Introduction
La maggior parte delle nuove infezioni da HIV in tutto il mondo nascono attraverso la trasmissione eterosessuale, con le donne rappresentano il 47% delle nuove infezioni nel 2011 (UNAIDS 1). Comprendere il tratto genitale femminile (FGT), uno dei principali portali di ingresso per l'HIV e di altri agenti patogeni a trasmissione sessuale, è di grande importanza nel cammino per trovare strategie efficaci per prevenire l'infezione. Risposte immunitarie alla mucosa genitale sono chiaramente unico e differiscono da quelli misurati nel sangue periferico 2. Tuttavia, l'attuale conoscenza delle dinamiche immunodeficienza al FGT è limitata al meglio. Ad oggi, gli studi di ambiente immunitario della mucosa hanno in gran parte concentrata sui tessuti linfoidi dell'intestino associato (GALT), dove è diventato chiaro che i primi eventi nei tessuti della mucosa seguenti infezioni hanno un forte impatto sulla successiva progressione della malattia 3,4. Raccolta dei campioni dalla mucosa genitale rappresenta una grande sfida ed è almeno parzialmente responsabile del lack di comprensione della immunologia del FGT. Risolvere il puzzle della dinamica immunitario tra ospite e patogeno nel contesto dell'ambiente distinto che è il FGT richiede metodi efficienti per raccogliere e analizzare campioni di questo locale.
Il FGT è divisa in due sezioni: il tratto riproduttivo superiore che comprende le tube di Falloppio, endometrio e endocervice, e il tratto inferiore che contiene la portio e la vagina (recensito da Kaushic et al 5). Non è ancora chiaro quanto il contributo relativo di questi diversi siti è all'HIV, ma si ritiene che entrambi i siti possono contribuire a voce HIV 6. Cellule T rappresentano il 40-50% dei leucociti nei tratti riproduttivi superiori e inferiori, mentre macrofagi costituiscono circa il 10% (recensito in Rodriguez-Garcia et al 2). Cellule T possono essere rilevati nella vagina, cervice e dell'endometrio. I macrofagi sono più fortemente Localized nell'endometrio e tessuto connettivo miometrio rispetto alla cervice, anche se possono essere rilevati in entrambi i tessuti. Infine, le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) e cellule di Langerhans possono essere rilevati anche nei tessuti FGT. Il fenotipo e proporzioni delle popolazioni immunitarie e la loro suscettibilità alle infezioni da HIV possono variare importante secondo cicli ormonali, l'uso di contraccettivi ormonali, vaginosi batterica o attività sessuali 5,7-9.
Diversi metodi sono stati sviluppati per studiare le popolazioni immunitarie e l'ambiente del FGT. Biopsia cervicale, cytobrushes cervicale e lavaggi cervico-vaginale (CVL), 10-12 sono i più comunemente utilizzato in tutto il letteratura. Collezione CVL da PBS lavanda è il metodo più semplice e permette lo studio delle proteine modulatori immunitari, ma i risultati del rendimento delle cellule estremamente basso, e quindi non è adatto per studiare le popolazioni di cellule immunitarie del FGT 13. Campioni CVL sono, invece, very utili per valutare l'ambiente immunitario del FGT misurando l'espressione di diverse citochine, chemochine o fattori antimicrobici usando metodi quali ELISA, citochine branello matrice 14 o spettrometria di massa 15,16. Caratterizzazione delle frequenze di cellule immunitarie, fenotipi e funzioni può essere ottenuto mediante prelievo di cellule mononucleate cervicali (CMC) da cytobrush cervicale o mediante campionamento biopsia cervicale.
Campionamento biopsia cervicale è un metodo invasivo che aumenta il disagio e rischio di sanguinamento e richiede 2 a 11 giorni per guarire seguendo la procedura a seconda dello stato immunitario della donna 12. D'altra parte, cytobrushes cervicali, nonostante la minore resa di cellule raccolte, è un metodo meno invasivo e più conveniente per raccogliere le cellule immunitarie dal FGT. Entrambi i metodi possono raggiungere la stessa resa di leucociti CD45 +, ma due cytobrushes cervicali sequenziali sono necessari per avere la stessa quantità di cellule contenute in una biopsia 13. Tuttavia, il campionamento cytobrush fornisce ancora un numero accettabile di cellule (cellule + circa 5.000 CD45 / cytobrush) per ulteriore ex vivo fenotipizzazione mediante citometria di flusso 14. Inoltre, la caratterizzazione funzionale può essere effettuata su questi campioni, la stimolazione e flusso intracellulare citometria o qPCR sono state effettuate utilizzando CMC cytobrush derivate per identificare HIV-specifiche risposte immunitarie 17 o polarizzazione cellulare Th 18. L'espansione della popolazione di cellule T può anche facilitare gli studi funzionali con CMC 19.
È importante notare che le biopsie e cytobrushes campionare porzioni distinte della FGT. Biopsie sono derivati dalla porzione superiore del epitelio e stroma della portio 12,13, mentre cytobrushes cervicali campionare della cervice, raccogliendo cellule derivate dall'epitelio di endocervice e presumibilmente la zona di trasformazione. Campioni Cytobrush quindi degustare un regione composto da un unico strato di epitelio colonnare, mentre biopsie, comprendono una regione rivestita da un epitelio squamoso stratificato 5. Di conseguenza, la natura delle popolazioni di leucociti raccolti da biopsia cervicale e cytobrush differisce. Biopsie raccolgono una percentuale maggiore di cellule T CD3 +, mentre cytobrushes comportano la raccolta di una maggiore percentuale di monociti CD14 + / macrofagi 13.
Studiare la immunologia della FGT è stato un interesse per molti anni 20-22 e abbiamo accumulato una grande esperienza con lo studio della CMC cytobrush-derivati. I nostri studi si concentrano principalmente sullo studio del virus HIV-infetti, non infetto e HIV-esposti sieronegativi (HESN) i lavoratori di sesso femminile da Nairobi, Kenya. HIV si replica preferenzialmente nelle cellule T attivate 23 e inferiore numero di cellule attivate che possono essere avviati da HIV nel FGT potrebbero contribuire alla protezione contro l'acquisizione HIV. In linea con questa ipotesi, diversi studies hanno descritto attivazione immunitaria più bassa tra i lavoratori di sesso HESN che sono altamente esposti al virus HIV ancora rimanere infetto 24,25, e questo fenotipo quiescente si osserva anche nel FGT 14. Qui, descriviamo la metodologia per l'elaborazione e la valutazione cellule T di attivazione nei campioni CMC derivati da cytobrushes cervicali da ex vivo citometria a flusso.
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Protocol
Dichiarazione etica: la ricerca etica consigli di amministrazione di entrambe dell'Università di Manitoba e Kenyatta Nazionale Ospedale / Università di Nairobi ha approvato questo studio e il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti allo studio.
1. Preparazione dei Media e CMC Collection Tubes
- Preparare la soluzione tampone fosfato (PBS) (137,93 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4, 1.47 mM KH 2 PO 4). Autoclave per la sterilità. Questo può essere conservato a 4 ° C per diversi mesi.
- Pre-aliquota 5 ml di soluzione in 50 ml di tubo falcon (uno per campione da raccogliere) e conservare a 4 ° C fino al momento di raccolta del campione.
- Etichettare 2-4 cryovials o provette da 1,5 ml microcentrifuga per campione per raccogliere la lavanda per la conservazione.
- Preparare cellule di coltura: RPMI 1640 + 1% di penicillina / streptomicina / amfotericina B (concentrazione finale 100 unità / ml, 100 pg / ml e 250 ng / ml, respectively, senza FCS / FBS aggiunto.
2. Insieme di Cytobrush Campioni
Raccolta di campioni cytobrush è una procedura non invasiva che deve essere eseguita da un MD o ginecologo esperto.
- Raccogliere le cellule mononucleate del collo dell'utero (CMC) utilizzando sia un cytobrush e un raschietto di legno o di plastica. Raccogliere CMC dal partecipante in esame speculum inserendo il raschietto e ruotando attorno al canale cervicale (Figura 1). Inserire il cytobrush nell'OS endocervicale, ruotare di 360 °, e collocare immediatamente sia il cytobrush e raschietto nel tubo falcon da 50 ml contenente 5 ml di PBS.
- Conservare i campioni in ghiaccio / a 4 ° C fino al trattamento. Per mantenere la vitalità cellulare, campioni di processo entro 2 ore dal prelievo.
- Se possibile, raccogliere campioni di sangue compensate in vacutainer eparina top verde di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) isolamento per servire come un comparatore / controllo per l'analisi CMC.
3. Isolamento di CMC
Eseguire l'elaborazione del campione in un laboratorio di biosicurezza di livello 2, in un armadio biosicurezza sterile con doppi guanti.
- Durante la raccolta, i campioni CMC possono diventare contaminati con sangue. Escludere campioni con contaminazione sangue visibile dallo studio per evitare confusione inclusione di PBMC nel campione finale. A causa del basso numero di linfociti isolati da campioni CMC, la contaminazione del sangue minore può facilmente sopraffare il componente linfociti CMC.
- Tubi Vortex falco contenenti sia il cytobrush e raschietto per 45 secondi di dissociare le cellule dalle spazzole. I campioni possono diventare spumosa durante questo processo; questo è normale.
- Utilizzare il cytobrush per raschiare tutto il materiale residuo fuori il raschietto, e scartare il raschietto in una soluzione di candeggina. Per raccogliere le eventuali cellule rimanendo attaccati alla spazzola / raschietto, usare un guanto fresco per spremere il raschietto tra il pollice e l'indice.Scivolare giù il pennello, permettendo alle cellule e PBS da rilevare nella stessa provetta 50 ml. Eliminare il cytobrush in una soluzione di candeggina, e gettare il guanto.
IMPORTANTE: utilizzare un nuovo guanto per ogni campione. - Montare un 100 micron filtro cella nylon a un nuovo 50 ml tubo falcon. Usando una pipetta di trasferimento, raccogliere la sospensione PBS-cella dal tubo campione e filtrare attraverso il filtro nel tubo fresco.
- Aggiungere 5 ml di RPMI 1640 alla provetta campione originale. Utilizzando la pipetta di trasferimento, lavare i lati del tubo campione con il RPMI e le trasferisce attraverso il filtro per il nuovo tubo di raccolta. Lavare la parte inferiore del filtro di nylon con il RPMI pure.
- Centrifugare i campioni per 10 min a 514 x g. E 'fondamentale per liberare il freno centrifuga durante questa fase, al fine di evitare stacchi del pellet CMC.
- Rimuovere delicatamente il surnatante dal tubo, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Dimensione pellet sarà molto variabile; in modome campioni, il pellet è abbastanza grande per la presenza di un gran numero di cellule epiteliali, mentre in altri casi, il pellet è appena visibile ed altamente trasparente.
- Risospendere il pellet da lieve agitazione del tubo falco. Aggiungere 5 ml di PBS per lavare il campione.
- Centrifuga nuovamente per 10 min a 514 xg senza freno centrifuga.
- Eliminare attentamente il supernatante e risospendere il pellet come sopra. Le cellule sono pronte sia per la crioconservazione (utilizzando un protocollo di crioconservazione PBMC), la stimolazione o citometria a flusso fenotipizzazione.
4. CMC colorazione superficiale e Citometria a Flusso
- Risospendere il pellet dal punto 3.10 in 100 ml di soluzione bloccante e trasferire sia in una piastra a 96 pozzetti o il tubo FACS. La soluzione bloccante (per bloccare i recettori Fcy) ricetta è la seguente: IgG murine 1,8 ml (concentrazione finale 0,2 mg / mL), 5 microlitri FBS e 93,2 microlitri FACS lavaggio (PBS +2% FBS).La colorazione può essere eseguita in una piastra a 96 se formati pellet sono abbastanza piccole, ma può avere bisogno di essere eseguita in tubi FACS se pellets sono ordinariamente grande. E 'importante per titolare anticorpi conseguenza.
- Bloccare i campioni per 10 min in ghiaccio / a 4 ° C.
- Lavare le cellule con 100 ml di FACS lavaggio (PBS 2% FBS) in piastre a 96 pozzetti, o 500 ml in tubi FACS. Centrifugare a 600 xg per 10 min a 4 ° C con il freno a basso (o fuori, se una regolazione del freno basso non è disponibile).
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare mediante agitazione. Aggiungi vitalità Stain (Live Morto risolvibile vitalità colorante). Preparare la redditività colorante secondo le istruzioni del produttore. Potrebbe essere necessario titolato per l'uso in ogni impostazione del laboratorio / citometro. Incubare per 30 minuti al buio a 4 ° C.
- Lavare le cellule μl/500 100 ml di PBS (per i tubi targa / FACS 96 pozzetti). Centrifugare a 600 xg per 10 min a basso / senza freno. Rimuovere supernatant e risospendere le cellule.
- Incubare le cellule con il cocktail di anticorpi marcatori di superficie, in un volume totale di 100 microlitri. IMPORTANTE: Ottimizzare e titolare ogni citometria a flusso pannello prima di assaggiare colorazione. Incubare le cellule per 30 minuti al buio a 4 ° C.
- Ripetere passo 4.5. Se la colorazione in una piastra da 96 pozzetti, le cellule di trasferimento ad un tubo FACS e portare a un volume finale di 750 ml di FACS lavaggio contenente 1% paraformaldeide (PFA) (o CytoFix, diluito 1 a 4). Procedere all'acquisizione dati su un citometro a flusso.
5. Raccolta e preparazione del collo dell'utero vaginale del lavaggio (CVL)
- Prima cytobrush campionamento, utilizzare una siringa per lavare il endocervice con 2 ml di PBS sterile e aspirare il lavaggio del fornice posteriore.
- Raccogliere il campione di lavaggio aspirato in un tubo da 15 ml falco e tenere in ghiaccio / a 4 ° C fino al trattamento.
- Campione centrifugare a 400 xg per 7 minuti per rimuovere detriti cellulari.
- Collect il surnatante, un'aliquota del campione in 1 ml o 500 microlitri aliquote e conservare a -70 ° C. Aliquote possono essere scongelati per l'ELISA o l'analisi di matrice cordone di proteine CVL, ma evitano cicli multipli di congelamento / scongelamento.
- Se lo si desidera, risospendere il pellet di RNA detriti cellulari in seguito a misurare l'espressione di RNA seguendo il protocollo del produttore.
6. Acquisizione Dati
- Preparare una serie di tubi di compensazione che corrisponde al pannello di anticorpi. Eseguire i tubi di compensazione per regolare sovrapposizione spettrale. Eseguire i campioni su una qualsiasi flusso multicolore citometro che è configurato per gli anticorpi coniugati con fluorocromi utilizzati nel pannello.
- Acquisire un campione PBMC prima di regolare Forward Scatter (FSC) e Side Scatter (SSC) della tensione, al fine di rilevare la popolazione linfocitaria. Cercate di tenerli a 100 su ciascun asse su una scala lineare. Esecuzione di un controllo PBMC renderà molto più facile trovare la popolazione linfocitaria CMC.
- La soglia FSC per campioni CMC può essere necessario aumentare rispetto ai campioni di PBMC causa spalmare fino all'asse SSC a bassi valori FSC.
- Agitare ogni provetta prima di acquistare. Acquisire l'intero tubo per massimizzare il numero di eventi cancello linfociti raccolti. Monitorare attentamente la macchina per evitare intasamenti.
- Esportare i dati in un programma di analisi di citometria a flusso, come FlowJo.
7. Strategia di gating
- Selezionare Forward scatter lato alto (FSC-H) / Forward Area side scatter (FSC-A) per determinare la popolazione singoletto.
- Selezionare Ora contro marcatore fluorescente (come ad esempio FITC) per controllare la qualità di acquisizione. Variazione della portata può introdurre artefatti nei dati. Escludere qualsiasi area che mostra discrepanza nei portata.
- Identificare la popolazione linfocitaria su SSC-A/FSC-A trama. Utilizzare un controllo PBMC per facilitare l'identificazione. Si noti che la popolazione linfocitaria CMC potrebbe non essere chiaro come il controllo PBMC. </ Li>
- Gate SSC-A/viability tintura di escludere le cellule morte da cellule vive. Le cellule morte possono non specificamente incorporare gli anticorpi, che introdurrà artefatti.
- Porta sul SSC-A/CD3 per identificare la popolazione di cellule T. Da questa porta, individuare le popolazioni CD4 + e CD8 +.
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Representative Results
Flusso multiparametrica citometria è un potente strumento per analizzare i fenotipi e le funzioni dei sottoinsiemi di cellule in tessuti precedentemente non caratterizzati. Analisi dei campioni CMC può dare informazioni sia su linfociti e monociti popolazioni con le strategie di gating adeguate.
Un rappresentante CMC strategia gating, rispetto ad un profilo PBMC abbinato, è mostrato in Figura 2. L'FSC-A piuttosto FSC-H trama consente l'esclusione di doppietti cellulari, che sono altamente prevalenti nei campioni CMC rispetto al PBMC, anche dopo filtrazione (Figura 2A). Controllo di qualità comprende la rimozione di problemi di flusso da gating in tempo, in cui i cambiamenti di portata o artefatti dovuti a macchie di esempio possono essere facilmente identificati (Figura 2B). Identificazione delle popolazioni di linfociti / monociti è relativamente simile sia PBMC e campioni CMC (Figura 2B). Esclusione di cellule morte dalla vitalità colorante impedisce l'inclusionecelle di apoptosi che hanno non specificamente assunte coniugati di anticorpi fluorescenti. Vitalità è bassa in campioni CMC rispetto al PBMC, e può essere altamente variabile da campione a campione (Figura 2B).
Questa analisi si concentrerà sulla fenotipizzazione popolazione di linfociti T, ma campioni CMC contenere anche monociti. Dopo gating sulla popolazione monociti, cellule sono gated sulla base di un colorante vitalità ed un canale di scarico (Figura 3A). Il canale dump contiene anticorpi contro CD56, CD3 e CD19, e gating sulle cellule canale-negativo discarica eliminerà qualsiasi contaminazione dei linfociti nella popolazione dei monociti. Cellule possono quindi essere identificati in base all'espressione di marcatori quali CD16 e CD11c. La popolazione di linfociti CD3 + è tipicamente ridotto in proporzione tra CMC rispetto al PBMC (Figura 3B, Tabella 1). L'alta percentuale di cellule epiteliali, granulociti e leucociti CD45 + non CD3 + contenute in campioni CMC dominates sulla popolazione di cellule T. Cellule T CD4 + (mediana: 55.30%, IQR: 50.53% -68,18%) e di cellule T CD8 + (mediana: 25.60%, IQR: 21,50% -33,80%) si trovano in un rapporto più basso (più vicino a 2:1 tra CMC) rispetto al rapporto 5:1 osservata tra i campioni di PBMC sani appartenenti alla coorte dei lavoratori del sesso in Kenya (Figura 3C, tabella 1). Come nel sangue, infezione da HIV colpisce le proporzioni di CD4 + e CD8 + T tra CMC, diminuendo il CD4 +: CD8 + rapporto di 0,7 (mediana: 0,7, IQR: 0,31-2,45) (Figura 3C, Tabella 1). Tuttavia, non è raro osservare una maggiore percentuale di cellule T CD8 + nelle popolazioni CMC provenienti da individui sani (Figura 3C). È interessante notare che, un esteso CD4-CD8-(doppio negativo, DN) T popolazione di cellule rispetto alla frequenza di cellule PBMC DN T può essere osservata tra i molti campioni CMC di individui HIV-negativi (Tabella 1). Questi risultati sono simili a quelli ottenuti per i campioni prepuzio 26, although queste cellule sono scarsamente caratterizzati.
Tipici marcatori fenotipici delle cellule T sono facilmente quantificabili tra CMC ma potranno differire da PBMC; la figura 4 illustra l'identificazione di un CD8 + CD161 + + (MAIT) popolazione che è distinto in PBMC ma quasi assente in CMC (Figura 4A). L'espressione di marcatori di attivazione CD69 ed HLA DR, marcatore migrazione CCR5 o marcatori esaurimento PD-1 può essere chiaramente identificato CD4 + e CD8 + popolazioni (Figura 4B).
Quantificazione della concentrazione di citochine / chemochine in CVL può essere analizzata in parallelo con CMC colorazione. Questo permette di correlazione tra la citochina ambiente CVL (pro-infiammatoria contro immunoregulatory) e il fenotipo di CMC. Questi dati possono anche essere utilizzati per determinare se la frequenza di espressione del recettore della chemochina su CMC è legato alla espressione relativa o plasma o chemochine CVL 14. Tabella 2 </ Strong> indica la concentrazione media di citochine e chemochine analiti in CVL raccolti da donne sane e dosati con kit Milliplex matrice citochine tallone.
Figura 1. Anatomia del tratto riproduttivo femminile. A) Sezione trasversale del tratto riproduttivo femminile, che mostra la relazione della vagina per il sistema operativo esterno cervicale, canale cervicale e della cavità uterina. B) su angolo di vista della cervice, che mostra le os esterne e anteriore e posteriore fornice regioni a 12:00 e 06:00, rispettivamente. Riprodotto con il permesso di Reusch et al 27. Il raschiatore cervicale è ruotato intorno della cervice per raccogliere CMC, mentre il cytobrush viene inserito nel canale cervicale e ruotata per raccogliere ulteriori CMC. Lavande vaginali cervicali (CVL)vengono raccolte mediante lavaggio del endocervice con PBS e raccolta dal fornice posteriore.
Figura 2. Gate ed il controllo di qualità dei campioni CMC. A) Identificazione delle canottiere da FSC-A contro FSC-H plot dimostra la bassa percentuale di canottiere in campioni CMC rispetto ai campioni di PBMC, anche dopo basato su filtri CMC isolamento. B) Esempi di campioni di alta e di bassa qualità sono indicati per diverse qualità fasi di controllo. Soppressione del tempo rispetto a fluorescenza (o SSC / FSC) in grado di identificare i problemi di portata ed essere utilizzato per escludere gli eventi che possono causare artefatti di colorazione. Una popolazione linfocitaria basato su FSC rispetto SSC può o non può essere facilmente identificato seconda del campione. L'inclusione di un colorante vitalità è cruciale, come alcuni campioni possono contenere cellule vitali meno del 50%. Viability (ammina-reattiva) coloranti macchiano cellule morte più brillantemente di cellule vive, come perdita di integrità della membrana a causa di morte cellulare permette il colorante per accedere gruppi amminici sulle proteine all'interno della cellula. Cellule vitali sono quindi identificati dal gate sulla popolazione colorante negativo della redditività.
Figura 3. Identificazione di sottopopolazioni di cellule T. A) Il CD3 + popolazione tra campioni CMC è generalmente una parte minore del gate linfocitario rispetto a campioni di PBMC. CMC campioni sono anche più variabile nella dimensione della popolazione di cellule T, come mostrato. B) CD4 +, CD8 + e popolazioni di cellule CD4-CD8-T sono facilmente identificabili sia CMC e campioni di PBMC. CD4 rapporto cellulare T CD8 può variare da campione a campione tra CMC, come mostrato. I dati riportati sono stati raccolti da donne HIV-infetti.
Fenotipi cellulari Figura 4. T in campioni CMC. A) La mucosa associata cellule T invarianti (MAIT) CD8 + CD161 + + popolazione che è facilmente identificabile nei campioni di PBMC è quasi del tutto assente in CMC. Le cellule CD8 + CD161 + T possono essere identificati in entrambi i campioni. B) CMC espressione mostra di marcatori fenotipici tra cui CD69, HLA DR, CCR5 e PD-1. Gates sono state elaborate sulla base di fluorescenza meno uno (FMO) controlli. I dati riportati sono stati raccolti da donne HIV-infetti.
| CMC | PBMC | |||||
| Popolazione | HIV + (n = 34) | HIV-(n = 44) | Valore P a | HIV + (n = 28) | HIV-(n = 35) | Valore P a |
| mediana (IQR) | mediana (IQR) | mediana (IQR) | mediana (IQR) | |||
| % di linfociti in diretta | 85,65 (60,25-92,63) | 88.70 (74,85-95,38) | 0,1193 | - | - | |
| % CD3 + nel cancello di linfociti dal vivo | 5,94 (0,90-16,80) | 1,44 (0,39-8,46) | 0,0303 | 41.15 (17,08-62,10) | 41.90 (20,40-51,30) | 0,4231 |
| valore p b | <0,0001 | <0,0001 | ||||
| % CD8 + CD3 + cancello | 43.20 (25,75-66,00) | 25.60 (21,50-33,80) | 0.001 | 30.05 (22,75-38,78) | 14.60 (8,01-24,80) | <0,0001 |
| valore p b | 0,0291 | <0.0001 | ||||
| % CD4 + CD3 + cancello | 31.10 (20,45-63,10) | 55.30 (50,53-68,18) | 0,0003 | 56.10 (50,10-61,28) | 77.20 (65,90-92,80) | <0,0001 |
| valore p b | 0.002 | <0,0001 | ||||
| Rapporto CD4: CD8 | 0,71 (0,31-2,45) | 2,09 (1,55-3,01) | 0,0003 | 1,92 (1,44-2,39) | 5.34 (2,66-10,77) | <0,0001 |
| valore p b | 0.004 | <0,0001 | ||||
| % DN in CD3 + cancello | 10.40 (6,36-14,30) | 10.70 (6,76-19,10) | 0,4793 | 9.58 (6,65-15,98) | 7,01 (5,26-8,07) | 0,0032 |
valore p | 0,8338 | 0.0006 | | ||||
Tabella 1. Proporzioni relative di sottopopolazioni di cellule T in CMC e PBMC. CMCsamples da 44 HIV-negativi e 34 sieropositivi lavoratori di sesso femminile e campioni di PBMC da 35 HIV-negativi e 28 HIV-positivi sono stati confrontati per la loro relativa proporzione di cellule vive, cellule T CD3 + e CD4 +, CD8 + e CD8-CD4-DN sottopopolazioni di cellule T. I dati sono presentati come mediana (25 ° -75 ° interquartile, IQR). Le differenze tra i gruppi sono state calcolate con il test Mann-Whitney. valori di p indicano il risultato di un confronto tra un HIV-ob CMC e PBMC dati + HIV e.
| Analita | Significare un (Std dev.) | |
| pg / ml | pg / ml | |
| MIP-3a | 35.5 (90.6) | 2.9 |
| MIG | 1447 (3026) | 19.4 |
| ITAC | 2.7 (6.3) | 0.8 |
| Fractalchina | 51.6 (69.5) | 10.6 |
| IFN-a2 | 24.0 (12.0) | 40.6 |
| IFN-g | 3.9 (14.2) | 0.3 | IL-1a | 268,4 (721,3) | 6.4 |
| IL-1b | 46,8 (126,2) | 0.7 |
| IL-1ra | 4.967,0 (3597) | 5.5 |
| IL-2 | 0.9 (2.6) | 0.6 |
| IL-6 | 14.8 (30.5) | 0.7 |
| IL-7 | 6.3 (10.1) | 0.1 |
| IL-8 | 1491 (2126) | 0.3 |
| 4.5 (8.6) | 0.5 | |
| IL-15 | 1.4 (2.7) | 0.7 |
| IL-17 | 1.1 (2.2) | 0.3 |
| IP-10 | 381,4 (1100) | 2.2 |
| MCP-1 | 129,4 (340,4) | 1.6 |
| MCP-3 | 5.9 (7.1) | 3.7 |
| MDC | 84.2 (94.6) | 6.9 |
| MIP-1a 20.9 (28.9) | 6.4 | |
| MIP-1b | 28.5 (42.6) | 8.9 |
| sCD40L | 10.8 (19.3) | 9 |
| sIL-2Ra | 8.4 (9.8) | 7.7 |
| TNF-a | 1.9 (4.1) | 0.1 |
Tabella 2. Espressione di citochine e chemochine in CVL. Campioni provenienti da 51 non infetti da HIV (non HESN) i partecipanti della femmina coorte lavoratrice del sesso a metà ciclo mestruale sono stati analizzati per la concentrazione di citochine / chemochine utilizzando la citochina umana / chemochine tallone Milliplex MAPPA Kit matrice secondo il produttoreS 'protocollo durante la notte, dosati in duplicato. IFN: l'interferone; MCP: proteina chemiotattica dei monociti; MDC: chemochine macrofagi derivati, s: solubile; TNF: fattore di necrosi tumorale; MIP: proteina infiammatoria dei macrofagi; ITAC: l'interferone alfa cellule T inductible chemoattractant; MIG: monokine indotta da interferone gamma; IP-10; interferone proteina inductible. un valori al di sotto del limite di rilevazione è stato assegnato un valore di metà del limite di rilevazione.
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Discussion
Date le grandi lacune nella conoscenza per quanto riguarda l'immunità al tratto genitale femminile (FGT), analisi fenotipica di CMC in grado di fornire una vasta gamma di intuizioni più popolazioni linfocitarie alla cervice. Accoppiato con l'analisi proteomica e le misurazioni della carica virale di lavanda cervicale, l'immunità alle infezioni sessualmente trasmissibili (IST) s ed altri agenti patogeni può essere sezionato in varie popolazioni.
Considerazioni tecniche - CMC: L'isolamento e di successo colorazione dei campioni CMC può essere impegnativo. Ottimizzazione del protocollo di raccolta CMC ha sottolineato l'efficacia della raccolta CVL primo, seguito dal raschietto cervicale e infine il cytobrush. È importante aumentare le dimensioni del campione prevista rispetto a quelli calcolati per studi sangue periferico a causa della maggiore probabilità di esclusione campione per una varietà di ragioni, discussi qui di seguito.
Test del desideriopannello d flusso su campioni CMC è fondamentale prima dell'inizio dello studio. È importante monitorare autofluorescenza cellulare in campioni CMC, in particolare nel cancello monociti. CMC autofluorescenza in alcuni canali può essere elevato rispetto a PBMC, che può influenzare gating e rapporti segnale-rumore. Inoltre, le tensioni ottimali dovrebbero essere confermati per i campioni CMC se precedentemente determinato su campioni di PBMC.
Per preservare l'integrità dei dati, è importante escludere campioni con contaminazione del sangue o confondenti IST. L'inclusione di un colorante vitalità cellulare in citometria a flusso pannello è vitale per escludere cellule morte che non specificamente occupano anticorpi fluorescenti. Mentre la maggior parte dei campioni sono altamente valida, non è raro escludere 10-20% delle cellule da vitalità colorante. Se è prevista sottoinsieme di analisi basato su CD4 e CD8 espressione, è importante avere almeno 100 CD3 + eventi per procedere con l'analisi. I campioni raccolti da donne diverse, e anche dalla stessa donna, un t diversi punti di tempo, può produrre il numero di cellule molto diverse 13.
Analisi citofluorimetrica dei linfociti mucosali è spesso più facile e più successo se un campione di controllo PBMC può essere eseguito simultaneamente con i campioni CMC. In alcuni campioni CMC, la popolazione linfocitaria è difficile identificare da FSC / SSC gating, ma l'inclusione del campione PBMC darà una migliore idea di dove porta. Anche nei campioni senza una chiara linfociti FSC / SSC popolazione, CD3 + distinta popolazioni possono essere identificati. Se l'acquisizione dati viene interrotto da problemi tecnici (citometro assunzione di intasamento, bolle, ecc) gating sulla fluorescenza nel tempo può rimuovere gli artefatti di raccolta dei dati, pur consentendo l'analisi del campione. Controlli appropriati come fluorescenza meno uno (FMO) i tubi per il posizionamento cancello può essere necessario eseguita su cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) quando il numero di cellule necessario è troppo sostanziale utilizzare campioni cytobrush.
ONTENUTO "> Diversi studi hanno dimostrato l'individuazione di risposte delle cellule T antigene-specifiche tra i campioni CMC. CMC produzione di citochine può anche essere indotta da PMA / Ionomycine, PHA, IFN-y e anti-CD3 stimolazione. Uno dei principali limiti di stimolazioni CMC è numero cellulare, riducendo il numero dei condizioni e controlli che possono essere effettuati per campione. E 'anche fondamentale monitorare attentamente e prendere misure supplementari per prevenire la contaminazione coltura cellulare. tratto genitale non è un sito sterile, e in alcuni casi antibiotici supplementari deve essere aggiunto a terreni di coltura per evitare la proliferazione batterica. Sebbene CMC possono essere crioconservati con poca perdita di vitalità, il recupero è di circa il 50%, rendendo campioni crioconservati poveri candidati per gli studi di stimolazione a meno che l'espansione delle cellule è prevista 10.Considerazioni tecniche - CVLS: Collezione di CVL di solito si traduce in un campione limitato volume, impedendo l'analisi di un gran numero di concentrazioni di proteine da ripetute ELISA. Un saggio alternativa è la matrice branello citochina, basato sulla piattaforma Luminex o piattaforma di citometria a flusso. Kit multiplati sono disponibili da varie fonti commerciali, permettendo la quantificazione di fino a 30 analiti in un volume estremamente ridotto campione (spesso ~ 25 microlitri). L'ottimizzazione di questi test ha rivelato una rilevazione ottimale degli analiti utilizzando il protocollo notte di incubazione. Alcuni analiti che sono detectible in campioni di plasma / siero non sono detectible in CVL. In particolare, la concentrazione di campioni CVL utilizzando colonne di rotazione non migliora il rilevamento di eventuali analiti, suggerendo che non vi è alcun beneficio per concentrazione campione prima di eseguire il test matrice tallone.
Confondenti specifiche per la mucosa genitale: Studies di FGT immunologia devono aver cura di riconoscere e tenere conto di quante variabili confondenti come possibile. Il ciclo mestruale hcome ora dimostrato di avere un impatto sangue periferico immunità 28, e probabilmente esercita maggiore impatto sul fenotipo CMC e composizione delle cellule e le proteine raccolti campioni CVL 29. Sincronizzazione raccolta dei campioni di fase del ciclo mestruale è il modo migliore per ridurre la variabilità dei dati, sia misurata da livelli di estrogeno / progesterone o giorni dal primo giorno delle ultime mestruazioni. L'uso della contraccezione ormonale anche influenza notevolmente l'ambiente mucosa e il suo effetto deve essere tenuto in considerazione quando si progetta o analizzare uno studio. Alterazione della flora vaginale con conseguente vaginosi batterica (BV) modifica anche l'ambiente immunitario e fenotipi cellulari. BV può essere diagnosticata mediante colorazione di Gram e un punteggio di Nugent può essere stabilita per controllare l'effetto di confondimento di BV.
L'attività sessuale ha anche un profondo impatto sulla immunologia genitale, dal momento che allo-risposte sperma possono indurre cambiamenti rapidi e drammatici cell fenotipo e il traffico. Infatti, Lajoie et al. hanno descritto le differenze di CVL composizione proteica tra i sex worker e le popolazioni lavoratori non sesso, con cambiamenti che si verificano nei primi anni dopo l'inizio del lavoro sessuale.
Infine, le pratiche culturali come irrigazioni introdurrà un'ulteriore variante in prelievo della mucosa. A seconda del reagente utilizzato (candeggina, detersivo, succo di lime, ecc), irrigazioni può ridurre la frequenza / fenotipo di popolazioni di cellule, o alterare autofluorescenza rispetto ad altri campioni. Idealmente, irrigazioni prima cytobrush campionamento dovrebbe essere scoraggiato tra i donatori.
Le future applicazioni: oltre a cedere la comprensione importante nel regolamento di immunità mucosale durante mestruale / ormonale variabilità, infezione virale / batterica e prima / dopo la menopausa, l'analisi di campioni di mucosa è particolarmente rilevante per gli studi di vaccini contro IST / agenti patogeni delle mucose. Nel caso di HIV,dove uno degli obiettivi principali studi vaccino è di suscitare un anticorpo mucosale o risposta di cellule T, sviluppo di saggi basati CMC giocherà un ruolo cruciale nel determinare correlati di protezione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
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