Coleção, isolamento e Citometria de Fluxo de Análise de Amostras endocervix Humano

Summary

O uso de amostragem em escova citocitária para coletar linfócitos e monócitos da endocérvice é uma técnica minimamente invasiva que fornece amostras para análise da imunidade do trato genital feminino. Neste protocolo, descrevemos a coleta de amostras de cytobrush e o isolamento de células imunes para ensaios de citometria de fluxo.

Abstract

Apesar da importância dos patógenos da mucosa para a saúde pública (incluindo o HIV), relativamente pouco se sabe sobre a imunidade da mucosa, particularmente no trato genital feminino (FGT). Como a transmissão heterossexual agora representa o mecanismo dominante de transmissão do HIV, e dada a disseminação contínua de infecções sexualmente transmissíveis (DSTs), é fundamental entender a interação entre hospedeiro e patógeno na mucosa genital. As lacunas substanciais no conhecimento sobre a imunidade ao FGT são parcialmente devidas à dificuldade em coletar e processar amostras de mucosa com sucesso. Para facilitar estudos com tamanho amostral suficiente, as técnicas de coleta devem ser minimamente invasivas e eficientes. Para tanto, foi otimizado um protocolo para a coleta de amostras de escova citográfica cervical e posterior isolamento de células mononucleares cervicais (CMC). Usando imunofenotipagem baseada em citometria de fluxo ex vivo, é possível quantificar com precisão e confiabilidade as frequências e fenótipos da população de linfócitos/monócitos CMC. Essa técnica pode ser acoplada à coleta de lavagem cérvico-vaginal (CVL), que contém mediadores imunológicos solúveis, incluindo citocinas, quimiocinas e antiproteases, que podem ser usadas para determinar o ambiente anti ou pró-inflamatório na vagina.

Introduction

A maioria das novas infecções pelo HIV em todo o mundo surgem através de transmissão heterossexual, com as mulheres representando 47% das novas infecções em 2011 (UNAIDS ^1). Compreender o trato genital feminino (FGT), um dos principais portais de entrada para o HIV e outros patógenos sexualmente transmissíveis, é de grande importância no caminho para encontrar estratégias eficazes para prevenir a infecção. As respostas imunitárias a mucosa genital são claramente único e diferem dos que foram medidos no sangue periférico ^2. No entanto, o conhecimento atual sobre a dinâmica do sistema imunológico no FGT é limitada na melhor das hipóteses. Até o mo....

Protocol

Declaração de ética: a ética conselhos de administração da Universidade de Manitoba e Kenyatta National Hospital / Universidade de Nairobi de pesquisa aprovado este estudo e consentimento informado foi obtido de todos os participantes do estudo.

1. Preparação de Mídia e CMC Coleção Tubes

1. Preparar a solução (PBS) (NaCl 137,93 mM, KCl 2,67 mM, 8,1 mM de Na ₂ HPO _4, 1,47 mM, KH ₂ PO ₄₎ tampão fosfato salino. Autoclave para esterilidade. Este pode ser armazenado a 4 ° C durante vários meses.
2. Pré-alíquota de 5 ml PBS em 50 ml tubo falcon (uma por amostra a ser coletado) e armazen....

Results

Citometria de fluxo Multi é uma poderosa ferramenta para dissecar os fenótipos e funções de subpopulações de células em tecidos previamente descaracterizados. Análise de amostras de CMC pode render informações sobre ambos linfócitos e monócitos populações com as estratégias de propagação apropriados.

Uma estratégia de propagação CMC representativo, em comparação com um perfil combinado de PBMC, é mostrada na Figura 2. O FSC-A versus FSC-H trama permite a exclusão de dupletos.......

Discussion

Dadas as grandes lacunas de conhecimento no que diz respeito à imunidade no trato genital feminino (FGT), análise fenotípica de CMC pode fornecer uma ampla gama de conhecimentos em várias populações linfocitárias no colo do útero. Juntamente com análise proteômica e medições da carga viral no lavado cervical, imunidade a infecções sexualmente transmissíveis (IST) s e outros patógenos pode ser dissecada em várias populações.

Considerações técnicas - CMC: O isolamento ea color.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μ filtro de células m para tubo Falcon de 50 ml	BD	352360	processamento CMC
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	processamento CMC
Soro bovino fetal	Tecnologia de vida	16000044	processamento de CMC
Fungizone	Tecnologia de vida	15290-018	Processamento de
penicilina/estreptomicina	Sigma	P4333-20ml	Processamento CMC
Tubo Falcon de 50 ml	Fisher	14-959-49A	Processamento CMC Pipeta
de transferência descartável para banco de sangue	Fisher	13-711-6M	Processamento CMC
Cytobrush plus	Cooper cirúrgico	C0121	Amostragem CMC
Raspador cervical descartável	Amostragem médica rápida	2183	CMC
15 ml Tubo Falcon	Fisher	14-959-70c	Processamento CVL tubo de
1,5 ml Eppendorf	Fisher	05-402-18	Armazenamento
CBL LIVE/DEAD Kit de coloração de células fixáveis	Invitrogen	Reagente	citometria de fluxo
Tampão de fixação (4% PFA)	BD	554655	Citometria de fluxo regeante
IgG camundongo Sigma		I8765	Regeant de citometria de fluxo