في عينات CMC المستمدة من cytobrushes عنق الرحم بواسطة فيفو السابقين التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: أخلاقيات البحوث لوحات كل من جامعة مانيتوبا ومستشفى كينياتا الوطني / جامعة نيروبي وافقت على هذه الدراسة وتم الحصول على الموافقة المسبقة الخطية من جميع المشاركين في الدراسة.
1. إعداد وسائل الإعلام وأنابيب جمع CMC
- إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (137.93 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.67 ملي بوكل، 8.1 ملي نا 2 هبو 4، 1.47 ملي KH 2 PO 4). الأوتوكلاف للعقم. هذا ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.
- قبل قسامة 5 مل PBS في أنبوب 50 مل الصقر (واحد لكل عينة التي سيتم جمعها) وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى وقت جمع العينة.
- تسمية 2-4 cryovials أو 1.5 مل أنابيب microcentrifuge لكل عينة لجمع غسيل للتخزين.
- إعداد الخلايا سائل الإعلام والثقافة: 1640 RPMI + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين / الأمفوتريسين B (تركيز النهائي 100 وحدة / مل، 100 ميكروغرام / مل و 250 نانوغرام / مل، respectivوأضاف اعل، مع عدم وجود FCS / FBS.
2. جمع عينات Cytobrush
جمع عينات cytobrush هو إجراء غير الغازية التي يجب تنفيذها من قبل MD المدربين أو طبيب نسائي.
- جمع الخلايا وحيدات النوى عنق الرحم (CMC) باستخدام كلا من cytobrush ومكشطة خشبية أو بلاستيكية. جمع CMC من المشارك تحت الفحص عن طريق إدخال منظار مكشطة وتدور حول فوهة عنق الرحم (الشكل 1). إدراج cytobrush في نظام التشغيل وباطن عنق الرحم، وتناوب 360 درجة، ووضع على الفور كلا من cytobrush ومكشطة في أنبوب 50 مل الصقر تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني.
- الاحتفاظ بعينات على الجليد / في 4 º C حتى المعالجة. للحفاظ على بقاء الخلية، وعينات العملية في غضون 2 ساعة من جمعها.
- إذا كان ذلك ممكنا، وجمع عينات الدم المتطابقة باللون الأخضر أعلى vacutainers الهيبارين لالمحيطية وحيدات النوى الدم الخلية (PBMC) العزلة ليكون بمثابة مقارنة / تحكم لتحليل CMC.
3. عزل المجالس البلدية للأطفال
أداء تجهيز العينات في المختبر مستوى السلامة الأحيائية 2، في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة مع قفازات مزدوج.
- خلال جمع ويمكن عينات CMC تصبح ملوثة بالدماء. استبعاد العينات مع تلوث الدم مرئية من الدراسة من أجل منع إدراج الخلط بين PBMC في العينة النهائية. ويرجع ذلك إلى انخفاض عدد الخلايا الليمفاوية المعزولة من عينات CMC، يمكن أن تلوث الدم الطفيفة تطغى بسهولة المكون اللمفاويات CMC.
- أنابيب دوامة الصقر تحتوي على كلا من cytobrush ومكشطة لمدة 45 ثانية لفصل الخلايا من الفرش. قد تصبح عينات رغوي خلال هذه العملية؛ هذا أمر طبيعي.
- استخدام cytobrush لتتخلص من أي المواد المتبقية قبالة مكشطة، وتجاهل مكشطة في محلول التبييض. لجمع أي الخلايا المتبقية تعلق على فرشاة / مكشطة، واستخدام القفازات جديدة للضغط على مكشطة بين الإبهام والسبابة.تنزلق الفرشاة، والسماح للخلايا وPBS التي سيتم جمعها في نفس أنبوب 50 مل. تجاهل cytobrush في محلول التبييض، وتجاهل القفازات.
هام: استخدم قفاز جديد لكل عينة. - تناسب 100 ميكرومتر مصفاة الخلية النايلون لالطازجة أنبوب 50 مل الصقر. باستخدام ماصة نقل، وجمع تعليق PBS خلية من أنبوب العينة وتصفية من خلال مصفاة في أنبوب جديد.
- إضافة 5 مل من 1640 RPMI إلى أنبوب العينة الأصلية. باستخدام ماصة نقل، وغسل الجانبين من أنبوب عينة مع RPMI، ونقل من خلال فلتر لأنبوب المجموعة الجديدة. غسل الجزء السفلي من مرشح من النايلون مع RPMI كذلك.
- الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 514 ز س. فمن الأهمية بمكان أن يترك الفرامل الطرد المركزي من خلال هذه الخطوة، من أجل منع بإزاحة بيليه CMC.
- بلطف إزالة طاف من الأنبوب، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه. سوف حجم بيليه تكون متغيرة بصورة كبيرة؛ في ذلكلي العينات، بيليه هو كبير جدا بسبب وجود أعداد كبيرة من الخلايا الظهارية، بينما في حالات أخرى، بيليه هو بالكاد مرئية وشفافة للغاية.
- resuspend الكرية التي كتبها الإثارة لطيف من الأنبوب الصقر. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني لغسل العينة.
- الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 514 x ج مع عدم وجود الفرامل الطرد المركزي.
- تجاهل بعناية طاف واعادة تعليق بيليه على النحو الوارد أعلاه. الخلايا مستعدون لأي الحفظ بالتبريد (باستخدام بروتوكول الحفظ بالتبريد PBMC)، والتحفيز أو التدفق الخلوي phenotyping.
4. CMC تلطيخ السطح والتدفق الخلوي
- resuspend الكرية من الخطوة 3.10 في 100 ميكرولتر من عرقلة الحل ونقل إما في لوحة 96 جيدا أو أنبوب FACS. عرقلة الحل (لمنع المستقبلات Fcγ) هو وصفة على النحو التالي: 1.8 ميكرولتر مفتش الماوس (تركيز النهائي 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر)، 5 ميكرولتر FBS و93.2 ميكرولتر FACS غسل (PBS +2٪ FBS).تلطيخ لا يمكن أن يؤديها في 96 لوحة جيدا إذا أحجام بيليه صغيرة بما فيه الكفاية، ولكن قد تحتاج إلى القيام بها في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية إذا الكريات كبيرة بشكل روتيني. من المهم أن يعاير الأجسام المضادة وفقا لذلك.
- منع عينات لمدة 10 دقيقة على الجليد / في 4 درجات مئوية.
- غسل الخلايا مع 100 ميكرولتر من FACS غسل (PBS +2٪ FBS) في لوحات 96 جيدا أو 500 ميكرولتر في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية مع الفرامل على انخفاض (أو إيقاف تشغيله، وإذا كان إعداد الفرامل منخفضة غير متوفرة).
- إزالة طاف واعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق التحريض. إضافة وصمة عار الجدوى (لايف الميت قابل للتثبيت الجدوى صبغة). إعداد الجدوى صبغ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. قد تحتاج إلى معاير للاستخدام في كل الإعداد مختبر / عداد الكريات. احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية.
- غسل الخلايا μl/500 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (لمدة 96 لوحة جيدا أنابيب / نظام مراقبة الأصول الميدانية). أجهزة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 10 دقيقة مع انخفاض / لا الفرامل. إزالة supernatanر وResuspend الخلايا.
- احتضان الخلايا مع مزيج من الأجسام المضادة علامة السطح، في حجم ما مجموعه 100 ميكرولتر. هام: تحسين ويعاير كل التدفق الخلوي لوحة قبل عينة تلطيخ. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية.
- كرر الخطوة 4.5. إذا تلطيخ في 96 لوحة جيدا، وخلايا نقل إلى أنبوب FACS وتضعف إلى الحجم النهائي من 750 ميكرولتر من FACS غسل تحتوي على 1٪ بارافورمالدهيد (PFA) (أو CytoFix، المخفف في 1 4). انتقل إلى الحصول على البيانات على عداد الكريات التدفق.
5. جمع وإعداد عنق الرحم المهبلي الغسل (CVL)
- قبل cytobrush أخذ العينات، واستخدام حقنة لغسل باطن عنق الرحم مع 2 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة ونضح غسيل من القبو الخلفي.
- جمع العينة غسيل يستنشق في أنبوب 15 مل الصقر والحفاظ على الجليد / في 4 º C حتى المعالجة.
- عينة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 7 دقائق لإزالة الحطام الخلوية.
- شاركllect طاف، قسامة العينة في 1 مل أو 500 ميكرولتر مأخوذة، وتخزينها في -70 درجة مئوية. مأخوذة يمكن إذابة لELISA أو تحليل مجموعة من البروتينات حبة CVL، ولكن تجنب متعددة دورات تجميد / الذوبان.
- إذا رغبت في ذلك، resuspend الكرية من الحطام الخلوية في وقت لاحق لقياس الحمض النووي الريبي RNA التعبير باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
6. الحصول على البيانات
- إعداد مجموعة من أنابيب التعويض الذي يطابق لوحة الأجسام المضادة. تشغيل أنابيب تعويضات لضبط التداخل الطيفي. تشغيل العينات على أي تدفق عداد الكريات متعدد الألوان الذي تم تكوينه لاستخدام الأجسام المضادة مترافق تألقي في لوحة.
- الحصول على عينة PBMC الأولى لضبط الأمام مبعثر (FSC) والجانب مبعثر (SSC) الجهد من أجل الكشف عن السكان لمفاوية. محاولة الاحتفاظ بها في كل محور على 100 على نطاق والخطية. وسوف يعمل على التحكم PBMC جعله أسهل بكثير للعثور على السكان لمفاوية CMC.
- عتبة FSC لعينات CMC قد تحتاج إلى زيادة النسبي لعينات PBMC بسبب تشويه يصل محور SSC في القيم FSC منخفضة.
- دوامة كل أنبوب قبل الحصول. الحصول على أنبوب بأكمله إلى زيادة عدد الأحداث بوابة اللمفاويات التي تم جمعها. رصد الجهاز بعناية لتجنب انسداد.
- تصدير البيانات إلى برنامج تحليل تدفق cytometric مثل FlowJo.
7. استراتيجية المحاصرة
- حدد إعادة توجيه الجانب مبعثر عالية (FSC-H) / الى الامام منطقة الجانب مبعثر (FSC-A) لتحديد السكان القميص.
- حدد التوقيت مقابل علامة نيون (كمثال FITC) للسيطرة على جودة عملية الاستحواذ. التغير في معدل التدفق قد يعرض القطع الأثرية في البيانات. استبعاد أي منطقة يظهر التباين في معدل التدفق.
- تحديد السكان اللمفاويات على SSC-A/FSC-A المؤامرة. استخدام عنصر تحكم PBMC لتسهيل تحديد الهوية. لاحظ أن السكان اللمفاويات CMC قد لا تكون واضحة مثل السيطرة PBMC </ لى>
- البوابة على SSC-A/viability صبغ لاستبعاد الخلايا الميتة من خلايا حية. الخلايا الميتة يمكن أن تتضمن على وجه التحديد غير الأجسام المضادة، والتي سوف أعرض التحف.
- البوابة على SSC-A/CD3 لتحديد السكان الخلايا التائية. من هذه البوابة، وتحديد السكان CD4 + و CD8 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التدفق الخلوي Multiparameter هو أداة قوية لتشريح الظواهر وظائف فرعية الخلايا في الأنسجة uncharacterized سابقا. تحليل عينات CMC يمكن أن تسفر عن معلومات عن كل من اللمفاويات والوحيدات السكان مع استراتيجيات النابضة المناسبة.
ممثل استراتيجية النابضة CMC، مقارنة الشخصي PBMC المتطابقة، هو مبين في الشكل 2. وFSC-A مقابل FSC-H مؤامرة يسمح لاستبعاد الحلل الخلية، والتي تنتشر بشدة في عينات CMC مقارنة PBMC، حتى بعد الترشيح (الشكل 2A). تشمل مراقبة الجودة إزالة القضايا تدفق بواسطة المعزولة في الوقت المحدد، حيث التغيرات في معدل التدفق أو القطع الأثرية بسبب كتل عينة يمكن التعرف عليها بسهولة (الشكل 2B). تحديد السكان اللمفاويات / الوحيدات مشابه نسبيا في كل من PBMC وعينات CMC (الشكل 2B). استبعاد الخلايا الميتة من قبل الجدوى صبغ يمنع إدراجخلايا أفكارك التي اتخذت غير خصيصا تقارن الضد الفلورسنت. بقاء أقل في عينات CMC مقارنة PBMC، ويمكن أن تكون متغيرة بصورة كبيرة من عينة إلى عينة (الشكل 2B).
وسيركز هذا التحليل على phenotyping السكان اللمفاويات T، ولكنها تحتوي على عينات CMC أيضا حيدات. بعد تبوب على السكان الوحيدات، هي بوابات الخلايا استنادا صبغة الجدوى وقناة تفريغ (الشكل 3A). قناة تفريغ يحتوي على أجسام مضادة ضد CD56، CD19 CD3 و، وسوف تبوب على خلايا قناة السلبية تفريغ القضاء على أي تلوث اللمفاويات في عدد السكان الوحيدات. ومن ثم يمكن تحديد الخلايا استنادا إلى التعبير عن علامات مثل CD16 CD11c و. يتم خفض السكان اللمفاويات CD3 + عادة في نسبة بين CMC مقارنة PBMC (الشكل 3B، الجدول 1). نسبة عالية من الخلايا الظهارية، وغير المحببة CD3 + CD45 + كريات الدم البيضاء الموجودة في عينات CMC دominates على السكان الخلايا التائية. خلايا CD4 + T (الوسيط: 55.30٪، المجال الربيعي الداخلي: 50.53٪ -68.18٪) والخلايا CD8 + T (الوسيط: 25.60٪، المجال الربيعي الداخلي: 21.50٪ -33.80٪) تم العثور على نسبة أقل (أقرب إلى 02:01 بين CMC) بالمقارنة مع نسبة 05:01 لوحظ بين عينات PBMC صحية من الجنس الفوج العامل التجاري في كينيا (الشكل 3C، الجدول 1). كما هو الحال في الدم، ويؤثر على الإصابة بفيروس نقص المناعة نسب CD4 + وخلايا CD8 + T بين اللجنة العسكرية المركزية، خفض CD4 +: نسبة CD8 + 0.7 (الوسيط: 0.7، الربعية: 0،31-2،45) (الشكل 3C، الجدول 1). ومع ذلك، فإنه ليس من غير المألوف لمراقبة نسبة أعلى من خلايا CD8 + T بين السكان CMC من الأفراد الأصحاء (الشكل 3C). ومن المثير للاهتمام، موسعة-CD4 CD8-(مزدوج السلبية، DN) T السكان الخلية النسبي إلى PBMC DN T تردد خلية يمكن ملاحظتها بين العديد من عينات CMC الأفراد السلبيين (الجدول 1). هذه النتائج مشابهة لتلك التي حصلنا عليها لعينات القلفة 26، althoلاف وتتميز هذه الخلايا بشكل سيئ.
وكميا نموذجية علامات المظهري الخلايا التائية بسهولة بين المجالس البلدية للأطفال ولكن قد تختلف من PBMCs؛ يوضح الشكل 4 التعرف على CD161 + + + (MAIT) السكان CD8 والتي تختلف في PBMCs ولكن شبه غائبة في المجالس البلدية للأطفال (الشكل 4A). التعبير عن علامات التنشيط CD69 وHLA DR، CCR5 علامة الهجرة أو الإرهاق علامة يمكن تحديد PD-1 بشكل واضح على CD4 + أو CD8 + السكان (الشكل 4B).
الكمي لتركيز السيتوكينات / كيموكينات في CVL يمكن تحليلها بشكل متواز مع CMC تلطيخ. وهذا يسمح للعلاقة بين خلوى الوسط CVL (الموالية للالتهابات مقابل مناعة) والنمط الظاهري من المجالس البلدية للأطفال. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه البيانات لتحديد ما إذا كان تواتر مستقبلات chemokine التعبير على المجالس البلدية للأطفال يرتبط التعبير النسبية إما البلازما أو كيموكينات CVL 14. الجدول 2 </ قوي> يشير إلى متوسط تركيز خلوى chemokine والتحاليل في CVL جمعها من امرأة سليمة ويعاير من قبل مجموعات Milliplex خلوى حبة صفيف.
الشكل 1. تشريح الجهاز التناسلي للأنثى. أ) عرض مستعرضة من الجهاز التناسلي للأنثى، والتي تبين العلاقة بين المهبل لنظام التشغيل والخارجية عنق الرحم، وعنق الرحم والرحم قناة تجويف. ب) زاوية رأي الجبهة من عنق الرحم، والتي تبين نظام التشغيل والخارجية، والأمامي والخلفي القبو المناطق في تمام الساعة 12:00 و 6:00، على التوالي. مستنسخة بإذن من Reusch وآخرون 27. يتم استدارة مكشطة عنق الرحم حول فوهة عنق الرحم لجمع اللجنة العسكرية المركزية، في حين يتم إدخال cytobrush في قناة عنق الرحم واستدارة إضافية لجمع CMC. lavages المهبل عنق الرحم (CVL)يتم جمعها من قبل غسل باطن عنق الرحم مع برنامج تلفزيوني وجمع مثل هذه المعلومات من القبو الخلفي.
الرقم 2. المحاصرة ومراقبة الجودة للعينات CMC. أ) تحديد singlets من قبل FSC-A مقابل FSC-H مؤامرة يدل على نسبة منخفضة من singlets في عينات CMC مقارنة عينات PBMC، حتى بعد يتم عرض القائمة على تصفية CMC العزلة. ب) أمثلة لعينات ذات جودة عالية والفقراء لعدة الجودة خطوات السيطرة. المعزولة من الوقت مقابل مضان (أو SSC / FSC) يمكن تحديد القضايا معدل التدفق ويمكن استخدامها لاستبعاد الأحداث التي قد تؤدي إلى تلطيخ التحف. قد أو قد لا يكون التعرف على السكان لمفاوية على أساس FSC مقابل SSC بسهولة اعتمادا على العينة. إدراج صبغة الجدوى أمر بالغ الأهمية، كما قد تحتوي على بعض عينات خلايا قابلة للحياة أقل من 50٪. Viabili تاي (أمين رد الفعل) الأصباغ وصمة عار الخلايا الميتة أكثر الزاهية من الخلايا الحية، وفقدان النزاهة الغشاء عند موت الخلية يسمح للصبغة للوصول مجموعات أمين على البروتينات داخل الخلية. وبالتالي يتم تحديد خلايا قابلة للحياة بواسطة تبوب على بقاء السكان صبغة سلبية.
الشكل 3. تحديد مجموعات فرعية T الخلية. أ) CD3 + السكان بين عينات CMC عموما نسبة أقل من البوابة اللمفاويات مقارنة عينات PBMC. عينات CMC هي أيضا أكثر تنوعا في حجم السكان الخلايا التائية، كما هو مبين. B) CD4 +، CD8 + CD4 و-CD8-T السكان الخلية يتم التعرف عليها بسهولة في كل من CMC وعينات PBMC. CD4: نسبة الخلايا CD8 T يمكن أن تختلف من عينة لعينة بين المجالس البلدية للأطفال، كما هو مبين. وقد تم جمع البيانات الواردة من النساء غير المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.
س: together.within المحافظة على صفحة = "دائما"> 
الشكل 4. الظواهر الخلايا التائية في عينات CMC. أ) الغشاء المخاطي المرتبطة خلايا T ثابتة (MAIT) CD8 + + + CD161 السكان التي يتم التعرف عليها بسهولة في عينات PBMC يكاد يكون غائبا تماما في المجالس البلدية للأطفال. يمكن تحديد خلايا CD8 + T + CD161 في كل العينات. B) المعرض المجالس البلدية للأطفال التعبير عن علامات المظهرية بما في ذلك CD69، HLA DR، CCR5 وPD-1. ووضعت بوابات على أساس مضان ناقص واحد (FMO) الضوابط. وقد تم جمع البيانات الواردة من النساء غير المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.
| المجالس البلدية للأطفال | PBMCs | |||||
| عدد السكان | فيروس نقص المناعة البشرية + (ن = 34) | فيروس نقص المناعة البشرية (ن = 44) | قيمة P ل | فيروس نقص المناعة البشرية + (ن = 28) | فيروس نقص المناعة البشرية (ن = 35) | قيمة P ل |
| الوسيط (الربعية) | الوسيط (الربعية) | الوسيط (الربعية) | الوسيط (الربعية) | |||
| ٪ لايف الخلايا الليمفاوية | 85،65 (60.25-92.63) | 88،70 (74.85-95.38) | 0.1193 | - | - | |
| ٪ CD3 + الخلايا اللمفاوية في بوابة الحية | 5،94 (0.90-16.80) | 1.44 (0،39-8،46) | 0.0303 | 41،15 (17.08-62.10) | 41،90 (20.40-51.30) | 0.4231 |
| قيمة ع ب | <0.0001 | <0.0001 | ||||
| CD8 +٪ في CD3 + البوابة | 43،20 (25.75-66.00) | 25،60 (21.50-33.80) | 0.001 | 30،05 (22.75-38.78) | 14،60 (8.01-24.80) | <0.0001 |
| قيمة ع ب | 0.0291 | <0.0001 | ||||
| ٪ CD4 + في + CD3 البوابة | 31،10 (20.45-63.10) | 55،30 (50.53-68.18) | 0.0003 | 56،10 (50.10-61.28) | 77،20 (65.90-92.80) | <0.0001 |
| قيمة ع ب | 0.002 | <0.0001 | ||||
| نسبة CD4: CD8 | 0.71 (0،31-2،45) | 2.09 (1،55-3،01) | 0.0003 | 1.92 (1،44-2،39) | 5،34 (2.66-10.77) | <0.0001 |
| قيمة ع ب | 0.004 | <0.0001 | ||||
| DN٪ في CD3 + البوابة | 10،40 (6.36-14.30) | 10،70 (6.76-19.10) | 0.4793 | 9،58 (6.65-15.98) | 7.01 (5،26-8،07) | 0.0032 |
القيمة ع | 0.8338 | 0.0006 | | ||||
الجدول 1. نسب النسبية للT مجموعات فرعية خلية في المجالس البلدية للأطفال وPBMCs. CMCsamples من 44 فيروس نقص المناعة البشرية السلبية و34 المشتغلات بالجنس بفيروس نقص المناعة البشرية وعينات PBMC من 35 فيروس نقص المناعة البشرية السلبية وتمت مقارنة 28-ايجابيات فيروس نقص المناعة البشرية لنسبة النسبية من الخلايا الحية، وخلايا CD3 + T وCD4 +، CD8 + و CD8-CD4-DN T مجموعات فرعية الخلية. يتم عرض البيانات كما وسيطة (25 -75 ال ال الربيعي، الربعية). تم حساب الفروق بين الجماعات التي كتبها مان ويتني الاختبار. القيم ص تشير نتائج المقارنة بين فيروس نقص المناعة البشرية وفيروس نقص المناعة البشرية + أو ب CMC وPBMC البيانات.
| الحليلة | يعني (الأمراض المنقولة جنسيا ديف.) | |
| جزء من الغرام / مل | جزء من الغرام / مل | |
| MIP-3A | 35.5 (90.6) | 2.9 |
| MIG | 1447 (3026) | 19.4 |
| ITAC | 2.7 (6.3) | 0.8 |
| Fractalkine | 51.6 (69.5) | 10.6 |
| الإنترفيرون A2 | 24.0 (12.0) | 40.6 |
| الإنترفيرون ز | 3.9 (14.2) | 0.3 | IL-1A | 268.4 (721.3) | 6.4 |
| IL-1B | 46.8 (126.2) | 0.7 |
| IL-1RA | 4967.0 (3597) | 5.5 |
| IL-2 | 0.9 (2.6) | 0.6 |
| IL-6 | 14.8 (30.5) | 0.7 |
| IL-7 | 6.3 (10.1) | 0.1 |
| IL-8 | 1491 (2126) | 0.3 |
| 4.5 (8.6) | 0.5 | |
| IL-15 | 1.4 (2.7) | 0.7 |
| IL-17 | 1.1 (2.2) | 0.3 |
| IP-10 | 381.4 (1100) | 2.2 |
| MCP-1 | 129.4 (340.4) | 1.6 |
| MCP-3 | 5.9 (7.1) | 3.7 |
| حركة التغيير الديمقراطي | 84.2 (94.6) | 6.9 |
| MIP-1A 20.9 (28.9) | 6.4 | |
| MIP-1B | 28.5 (42.6) | 8.9 |
| sCD40L | 10.8 (19.3) | 9 |
| سيل-2Ra | 8.4 (9.8) | 7.7 |
| TNF-A | 1.9 (4.1) | 0.1 |
الجدول 2. التعبير عن السيتوكينات و chemokines في CVL. ويعاير عينات من 51 غير المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (غير الحصن) المشاركين في الفوج الإناث المشتغلات بالجنس في دورة منتصف الدورة الشهرية لتركيز خلوى / chemokine باستخدام Milliplex MAP خلوى الإنسان / Chemokine حبة طقم مجموعة وفقا لالصانع'ق بروتوكول بين عشية وضحاها، يعاير في مكررة. الإنترفيرون: مضاد للفيروسات؛ MCP: البروتين الكيميائي الوحيدات؛ حركة التغيير الديمقراطي: كيموكينات البلاعم المشتقة، ق: القابلة للذوبان؛ TNF: عامل نخر الورم؛ MIP: البروتين التهابات البلاعم؛ ITAC: انترفيرون ألفا inductible T خلية جاذب كيميائي؛ MIG: monokine الناجمة عن انترفيرون غاما؛ IP-10؛ الانترفيرون inductible البروتين. على القيم أقل من الحد من الكشف تم تعيين قيمة نصف الحد من الكشف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نظرا للفجوات كبيرة في المعرفة فيما يتعلق بالحصانة في المسالك التناسلية للإناث (FGT)، ويمكن تحليل المظهري من المجالس البلدية للأطفال توفر مجموعة واسعة من نظرة ثاقبة السكان اللمفاويات متعددة في عنق الرحم. إلى جانب تحليل البروتين والقياسات الحمل الفيروسي في غسل عنق الرحم، والحصانة للإصابة بالأمراض المنقولة جنسيا (STI) ق ومسببات الأمراض الأخرى يمكن تشريح في مختلف السكان.
الاعتبارات التقنية - المجالس البلدية للأطفال: العزلة وتلطيخ الناجح لعينات CMC يمكن أن يكون تحديا. وقد أكدت تعظيم الاستفادة من بروتوكول جمع CMC فعالية جمع CVL الأولى، تليها مكشطة عنق الرحم ثم أخيرا cytobrush. فمن المهم لزيادة حجم العينة المخططة مقارنة بتلك التي تحسب للدراسات الدموية المحيطية بسبب زيادة احتمال الاستبعاد عينة لمجموعة متنوعة من الأسباب، وناقش أدناه.
اختبار الرغبةلوحة تدفق د على عينات CMC أمر بالغ الأهمية قبل بدء الدراسة. فمن المهم رصد تألق ذاتي الخلية في عينات CMC، ولا سيما في بوابة الوحيدات. CMC تألق ذاتي في بعض القنوات يمكن أن تكون مرتفعة بالمقارنة مع PBMCs، والتي قد تؤثر النابضة ونسب الإشارة إلى الضوضاء. علاوة على ذلك، ينبغي تأكيد الفولتية الأمثل للعينات CMC إذا سبق تحديدها على عينات PBMC.
للحفاظ على سلامة البيانات، فمن المهم استبعاد العينات مع تلوث الدم أو التباس الأمراض المنقولة جنسيا. إدراج صبغة بقاء الخلية في التدفق الخلوي لوحة أمر حيوي لاستبعاد الخلايا الميتة التي تأخذ غير خصيصا الأجسام المضادة الفلورسنت. في حين أن معظم العينات هي قابلة للحياة إلى حد كبير، فإنه ليس من غير المألوف لاستبعاد 10-20٪ من الخلايا عن طريق قابلية صباغة. إذا تم التخطيط تحليل مجموعة فرعية على أساس CD4 و CD8 التعبير، فمن المهم الحصول على ما لا يقل عن 100 CD3 + الأحداث على المضي قدما في التحليل. العينات التي تم جمعها من نساء مختلفة، وحتى من نفس امرأة ر نقاط زمنية مختلفة، يمكن أن تسفر عن أعداد مختلفة من الخلايا إلى حد كبير 13.
تحليل تدفق cytometric من الخلايا الليمفاوية المخاطية غالبا ما يكون أسهل وأكثر نجاحا إذا كان يمكن تشغيل العينة الضابطة PBMC في وقت واحد مع عينات CMC. في بعض العينات CMC، السكان اللمفاويات من الصعب تحديد من قبل FSC / النابضة SSC، ولكن إدراج عينة PBMC تعطي فكرة أفضل عن أين البوابة. حتى في عينات دون اللمفاويات واضحة FSC / السكان SSC، يمكن تحديد CD3 + متميزة السكان. إذا تمت مقاطعة الحصول على البيانات من خلال المسائل التقنية (عداد الكريات تناول انسداد، فقاعات، الخ) تبوب على مضان بمرور الوقت يمكن إزالة القطع الأثرية جمع البيانات في حين لا يزال يسمح تحليل العينة. الضوابط المناسبة مثل مضان ناقص واحد (FMO) أنابيب للبوابة التنسيب قد تحتاج إلى أن يؤديها على خلايا الدم المحيطية (PBMC) عندما يكون عدد الخلايا المطلوب هو كبير جدا لاستخدام عينات cytobrush.
ontent "> وقد أظهرت دراسات متعددة في الكشف عن استجابات الخلايا التائية مستضد محددة بين عينات CMC. يمكن أيضا أن يتسبب إنتاج السيتوكينات CMC من قبل سلطة النقد الفلسطينية / Ionomycine، فا، IFNγ ومكافحة CD3 التحفيز. أحد القيود الرئيسية من التحفيز هو CMC عدد الخلايا، مما يقلل من عدد من الشروط والضوابط التي يمكن القيام بها في العينة. ومن الضروري أيضا أن ترصد بدقة واتخاذ خطوات اضافية لمنع التلوث ثقافة الخلية. والجهاز التناسلي ليس موقع معقمة، وفي بعض الحالات المضادات الحيوية اضافية ويجب أن يضاف إلى وسائل الإعلام والثقافة لمنع نمو زائد للبكتيريا. على الرغم من أن المجالس البلدية للأطفال يمكن cryopreserved مع فقدان القليل من الجدوى، واسترداد ما يقرب من 50٪، مما يجعل العينات cryopreserved المرشحين الفقراء للدراسات التحفيز ما لم يتم التخطيط توسيع الخلية 10.الاعتبارات التقنية - CVLs: جمع CVL النتائج عادة في عينة محدودة المجلدأوميا، ومنع تحليل عدد كبير من تركيزات البروتين المتكررة ELISA. مقايسة البديل هو مجموعة حبة خلوى، التي تعتمد على منصة LUMINEX أو منصة التدفق الخلوي. هي مجموعات المضاعفة المتوفرة من عدة مصادر تجارية، والسماح للالكمي لتصل إلى 30 في التحاليل حجم العينة صغير للغاية (غالبا ~ 25 ميكرولتر). كشفت تعظيم الاستفادة من هذه المقايسات الكشف الأمثل للالتحاليل باستخدام بروتوكول الحضانة بين عشية وضحاها. بعض التحاليل التي هي اكتشافها في عينات البلازما / مصل ليست اكتشافها في CVL. لا سيما، لم تركيز عينات CVL باستخدام الأعمدة تدور لا تحسين الكشف عن أي التحاليل، مما يشير إلى أنه ليس هناك فائدة للتركيز العينة قبل إلى تشغيل فحص مجموعة حبة.
الإرباك محددة لالغشاء المخاطي التناسلية: يجب أن دراسات FGT المناعة رعاية لتقر وتشكل العديد من المتغيرات التباس ممكن. الدورة الشهرية ساعةكما تم الآن أظهرت أن تؤثر الحصانة الدم المحيطي 28، والمرجح يمارس تأثيرات أكبر على CMC النمط الظاهري وتكوين الخلايا وكذلك البروتينات التي جمعت من عينات CVL 29. مزامنة جمع العينات لمرحلة الدورة الشهرية هي الطريقة المفضلة للحد من تقلب البيانات، سواء كانت تقاس مستويات هرمون الاستروجين / بروجستيرون أو أيام منذ اليوم الأول من الحيض الماضي. استخدام وسائل منع الحمل الهرمونية أيضا يؤثر بشكل كبير على البيئة المخاطية وينبغي أن تؤخذ تأثيرها بعين الاعتبار عند تصميم أو تحليل الدراسة. تغيير النباتات المهبل مما يؤدي إلى التهاب المهبل الجرثومي (BV) أيضا بتعديل البيئة والظواهر المناعة الخلوية. BV يمكن تشخيصها عن طريق تلطيخ غرام ويمكن أن تنشأ على درجة نوجنت للسيطرة للتأثير الخلط بين BV.
لديها النشاط الجنسي أيضا أثر عميق في علم المناعة التناسلية، منذ ألو استجابات إلى السائل المنوي يمكن أن تحدث تغييرات سريعة وجذرية في سلل النمط الظاهري والاتجار بها. في الواقع، Lajoie وآخرون. وقد وصفت اختلافات في تكوين البروتين CVL بين عامل الجنس والسكان عامل غير الجنس، مع التغييرات التي تحدث في السنوات القليلة الأولى بعد بدء العمل في مجال الجنس.
أخيرا، سوف الممارسات الثقافية مثل الغسل إدخال مزيد من الاختلاف في أخذ العينات المخاطية. اعتمادا على استخدام كاشف (التبييض، المنظفات، عصير الليمون، الخ)، والغسل قد يقلل من تردد / النمط الظاهري من سكان الخلية، أو تغيير تألق ذاتي بالمقارنة مع عينات أخرى. من الناحية المثالية، ينبغي تثبيط الغسل قبل cytobrush أخذ العينات بين الجهات المانحة.
التطبيقات المستقبلية: بالإضافة إلى العائد نظرة متبصرة في تنظيم حصانة خلال الطمث / الهرمونية التباين، والعدوى الفيروسية / البكتيرية وقبل / بعد انقطاع الطمث، وتحليل عينات المخاطية هو ذات الصلة ولا سيما لقاح ضد الأمراض المنقولة جنسيا دراسات / مسببات الأمراض المخاطية. في حالة فيروس نقص المناعة البشرية،حيث هدفا رئيسيا من الدراسات اللقاح لانتزاع الأجسام المضادة المخاطية أو استجابة الخلايا T، وسوف تطور المقايسات مقرها CMC-تلعب دورا حاسما في تحديد علاقات الحماية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S.
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
