Introduction
世界中の新たなHIV感染の大半は（UNAIDS 1）2011年に新たな感染の47％に相当女性と、異性間感染によって起こる。女性の生殖器（FGT）、HIVやその他の性感染性病原体のメインエントリポータルの1を理解すること、感染症を予防するための効率的な戦略を見つけることへのパスに非常に重要である。性器粘膜での免疫応答は、明らかに固有のものであり、末梢血2で測定されたものとは異なる。しかし、FGTの免疫動態の現在の知識は、最高の状態で制限されています。現在までに、粘膜免疫環境の研究は、主としてそれが感染後に粘膜組織における初期事象は、その後の疾患の進行3,4に強い影響を有することが明らかとなった腸管関連リンパ組織（GALT）に焦点を当ててきた。性器粘膜からサンプルを収集することは大きな課題であるとLACのために少なくとも部分的に責任があるFGTの免疫学の理解のK。 FGTはこのロケールからサンプルを収集し、分析するための効率的な方法が必要とされている特定の環境のコンテキストでのホストと病原体との間に免疫のダイナミックのパズルを解く。
FGTは2つのセクションに分かれています卵管、子宮内膜および子宮頚内膜が含まれ、上部生殖管および子宮膣部が含まれている下気道と膣（Kaushicによって審査ら 5）。これは、これらの異なる部位の相対的寄与はHIV感染症であるものはまだ不明であるが、両方の部位がHIVエントリー6に寄与し得ると考えられている。マクロファージ（ロドリゲス·ガルシアら 2に概説されている）約10％を構成しながら、T細胞は、上部および下部生殖管における白血球の40〜50％を表す。 T細胞は、膣、子宮頚部、および子宮内膜中で検出することができる。マクロファージはより強くlocaliですそれらが両方の組織で検出することができるが、子宮内膜および子宮頸部より子宮筋層の結合組織にゼット。最後に、形質細胞様樹状細胞（pDC）およびランゲルハンス細胞もFGT組織において検出することができる。表現型および免疫人口やHIV感染に対する感受性の割合がホルモンサイクルに応じて重要なのは異なる場合があり、ホルモン避妊薬、細菌性膣炎や性的活動5,7-9の使用。
多様な方法がFGTの免疫集団と環境を研究するために開発されてきた。子宮頸部生検、子宮頸cytobrushesと頸膣洗浄液（CVL）10月12日は、最も一般的に文献全体で使用されています。 PBSの洗浄によるCVLコレクションは、最も簡単な方法であり、極めて低い細胞収量の免疫調節タンパク質が、結果の研究を可能にするため、FGT 13の免疫細胞集団を研究するためには適していない。 CVLサンプルは、一方で、νある例えば、ELISA、サイトカインビーズアレイ14 15,16または質量分析などの方法を用いて種々のサイトカイン、ケモカインまたは抗菌因子の発現を測定することにより、FGTの免疫環境を評価するのに有用ERY。免疫細胞の頻度、表現型および機能の特徴付けは、子宮頸部細胞採取用ブラシによって、または子宮頸部生検サンプリングによって子宮頸部単核細胞（CMC）を収集することによって達成することができる。
子宮頸部生検標本は、出血の不快感や危険性を高めると女12の免疫状態に応じて、手順に従って癒すために2から11日かかる侵襲的な方法である。一方、子宮頸cytobrushesは、採取した細胞のより低い利回りにもかかわらず、FGTから免疫細胞を収集するための低侵襲、より便利な方法である。両方の方法は、CD45 +白血球の同じ収率に達することができるが、二つの連続子宮頸部cytobrushesが含まれる細胞と同じ量を得るために必要であるiをN 1の生検13。それにもかかわらず、細胞採取用ブラシのサンプリングは、まだ14フローサイトメトリーによるさらなるex vivoでの表現型解析のための細胞の許容数（約5000 CD45 +細胞/細胞採取用ブラシ）を提供します。刺激および細胞内フローサイトメトリーまたは定量PCRは、HIV特異的免疫応答17又はTh細胞の分極18を識別するために、細胞採取用ブラシ由来のCMCを使用して実施されているように、また、機能的な特徴付けは、これらの試料上で行うことができる。 T細胞集団の拡大はまた、CMCを19と機能的研究を容易にすることができる。
それは、生検およびcytobrushesはFGTの異なる部分をサンプリングしていることに注意することが重要である。子宮頸cytobrushesは子宮頸部、おそらく移行帯の上皮由来の細胞を集め、子宮口をサンプリングしながら、生検、子宮膣部12,13の上皮と間質の優れた部分に由来している。細胞採取用ブラシのサンプルは、そのための再サンプリング生検は、扁平重層上皮5によって裏打ち領域を含み、一方祇園は、円柱上皮の単層からなる。その結果、子宮頸部生検および細胞採取用ブラシによって収集白血球集団の性質が異なっている。 cytobrushesは、CD14 +単球/マクロファージ13の割合が高くのコレクションになるのに対し、生検では、CD3 + T細胞の割合が高く集める。
FGTの免疫学を研究することは、長年にわたって20〜22関心されており、我々は細胞採取用ブラシ由来のCMCの研究と専門知識の多くを蓄積してきました。我々の研究は、ケニアのナイロビからのHIVに感染し、感染していないと、HIV-曝露反応陰性（HESN）女性セックスワーカーの研究に主に焦点を当てています。 HIVは優先的にFGTでHIVの標的とすることができる活性化された細胞の23と下部の数字は、HIVの獲得に対する保護に貢献できる活性化したT細胞で複製。この仮説に沿って、いくつかのストゥディESは非常にHIVにさらされているHESNのセックスワーカーの免疫活性化は、まだ感染していない24,25まま下に記載されており、この静止表現型はまた、FGT 14で観察される。ここでは、処理のための方法論を記載し、ex vivoでフローサイトメトリーによって子宮頸部cytobrushes由来CMCサンプル中のT細胞の活性化を評価する。
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Protocol
倫理声明：マニトバ大学、ナイロビのケニヤッタ国立病院/大学の両方の研究倫理ボードは、この研究を承認し、書面によるインフォームドコンセントは、すべての研究参加者から得た。
1。メディアの作成およびCMCコレクションチューブ
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（137.93のNaCl、2.67 mMの塩化カリウム、8.1ミリモルのNa 2 HPO 4、1.47 mMのKH 2 PO 4）を調製する。無菌性のためのオートクレーブ。これは、数ヶ月間、4℃で保存することができる。
- 事前に分量5ミリリットルのPBS 4ºCで50ミリリットルファルコンチューブ（サンプルあたり1を収集するため）、ストアにサンプル採取時まで。
- ストレージ用洗浄液を収集するために、サンプルあたり2-4凍結バイアルまたは1.5 mlマイクロチューブにラベルを付けます。
- 細胞培養培地を調製する：RPMI 1640 + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンB（終濃度100単位/ ml、100μg/ mlの250 ng / mlで、respectivイーリー、無FCSを/ FBSを追加しました。
細胞採取用ブラシのサンプルの2。コレクション
細胞採取用ブラシサンプルの採取は、訓練されたMDや婦人科医によって行われなければならない非侵襲的な処置である。
- 細胞採取用ブラシ、木製やプラスチック製のスクレーパーの両方を使用して子宮頸核細胞（CMC）を収集します。 （ 図1）スクレーパーを挿入し、子宮口の周りに回転させることによって、膣鏡検査中の参加者から、CMCを収集します。 、子宮頸管OSに細胞採取用ブラシを挿入して360°回転し、すぐに5mlのPBSを含む50ミリリットルファルコンチューブに細胞採取用ブラシとスクレーパーの両方を置く。
- 処理まで4℃で氷/上のサンプルを保管してください。採取後2時間以内に細胞生存率は、処理のサンプルを維持する。
- 可能な場合は、末梢血単核細胞CMC分析のための比較器/制御として機能する（PBMC）を単離するためのグリーントップヘパリンバキュテナー内の一致した血液サンプルを採取。
CMCで3。分離
二重の手袋で、無菌バイオセーフティキャビネット内で、バイオセーフティーレベル2実験室でサンプル処理を実行します。
- 収集中に、CMC試料としては、血液で汚染になることができます。最終的なサンプル中のPBMCの交絡混入を防止するために、調査から見える血液汚染を有するサンプルを除外します。により、CMC試料から単離したリンパ球の数が少ないと、マイナー血液汚染を簡単に、CMCリンパコンポーネントを圧倒することができます。
- ブラシから細胞を解離させるために45秒間細胞採取用ブラシとスクレーパーの両方を含む渦ファルコンチューブ。サンプルは、このプロセスの間に、泡状になることがあり;これは正常です。
- スクレーパーオフ任意の残りの材料をこすり、及び漂白液にスクレーパーを廃棄するように細胞採取用ブラシを使用しています。ブラシ/スクレーパーに付着したまま任意の細胞を収集するには、親指と人差し指の間にスクレーパーを圧迫する新鮮な手袋を使用しています。セルおよびPBSを同じ50mlチューブに収集することができるように、ブラシを下にスライドさせます。漂白剤溶液に細胞採取用ブラシを破棄し、手袋を破棄。
重要：各サンプルのために新しい手袋を使用してください。 - 新しい50mlファルコンチューブに100μmのナイロン細胞ストレーナーを取り付けます。トランスファーピペットを用いて、サンプルチューブからPBS-細胞懸濁液を回収し、新鮮なチューブにストレーナーを通して濾過する。
- オリジナルのサンプルチューブに、RPMI 1640の5ミリリットルを追加します。トランスファーピペットを用いて、RPMIで試料管の側面を洗浄し、新しい収集管にフィルターを介して移す。だけでなく、RPMIでナイロンフィルターの底部を洗浄します。
- 遠心分離機514 x gで10分間サンプル。これは、CMCペレットの脱落を防止するために、このステップの間に遠心ブレーキを切ったままにすることが重要である。
- 優しくペレットを乱さないように注意しながら、チューブから上清を除去。ペレットサイズは非常に変化になります。その中で他の場合には、ペレットはほとんど見えかつ高度に透明である間、私試料ペレットを、上皮細胞の多数の存在に起因する非常に大きい。
- ファルコンチューブを穏やかに攪拌することによりペレットを再懸濁。サンプルを洗浄するために、PBSの5ミリリットルを追加します。
- 無遠心ブレーキを514×gで10分間、再び遠心分離します。
- 慎重に上清を廃棄し、上記のようにペレットを再懸濁。細胞（PBMCの凍結保存プロトコルを使用して）凍結保存、刺激または表現型フローサイトメトリーのどちらかの準備ができている。
4。のCMC表面染色およびフローサイトメトリー
- ブロッキング溶液100μl中、ステップ3.10からペレットを再懸濁し、96ウェルプレートまたはFACSチューブに移すのいずれか。ブロッキング溶液（Fcγ受容体をブロックするには）次のようにレシピがある：1.8μlのマウスIgG（最終濃度0.2μgの/μL）、5μlのFBSおよび93.2μlのFACS洗浄（PBS +2％FBS）。染色は、ペレットの大きさが十分に小さい場合には、96ウェルプレートで行うことができるが、ペレットが日常的に大きい場合FACSチューブ中で行われる必要があり得る。それに応じて、抗体を滴定することが重要です。
- 4℃にて/氷上で10分間サンプルをブロック
- FACSチューブに96ウェルプレート、または500μlのFACSウォッシュ（PBS +2％FBS）100μlで細胞を洗浄。低オンブレーキと4℃で10分間600×gで遠心分離（またはオフ、ローブレーキの設定が利用できない場合）。
- 上清を除去し、攪拌により細胞ペレットを再懸濁。生存能力染色（ライブデッド固定可能な実行可能性染料）を追加します。製造業者の指示に従って生存色素を調製する。これは、各研究室/サイトメーターのセットアップで使用するために滴定する必要があるかもしれません。 4℃の暗所で30分間インキュベート
- （96ウェルプレート/ FACSチューブ用）細胞をPBSで100μl/500μLを洗ってください。低/ブレーキなしで10分間600×gで遠心分離する。 supernatanを削除T再懸濁細胞。
- 総容量100μlで、表面マーカー抗体のカクテルで細胞をインキュベートする。重要：以前のサンプル染色を各フローサイトメトリーパネルを最適化し、滴定する。 4℃の暗所で30分間、細胞をインキュベート
- ステップ4.5を繰り返します。 FACSチューブに、96ウェルプレートに転送細胞を染色する場合、1％パラホルムアルデヒド（PFA）を含有するFACSウォッシュ750μlの最終体積に希釈する（またはのCytofixを、4分の1に希釈）。フローサイトメーターでのデータ収集に進みます。
5。収集と子宮頸部膣肺胞洗浄液の調製（CVL）
- サンプリングを細胞採取用ブラシの前に、滅菌PBS 2mlで子宮頚内膜を洗浄し、円蓋から洗浄液を吸引するために注射器を使用しています。
- 15ミリリットルファルコンチューブに吸引洗浄サンプルを収集し、処理するまで4℃で氷/続ける。
- 細胞破片を除去するために7分間400×gで遠心分離サンプル。
- CO上澄み、1ミリリットルまたは500μlのアリコートに分量のサンプルを、-70℃で保存llectアリコートCVLタンパク質のELISAまたはビーズアレイ解析のために解凍が、複数回の凍結/融解サイクルを回避することができる。
- 所望であれば、製造業者のプロトコルに従って、RNA発現を測定するために後でRNA中の細胞破片のペレットを再懸濁。
6。データ収集
- 抗体パネルと一致する補償チューブのセットを準備します。スペクトルの重複を調整するために、補償管を実行します。そのサイトメーター任意の多色の流れにサンプルを実行するには、パネルで使用される蛍光色素標識抗体用に設定されている。
- リンパ球集団を検出するために、前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）の電圧を調整するように一PBMCサンプルを取得する。リニアスケールで、各軸の100でそれらを維持しようとします。 PBMC制御を実行すると、それは非常に簡単、CMCのリンパ球集団を見つけることになります。
- CMCサンプルのFSC閾値は低い値でFSC SSC軸をスミアによるPBMCサンプルに対して増加される必要があり得る。
- 取得する前に、各チューブをボルテックスする。収集されたリンパ球ゲートイベントの数を最大化するために管全体を取得する。目詰まりを避けるために慎重にマシンを監視します。
- このようなFlowJoソフトとして、フローサイトメトリー解析プログラムにデータをエクスポートします。
7。ゲー戦略
- 一重の人口を決定するために、前方側方散乱高（FSC-H）/前方側方散乱面積（FSC-A）を選択します。
- 買収の品質を制御するために、蛍光マーカー対時間（たとえば、FITCなど）を選択します。流量の変化は、データ内のアーティファクトを導入することができる。流量の不一致を示している任意の領域を除外します。
- SSC-A/FSC-Aプロット上のリンパ球集団を特定します。識別を容易にするために、PBMCコントロールを使用します。 CMCのリンパ球集団は、PBMCコントロールのように明確ではないかもしれないことに注意してください。</李>
- SSC-A/viability上のゲートは、生細胞から死細胞を排除するために染める。死んだ細胞は、非特異的に成果物を紹介しますこれは、抗体を組み込むことができます。
- T細胞集団を同定するSSC-A/CD3上にゲート。この門から、CD4 +およびCD8 +集団を特定します。
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Representative Results
マルチパラメータフローサイトメトリーは、以前に特徴づけられていない組織において、細胞サブセットの表現型や機能を分析するための強力なツールです。 CMC試料の分析は、適切なゲーティング戦略を、リンパ球および単球の両方の集団についての情報を得ることができる。
代表的なCMCゲーティング戦略は、一致したPBMCプロファイルと比較して、 図2に示されている。FSC-Hプロット対FSC-Aであっても、濾過後、PBMCと比較して、CMC試料において高度に蔓延している細胞ダブレットの排除を可能にする（ 図2A）。精度管理試料は、凝集塊の流量やアーチファクトの変化が容易に（ 図2B）を同定することができる時間にゲーティングによって流の問題の除去を含む。リンパ球/単球集団の同定は、PBMCとCMC試料（ 図2B）の両方で比較的似ています。生存性色素による死細胞の排除が包含を防ぐ非特異的蛍光抗体複合体を取り込んだのアポトーシス細胞。生存率は、PBMCと比較して、CMC試料で低く、かつ（ 図2B）をサンプリングするサンプルから高度に可変性であることができる。
この分析は、Tリンパ球集団の表現型に焦点を当てるが、CMCサンプルはまた、単球を含有する。単球集団でゲーティングした後、細胞生存度色素とダンプチャネル（ 図3A）に基づいてゲート制御される。ダンプ·チャネルは、CD56、CD3およびCD19に対する抗体が含まれ、ダンプ·チャネル陰性細胞上でゲーティングは、単球、リンパ球集団内の任意の汚染を排除する。次いで、細胞を、例えばCD16およびCD11cのようなマーカーの発現に基づいて同定することができる。 CD3 +リンパ球集団は、典型的には、PBMC（ 図3B、表1）と比較して、CMCの間で比例して減少する。上皮細胞、顆粒球およびCMC試料中に含まれる非CD3 + CD45 +白血球の割合が高いDT細胞集団の上ominates。 CD4 + T細胞（中央値：55.30パーセント、IQR：50.53パーセント-68.18％）およびCD8 + T細胞（中央値：25.60パーセント、IQR：21.50パーセント-33.80％）は低い割合で見出されている（CMCうちから2:1近い）ケニア（ 図3C、表1）での商業的セックスワーカーコホートから健康的なPBMCサンプルの間で観察5:1の比率と比較した。血液中のように、HIV感染はCD4 +を減少させる、CMC間のCD4 +およびCD8 + T細胞の割合に影響を与える：0.7 CD8 +比率（中央値：0.7、IQR：0.31から2.45）（ 図3C、表1）。しかしながら、健康な個体（ 図3C）からCMC集団間のCD8 + T細胞のより高い割合を観察することは珍しいことではない。興味深いことに、膨張CD4-CD8-（二重陰性、DN）PBMC DN T細胞頻度のT細胞集団の相対HIV陰性の個体（ 表1）の多くのCMCサンプルの間で観察することができる。これらの結果は、包皮サンプル26、althoについて得られたものと同様であるぐふこれらの細胞はあまり特徴がある。
典型的なT細胞の表現型マーカーを簡単にCMCの間で定量化されるが、PBMCは異なる可能性があり、 図4は、PBMCにおける異なるが（ 図4A）のCMCにはほとんど存在しない、CD8 + CD161 +（MAIT）人口の識別を示しています。活性化マーカーCD69の発現およびHLA DR、マイグレーションマーカーCCR5または枯渇マーカーPD-1は明らかにCD4 +またはCD8 +集団（ 図4B）上で識別することができる。
CVL中のサイトカイン/ケモカインの濃度の定量は、CMC染色と並行して分析することができる。これはCVLサイトカイン環境（免疫調節に対する前炎症性）とのCMCの表現型との相関関係を可能にします。これらのデータはまた、CMCは上のケモカイン受容体発現の頻度は、血漿またはCVLケモカイン14のいずれかの相対的な発現に関連しているかどうかを決定するために使用することができる。 表2 <> /強いは、CVLに健康な女性から採取しMILLIPLEXサイトカインビーズアレイキットによってアッセイサイトカインおよびケモカインの分析物の平均濃度を示す。
図1。女性の生殖器官の解剖学。 A）女性の生殖管の断面図を、外部の子宮口、子宮頸管や子宮腔に膣の関係を示す。外部OSを示した子宮頸部のb）は正面アングルビュー、および前方および後方円蓋12:00〜6:00の地域であった。ロイシュら 27からの許可を得て複製。細胞採取用ブラシが子宮頸管内に挿入され、追加のCMCを収集するために回転させながら子宮頸部スクレーパは、CMCを収集するために子宮口の周りを回転する。子宮頸膣洗浄液（CVL）PBSで子宮頸部を洗浄し、円蓋から収集することによって収集される。
図2ゲーティング及びCMCサンプルの品質管理。 A）FSC-Hプロット対FSC-Aによるシングレットの同定さえフィルターベースのCMC単離後、PBMCサンプルと比較して、CMC試料中のシングレットの低い割合を示しています。B）高および低品質の試料の例は、いくつかの品質のために示されている制御ステップ。時間対蛍光（またはSSC / FSC）のゲーティングは、流量の問題を特定することができ、染色アーチファクトを生じ得るイベントを除外するために使用すること。 SSC対FSCに基づいてリンパ球集団は、または容易に試料によって識別されない場合があります。生存性色素を含めることは、いくつかのサンプルが、50％未満の生存細胞を含有することができるように、非常に重要です。 Viabili細胞死の際に膜の完全性の喪失は、色素が細胞内タンパク質上のアミン基にアクセスすることを可能にするように、ティ（アミン反応性）染料は、より明るく生きている細胞よりも死細胞を染色する。生存細胞は、したがって、生存色素陰性集団にゲーティングによって同定される。
図3：T細胞サブセットの同定。 A）CMC試料のうち、CD3 +集団は、PBMCサンプルと比較して、一般的にリンパ球ゲートの小さい割合である。 CMCサンプルは、図示のように、T細胞集団のサイズは、より可変である。B）CD4 +、CD8 +およびCD4-CD8-T細胞集団を容易に両方のCMCおよびPBMCサンプルにおいて同定される。 CD4：CD8 T細胞の割合が示されているように、CMCの間でサンプルによって変化することができる。示されたデータは、HIVに感染していない女性から採取した。
図4 CMCサンプルにおけるT細胞の表現型。 A）を容易にPBMCサンプルにおいて同定され、粘膜関連する不変T細胞（MAIT）CD8 + CD161 + +集団は、CMCをほぼ完全に不在である。 CD8 + CD161 + T細胞は、両方のサンプルで識別することができる。CD69、HLA DR、CCR5およびPD-1を含む表現型マーカーのB）のCMC展示式。ゲートは、蛍光マイナス1（FMO）のコントロールに基づいて描かれた。示されたデータは、HIVに感染していない女性から採取した。
| CMCを | PBMCを | |||||
| 人口 | HIV陽性（N = 34） | HIV-た（n = 44） | P 値 a | HIV陽性（N = 28） | HIV-（n = 3の5） | P 値 a |
| 中央値（IQR） | 中央値（IQR） | 中央値（IQR） | 中央値（IQR） | |||
| ％ライブリンパ球 | 85.65（60.25から92.63） | 88.70（74.85から95.38） | 0.1193 | - | - | |
| ライブリンパ球ゲート内％CD3 + | 5.94（0.90から16.80） | 1.44（0.39から8.46） | 0.0303 | 41.15（17.08から62.10） | 41.90（20.40から51.30） | 0.4231 |
| p値b を | <0.0001 | <0.0001 | ||||
| CD3 +ゲート内の％のCD8 + | 43.20（25.75から66.00） | 25.60（21.50から33.80） | 0.001 | 30.05（22.75から38.78） | 14.60（8.01から24.80） | <0.0001 |
| p値b を | 0.0291 | <0。0001 | ||||
| CD3 +ゲート内の％のCD4 + | 31.10（20.45から63.10） | 55.30（50.53から68.18） | 0.0003 | 56.10（50.10から61.28） | 77.20（65.90から92.80） | <0.0001 |
| p値b を | 0.002 | <0.0001 | ||||
| 比、CD4：CD8 | 0.71（0.31から2.45） | 2.09（1.55から3.01） | 0.0003 | 1.92（1.44から2.39） | 5.34（2.66から10.77） | <0.0001 |
| p値b を | 0.004 | <0.0001 | ||||
| CD3 +ゲート内の％のDN | 10.40（6.36から14.30） | 10.70（6.76から19.10） | 0.4793 | 9.58（6.65から15.98） | 7.01（5.26から8.07） | 0.0032 |
p値| 0.8338 | 0.0006 | | ||||
表1。CMC及びPBMC中のT細胞サブセットの相対的な割合 。 44 HIV陰性と34 HIV陽性の女性セックスワーカーからCMCsamplesと35 HIV陰性と28のHIV陽性からのPBMCサンプルは生きている細胞のそれらの相対的な割合を比較した、CD3 + T細胞およびCD4 +、CD8 +およびCD8-CD4-DN T細胞サブセット。データは中央値（25 番目 -75四分位、IQR TH）として表示されている。群間の差は、マン·ホイットニー検定により算出した。 p値は、HIV +およびHIV-又はCMCとPBMC Bデータとの比較の結果を示す。
| 検体 | （STDのDEVを。）を意味する | |
| pg / mlで | pg / mlで | |
| MIP-3A | 35.5（90.6） | 2.9 |
| ミグ | 1447（3026） | 19.4 |
| ITAC | 2.7（6.3） | 0.8 |
| フラクタル | 51.6（69.5） | 10.6 |
| IFN-A2 | 24.0（12.0） | 40.6 |
| IFN-G | 3.9（14.2） | 0.3 | IL-1A | 268.4（721.3） | 6.4 |
| IL-1bは | 46.8（126.2） | 0.7 |
| IL-1raは | 4967.0（3597） | 5.5 |
| IL-2 | 0.9（2.6） | 0.6 |
| IL-6 | 14.8（30.5） | 0.7 |
| IL-7 | 6.3（10.1） | 0.1 |
| IL-8 | 1491（2126） | 0.3 |
| 4.5（8.6） | 0.5 | |
| IL-15 | 1.4（2.7） | 0.7 |
| IL-17 | 1.1（2.2） | 0.3 |
| IP-10 | 381.4（1100年） | 2.2 |
| MCP-1 | 129.4（340.4） | 1.6 |
| MCP-3 | 5.9（7.1） | 3.7 |
| MDC | 84.2（94.6） | 6.9 |
| MIP-1A 20.9（28.9） | 6.4 | |
| MIP-1B | 28.5（42.6） | 8.9 |
| のsCD40L | 10.8（19.3） | 9 |
| SIL-2RA | 8.4（9.8） | 7.7 |
| TNF-αは | 1.9（4.1） | 0.1 |
表2。CVLでのサイトカインやケモカインの発現。51のHIV非感染（非HESN）からのサンプル半ば月経周期の女性のセックスワーカーコホートの参加者はMILLIPLEX MAPヒトサイトカイン/ケモカインのビーズを使用してサイトカイン/ケモカイン濃度についてアッセイしたメーカーによると、アレイキット連でアッセイの晩プロトコル。 IFN：インターフェロン; MCP：単球走化性タンパク質; MDC：マクロファージ由来ケモカイン、S：水溶性; TNF：腫瘍壊死因子; MIP：マクロファージ炎症性タンパク質; ITAC：インターフェロンinductible T細胞アルファ化学誘引; MIG：ガンマインターフェロンにより誘導されるモノカイン; IP-10;インターフェロンinductibleタンパク質。検出限界未満の値は、検出の半分制限の値が割り当てられていました。
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Discussion
女性の生殖器（FGT）の免疫に関する知識に大きなギャップを考えると、CMCで表現型分析は、子宮頸部の複数のリンパ球集団への洞察の広い配列を提供することができます。プロテオーム解析と子宮頸洗浄液中のウイルス量の測定と相まって、性感染症（STI）Sおよび他の病原体に対する免疫は、様々な集団で解剖することができます。
技術的な考慮-のCMC：CMC試料の分離と成功染色が困難な場合があります。 CMC収集プロトコルの最適化は、子宮頸スクレーパー、その後最終的に細胞採取用ブラシが続く最初のCVLを集めるの有効性を、強調してきた。なお、以下に述べる種々の理由のために、サンプルの除外の可能性の増大に起因する末梢血研究のために計算されたものと比較して、計画されたサンプルサイズを大きくすることが重要である。
欲望のテストCMCの試料に対するdフローパネルは前開始を検討することが重要です。これは、特に、単球ゲート内には、CMC試料中の細胞の自家蛍光を監視することが重要である。いくつかのチャネルにおけるCMCの自己蛍光は、ゲーティング影響を及ぼし得るPBMCを、信号対雑音比と比較して上昇させることができる。以前PBMCサンプルで測定した場合、更に、最適な電圧は、CMCサンプルに確認されるべきである。
データの整合性を保つためには、血液汚染や交絡性感染症を有するサンプルを除外することが重要です。パネル、フローサイトメトリーにおける細胞生存色素を含めることは、非特異的な蛍光抗体を取る死細胞を排除するために不可欠です。ほとんどのサンプルは非常に実行可能であるが、それは実行可能性色素により細胞の10〜20％を除外することは珍しいことではありません。 CD4およびCD8発現に基づいてサブセット分析が計画されている場合は、分析を続行するために、少なくとも100 CD3 +事象を得ることが重要である。別の女性から採取したサンプル、さらには同じ女性Aから異なる時点からt、非常に異なる細胞数13を得ることができる。
PBMC対照試料は、CMCサンプルと同時に実行することができれば、粘膜リンパ球のフローサイトメトリー分析は、多くの場合、より簡単に、より成功している。いくつかのCMCサンプルにおいて、リンパ球集団は、FSC / SSCゲーティングすることによって識別することは困難であるが、PBMCサンプルを含めることは、どこゲートのより良いアイデアを与えるだろう。でも、明確なリンパ球のFSC / SSC人口のない試料では、個別のCD3 +集団を特定することができる。データ収集は、経時的な蛍光にゲーティング技術的な問題（吸気詰まりサイトメーターなど、バブル）によって中断されている場合は、まだサンプル分析を可能にしながらデータ収集の成果物を削除することができます。そのようなゲートの配置についての蛍光マイナス1（FMO）管などの適切なコントロールが必要な細胞の数は細胞採取用ブラシのサンプルを使用するには余りにも充実しているときに、末梢血単核細胞（PBMC）上で実行される必要があり得る。
ontent ">複数の研究は、CMC試料のうち、抗原特異的T細胞応答の検出を実証した。CMCサイトカイン産生はまた、PMA /イオノマイシン、PHA、IFNγおよび抗CD3刺激によって誘導することができる。CMCの刺激の主要な制限の一つである条件および試料ごとに実行することができるコントロールの数を低減するセル番号、それを注意深く監視し、細胞培養の汚染を防止するために余分なステップを取ることも重要である。生殖管は、滅菌サイトではない、場合によっては余分な抗生物質細菌の異常増殖を防ぐために、培地に添加する必要があります。のCMCは、生存能力の小さな損失で凍結保存することができますが、回復は細胞増殖を10に計画されていない限り、刺激研究のために凍結保存サンプル貧しい候補者を作り、約50％である。技術的な考慮- CVLS：CVLの収集は、通常、限られたサンプルVOLになり梅、繰り返しELISAによるタンパク質濃度の多数の分析を防ぐ。代替アッセイは、ルミネックスプラットフォームまたはフローサイトメトリープラットフォームをベースサイトカインビーズアレイです。多重化されたキットは、極めて少量のサンプル（しばしば〜25μl）を、最大30の検体の定量化を可能にする、いくつかの商業的供給源から入手できます。これらのアッセイの最適化は、一晩のインキュベーションプロトコルを使用して分析物の最適な検出を明らかにした。血漿/血清試料中の検出可能ないくつかの検体はCVLで検出可能ではありません。注目すべきことに、スピンカラムを用いてCVLサンプルの濃度は、ビーズアレイアッセイを実行する前に、試料濃度に対する利点がないことを示唆し、任意の検体の検出を改善しなかった。
性器粘膜固有の交絡因子：FGTの免疫学の研究が承認する世話をし、できるだけ多くの交絡変数を考慮する必要があります。月経周期の時間として今末梢血免疫28に影響を与えることが実証され、そしておそらくより、CMC表現型および細胞組成への影響だけでなく、CVLサンプル29から収集されたタンパク質を発揮する。月経周期の相にサンプル収集を同期すると、最後の月経の最初の日以来、エストロゲン/プロゲステロンのレベルや日数で測定しても、データのばらつきを低減するための好ましい方法である。ホルモン避妊の使用は、大幅に粘膜環境に影響を与え、研究を設計または分析する際にその効果が考慮されるべきである。細菌性膣炎（BV）を生じる膣内細菌叢の変化は、免疫環境や細胞の表現型を変更します。 BVはグラム染色によって診断することができ、ニュージェントスコアはBVの交絡効果を制御するために確立することができます。
精液へのアロ反応はCELの急速かつ劇的な変化を誘導することができるので、性行為も、性器免疫学に大きな影響を持っているL表現型と人身売買。実際、ラショエイらセックスワークの開始後の最初の数年の間に起こる変化とセックスワーカーと非セックスワーカー集団間CVLタンパク質組成の違いを、説明しています。
最後に、このようなdouchingなどの文化的慣習は、粘膜のサンプリングにさらなるバリエーションをご紹介します。 （漂白剤、洗剤、ライムジュースなど）に使用される試薬に依存して、douchingは、細胞集団の周波数/表現型を減少させることができる、又は他の試料と比較して自己蛍光を変化させる。理想的には、サンプリングを細胞採取用ブラシの前douchingはドナー間落胆する必要があります。
将来のアプリケーション：月経/ホルモン変動時の粘膜免疫の調節細菌/ウイルス感染に重要な洞察が得られることに加えて、および/ 閉経後の前に、粘膜サンプルの分析は、性感染症/粘膜病原体に対するワクチンの研究に特に関連する。 HIVの場合には、ワクチン研究の主な目的は、粘膜抗体またはT細胞応答を誘発することであり、CMC-ベースのアッセイの開発は、保護の相関を決定する際に重要な役割を果たします。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
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