Introduction
새로운 HIV 감염의 대부분은 전 세계적으로 여성은 2011 년 (UNAIDS 1) 새로운 감염의 47 %를 대표로, 이성애 전송을 통해 발생한다. 여성의 생식기 (FGT), HIV 및 기타 성병 병원체의 주 진입 포털 중 하나를 이해, 감염을 방지하기 위해 효과적인 전략을 찾는 경로에 높은 중요하다. 생식기 점막의 면역 반응은 분명히 독특하고 말초 혈액 2에서 측정 다릅니다. 그러나, FGT에서 면역 역학의 현재의 지식은 기껏해야 제한됩니다. 현재까지, 점막 면역 환경의 연구는 대부분이 감염 다음과 같은 점막 조직에서 초기 이벤트 이후 질병의 진행 3,4에 큰 영향을 미칠 것이 분명되고있다 창자 관련 림프 조직 (GALT)에 초점을 맞추고있다. 생식기 점막에서 샘플을 수집하는 것은 큰 도전을 나타내고 락 적어도 부분적으로 책임이있다FGT의 면역학의 이해 K. FGT이 로케일에서 샘플을 수집하고 분석하기위한 효율적인 방법을 필요로 한 독특한 환경의 맥락에서 호스트와 병원체의 면역 동적으로 퍼즐을 해결.
FGT는 두 개의 섹션으로 나누어 져 나팔관, 자궁 내막과 자궁 경부, 그리고 ectocervix을 포함하는 낮은 요로와 질을 포함하는 상부 생식기 (Kaushic 검토를 등 5). 그것은 서로 다른 사이트의 상대적 기여도는 HIV 감염에 무엇 아직 불분명하지만, 그것은 두 사이트 모두 HIV 항목 6에 기여할 수 있다고 믿고 있습니다. T 세포는 대 식세포가 (로드 리 게스 - 가르시아 검토 등 2) 약 10 %를 포함하는 동안, 상단과 하단의 생식 책자에서 백혈구 40 ~ 50 %를 차지한다. T 세포는 질, 경부, 자궁 내막 및 검출 할 수있다. 대 식세포는 더 강하게 locali 있습니다그들은 두 조직에서 검출 될 수 있지만, 자궁 경부보다 자궁 내막 및 자궁 근층 결합 조직에 제드 자형. 마지막으로, plasmacytoid 수지상 세포 (PDCS) 및 랑게르한스 세포는 또한 FGT 조직에서 검출 될 수있다. 표현형 및 면역 인구 및 HIV 감염에 감수성의 비율은 호르몬주기에 따라 중요하게 다를 수 있습니다, 호르몬 피임약, 세균성 질염이나 성적 활동 5,7-9의 사용.
다양한 방법 FGT의 면역 인구와 환경을 연구하기 위해 개발되었다. 자궁 경부 조직 검사, 자궁 및 자궁 경부 cytobrushes lavages (CVL) 10 ~ 12은 가장 일반적으로 문헌에서 사용할 수 있습니다. PBS의 세척에 의한 CVL 컬렉션은 간단한 방법이며, 매우 낮은 세포 수율 면역 조절 성 단백질 만, 결과의 연구를 허용하고, 따라서 FGT (13)의 면역 세포 집단을 공부에 적합하지 않습니다. CVL 샘플은, 반면에, 아르 V이러한 ELISA, 사이토킨 비드 어레이 (14) 또는 질량 분석 등의 방법 (15, 16)를 사용하여 각종 사이토킨, 케 모킨 또는 항균 인자의 발현을 측정함으로써 FGT의 면역 환경을 평가하기위한 유용한 ERY. 면역 세포 주파수, 표현형과 기능의 특성은 자궁 cytobrush 또는 자궁 경부 생검 표본 추출에 의해 자궁 경부 단핵 세포 (CMC)를 수집하여 달성 될 수있다.
자궁 경부 생검의 샘플링은 출혈의 불편과 위험을 증가와 여자 (12)의 면역 상태에 따라 절차에 따라 치료 2~11일 소요 침습적 방법이다. 한편, 자궁 cytobrushes는 수집 세포의 낮은 수율에도 불구하고, FGT로부터 면역 세포를 수집하기 위해 덜 침습적 더 편리한 방법이다. 두 가지 방법은 CD45 + 백혈구의 동일한 수율에 도달 할 수 있지만, 두 개의 연속 자궁 cytobrushes가 포함 된 세포의 동일한 금액을 얻기 위해 필요한 IN 한 생검 13. 그럼에도 불구하고, cytobrush 샘플링은 여전히 14 유동 세포 계측법에 의해 추가로 생체 표현형에 대한 세포의 수용 수 (약 5,000 CD45 + 세포 / cytobrush)를 제공합니다. 자극 세포 유세포 또는 qPCR에 HIV가 특정 면역 반응 (17) 또는 토륨 셀 (18)의 편광을 식별 cytobrush 유래의 CMC를 사용하여 수행되었다로서 또한 기능적인 특성은,이 샘플들에 수행 될 수있다. T 세포 인구의 팽창은 또한 CMC를 19으로 기능적 연구를 용이하게 할 수있다.
그것은 생검 및 cytobrushes는 FGT의 별개의 부분을 샘플링하는 것이 중요합니다. 자궁 cytobrushes은 자궁 경부와 아마 변환 영역의 상피 세포에서 파생 된 세포를 수집, 자궁 OS를 샘플링하면서 생검은 ectocervix (12, 13)의 상피 세포와 기질의 우수한 부분에서 파생됩니다. Cytobrush 샘플 따라서 재를 샘플링조직 검사는 편평 층상 상피 5 줄 지어 영역을 포함하는 동안 기온은 원주 상피 세포의 단일 층으로 구성. 그 결과, 자궁 경부 생검 및 cytobrush 의해 수집 백혈구 집단의 특성은 다르다. cytobrushes는 CD14 + 단핵 세포 / 대 식세포 (13)의 높은 비율의 컬렉션에 발생하는 반면 생검, CD3 + T 세포의 높은 비율을 수집합니다.
FGT의 면역학을 공부하는 것은 많은 년간 20 ~ 22에 대한 관심이었다 우리는 cytobrush 파생 CMC를 연구와 전문 지식의 큰 거래를 축적했다. 우리의 연구는 HIV에 감염된 감염되지 않은 및 HIV에 노출 된 혈청 음성 나이로비, 케냐 (HESN) 여성 성 노동자의 연구에 주로 초점을 맞추고있다. HIV는 우선적으로 FGT에 HIV 대상이 될 수있는 활성화 된 세포의 23 숫자가 낮아 HIV 취득에 대한 보호에 기여할 수있는 활성화 된 T 세포에 복제합니다. 이 가설 여러 스투과 일치에스 아직 감염되지 않은 24, 25을 유지하며,이 대기 표현형도 FGT 14에서 관찰되는 높은 HIV에 노출 된 HESN의 성 노동자들 사이 낮은 면역 활성화를 설명했다. 여기, 우리는 처리 방법을 설명하고 생체 유동 세포 계측법에 의해 자궁 경부 cytobrushes에서 파생 된 CMC 샘플에서 T 세포의 활성화를 평가.
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Protocol
윤리 문 : 매니토바 대학교 및 나이로비의 케냐 타 국립 병원 / 대학 모두의 연구 윤리 보드는이 연구를 승인하고 서면 동의서는 모든 연구 참가자로부터 얻은 것입니다.
1. 매체의 제조 및 CMC 수집 관
- 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 용액 (137.93 mM의 염화나트륨, 2.67 밀리미터의 KCl, 8.1 mM의 나 2 HPO 4, 1.47 mM의 KH 2 PO 4)를 준비합니다. 불임에 대한 압력솥. 이것은 몇 달 동안 4 º C에 저장할 수 있습니다.
- 미리 나누어지는 5 ㎖의 PBS로 50 ML 팔콘 튜브 (수집 할 샘플 당 하나)와 4 º C에서 저장 샘플 수집 시간까지.
- 저장을위한 세척을 수집하는 샘플 당 2 ~ 4 cryovials 또는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 레이블을 지정합니다.
- 세포 배양 매체를 준비 RPMI 1640 + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 신 B (최종 농도 100 단위 / ㎖, 100 ㎍ / ㎖ 및 250 겨 / ㎖, respectiv더 FCS / FBS와 엘리는 덧붙였다.
Cytobrush 샘플 2. 컬렉션
cytobrush 샘플 컬렉션은 훈련 MD 또는 산부인과 의사에 의해 수행되어야하는 비 침습 절차입니다.
- cytobrush와 나무 또는 플라스틱 긁는 도구를 모두 사용하여 자궁 경부 단핵 세포 (CMC)를 수집합니다. (그림 1) 긁는 도구를 삽입하고 자궁 OS 중심으로 회전하여 검경 시험에서 참가자에서 CMC를 수집합니다. , 자궁 경부 OS에 cytobrush를 삽입 360 ° 회전, 즉시 PBS의 5 ML을 포함하는 50 ML 팔콘 튜브에 cytobrush 스크레이퍼를 모두 배치합니다.
- 처리까지 4 º C에서 / 얼음에 샘플을 보관하십시오. 컬렉션의 2 시간에서 세포 생존 능력, 공정 샘플을 유지합니다.
- 가능하면 말초 혈액 단핵 세포 CMC 분석을위한 비교 / 제어 역할을하는 (PBMC) 분리를위한 녹색 최고 헤파린 vacutainers에 일치하는 혈액 샘플을 수집합니다.
CMC를 3. 분리
이중 장갑 멸균 생물 안전 캐비닛, 바이오 안전성 수준이 실험실에서 시료 처리를 수행합니다.
- 수집하는 동안, CMC 샘플은 혈액에 오염 될 수 있습니다. 최종 샘플 PBMC의 혼란 포함을 방지하기 위하여 연구 결과에서 볼 혈액 오염과 샘플을 제외. 인해 CMC 샘플로부터 단리 림프구의 낮은 숫자로, 사소한 혈액 오염을 쉽게 CMC 림프구 성분을 압도 할 수있다.
- 브러쉬에서 세포를 떼어 놓다 45 초 cytobrush 스크레이퍼를 모두 포함 소용돌이 팔콘 튜브. 샘플은이 과정에서 거품이 될 수있다; 이것은 정상입니다.
- 스크레이퍼 떨어져 남아있는 재료를 긁어 및 표백 용액에 스크레이퍼를 폐기 cytobrush를 사용합니다. 브러쉬 / 스크레이퍼에 붙어 남아있는 세포를 수집하려면, 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 스크레이퍼를 짜내 신선한 장갑을 사용합니다.세포와 PBS가 동일한 50 ㎖ 튜브에 수집 될 수 있도록 브러시를 밀어. 표백제 용액에 cytobrush를 폐기하고, 장갑을 버린다.
중요 : 각 샘플에 대한 새로운 장갑을 사용하십시오. - 신선한 50 ML 팔콘 튜브에 100 μm의 나일론 셀 스트레이너를 장착한다. 전달 피펫을 사용하여, 샘플 튜브에서 PBS-세포 현탁액을 수집하고 새로운 튜브로 여과기를 통해 고를.
- 원래 샘플 튜브에 RPMI 1640 5 ML을 추가합니다. 전송 피펫을 사용하여 RPMI로 샘플 튜브의 측면을 씻어 새 컬렉션 튜브에 필터를 통해 전송합니다. 뿐만 아니라 RPMI와 나일론 필터의 바닥을 세척 할 것.
- 514 X g에서 10 분 동안 원심 분리. 이것은 CMC 펠릿 빠지을 방지하기 위하여,이 단계 동안 원심 브레이크를 남겨두기 위하여 중요하다.
- 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 튜브에서 뜨는을 제거합니다. 펠렛의 크기는 매우 다양 할 것이다; 그래서의다른 경우에, 펠릿이 거의 보이지 및 고투명 동안 저 샘플은 펠릿 인해 상피 세포의 많은 수의 존재로 상당히 크다.
- 팔콘 튜브의 부드러운 교반하여 펠렛을 Resuspend. 샘플을 씻어 PBS의 5 ML을 추가합니다.
- 아니 원심 브레이크와 514 XG에 10 분 다시 원심 분리기.
- 조심스럽게 뜨는을 취소하고 위의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 세포 (PBMC의 냉동 보존 프로토콜을 사용하여) 냉동 보존, 자극 또는 표현형 유동 세포 계측법 중 하나에 대한 준비가되어 있습니다.
4. CMC 표면의 얼룩 및 유동 세포 계측법
- 차단 용액 100 μL 3.10 단계에서 펠렛을 재현 탁하고 96 - 웰 플레이트 또는 FACS 튜브 내로 하나 옮긴다. 차단 솔루션 (Fcγ 수용체를 차단하기 위해) 다음과 같은 조리법은 : 1.8 ㎕의 마우스 IgG의 (최종 농도 0.2 ㎍ / μL), 5 μL의 FBS 93.2 ㎕의 FACS 세척 (PBS 2 % FBS).염색법은 펠릿 크기가 충분히 작은 경우에 96 웰 플레이트에서 수행 될 수 있지만, 펠릿 일상적 큰 경우 FACS 튜브에서 수행 될 필요가있다. 그에 따라 항체를 적정하는 것이 중요합니다.
- 4 ℃에서 얼음 / 10 분의 샘플을 차단
- 96 - 웰 플레이트에 FACS 워시 (PBS 2 %의 FBS) 100 μL, 또는 FACS 튜브에 500 ㎕ 씩 세포를 씻으십시오. 최저 브레이크와 4 ° C에서 10 분 600 XG에 원심 분리기 (끄거나, 낮은 브레이크 설정을 사용할 수없는 경우가).
- 뜨는을 제거하고 교반하여 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 생존의 얼룩 (라이브 죽은 고칠 가능성 염료)를 추가합니다. 제조업체의 지침에 따라 생존의 염료를 준비합니다. 각 실험실 / 사이토 설치에 사용하기 위해 적정해야 할 수 있습니다. 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 알을 품다
- (96 - 웰 플레이트 / FACS 튜브의 경우) 세포에게 PBS 100 μl/500 μl를 씻으십시오. 저 / 노 브레이크 10 분 600 XG에 원심 분리기. supernatan를 제거T와에 resuspend 세포.
- 100 μL의 총 부피, 표면 마커 항체의 칵테일 세포를 품어. 중요 : 최적화 및 염색을 샘플링하기 전에 패널 세포 계측법 각 흐름을 적정한다. 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 세포를 품어
- 4.5 단계를 반복합니다. FACS 튜브에 96 - 웰 플레이트, 전사 셀에 염색하고 1 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 포함하는 FACS 세척 750 μL의 최종 부피로 희석 (또는 CytoFix을 소재 1 희석). 유동 세포 계수기에 데이터 수집을 진행합니다.
5. 수집 및 자궁 경부 질 세척의 준비 (CVL)
- 샘플링을 cytobrush하기 전에, 멸균 PBS의 2 ㎖로 자궁 경부 씻어 후방 원개에서 세척을 흡인하기 위해 주사기를 사용합니다.
- 15 ML 팔콘 튜브에 흡입 된 세척 샘플을 수집하고 처리 할 때까지 4 º C에서 / 얼음 계속.
- 세포 파편을 제거하는 7 분 400 XG에 샘플을 원심 분리기.
- 공동-70 ℃에서 1 ㎖ 또는 500 μL 씩 분주하고, 가게에 뜨는 나누어지는에게 샘플을 llect 분취 량은 ELISA 또는 CVL 단백질의 비드 어레이 분석 해동 만 체류 냉동 / 해동 사이클을 피할 수있다.
- 원하는 경우, 제조자의 프로토콜에 따라 RNA의 발현을 측정하기 위해 나중에 RNA에서 세포 파편의 펠렛을 재현 탁.
6. 데이터 수집
- 항체 패널 일치 보상 튜브 세트를 준비한다. 스펙트럼 중복을 조정 보상 튜브를 실행합니다. 그 사이토 어떤 여러 가지 빛깔의 흐름에 샘플을 실행은 패널에 사용되는 형광 색소 결합 된 항체에 대해 구성됩니다.
- 림프구 집단을 검출하기 위해 순방향 캐터 (FSC) 및 측면 스 캐터 (SSC)의 전압을 조정하는 제 PBMC 시료를 획득. 리니어 스케일의 각 축 (100)에 그들을 유지하십시오. PBMC 제어를 실행하면 상당히 쉽게 CMC 림프구 인구를 찾을 수 있습니다.
- CMC 샘플에 대한 FSC 임계 값은 낮은 FSC의 값에 SSC 축을 얼룩에 의한 PBMC 샘플에 상대적으로 증가해야 할 수 있습니다.
- 취득하기 전에 각 튜브를 소용돌이. 수집 된 림프구 게이트 이벤트의 수를 최대화 할 전체 튜브를 획득. 막힘을 방지하기 위해주의 깊게 시스템을 모니터링합니다.
- 그러한 FlowJo 같은 유세포 분석 프로그램으로 데이터를 내보낼.
7. 게이팅 전략
- 고 앞으로 측면 산란 (FSC-H)을 선택 / 앞으로 측면 산란 영역 (FSC-A) 중항 인구를 결정합니다.
- 인수의 품질을 제어하기 위해 (예를 FITC로) 형광 마커 대 시간을 선택합니다. 유량의 변화는 데이터에 유물을 소개 할 수 있습니다. 유량의 차이를 보여줍니다 어떤 지역을 제외합니다.
- SSC-A/FSC-A 플롯의 림프구 인구를 확인합니다. 식별을 용이하게하기 위해 PBMC 컨트롤을 사용합니다. CMC 림프구 인구가 PBMC 제어와 같은 명확하지 않을 수 있습니다. </ 리>
- SSC-A/viability에 게이트는 살아있는 세포에서 죽은 세포를 제외 염색. 죽은 세포가 아닌 구체적으로 유물을 소개하는 항체를 통합 할 수 있습니다.
- SSC-A/CD3에 게이트는 T 세포 인구를 식별 할 수 있습니다. 이 게이트에서 CD4 +와 CD8 + 인구를 식별합니다.
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Representative Results
다 항목 유동 세포 계측법은 이전에 uncharacterized 조직에서 세포 부분 집합의 표현형과 기능을 해부 할 수있는 강력한 도구입니다. CMC의 샘플 분석은 적절한 게이팅 전략 림프구 및 단핵구 집단 모두에 대한 정보를 얻을 수있다.
대표적인 CMC 게이팅 전략, 일치 PBMC 프로파일에 비해, 그림 2와 같다. FSC-H 플롯 대 FSC-A도 여과 한 후, PBMC에 비해 CMC 샘플에서 매우 널리 퍼진 세포 이중선, 배제 가능 (그림 2A). 품질 관리로 인해 샘플 덩어리로 유량이나 유물의 변화는 쉽게 (그림 2B)를 식별 할 수있는 시간에 게이팅에 의해 흐름 문제의 제거를 포함합니다. 림프구 / 단핵 세포 인구의 식별 PBMC 및 CMC 샘플 (그림 2B) 모두에서 상대적으로 유사합니다. 생존의 염료에 의해 죽은 세포의 제외는 포함을 방지비특이적 형광 항체 복합체를 촬영 한의 세포 사멸. 생존은 PBMC에 비해 CMC 샘플에서 낮은, (그림 2B)를 샘플 시료에서 매우 다양 할 수있다.
이 분석은 T 림프구 인구 표현형에 초점을 맞출 것이다, 그러나 CMC 샘플은 단핵 세포가 포함되어 있습니다. 단핵구 인구에 게이팅 후, 세포 생존 능력의 염료 및 덤프 채널 (그림 3A)를 기반으로 게이트됩니다. 덤프 채널은 CD56, CD3와 CD19에 대한 항체를 포함하고 덤프 채널 음성 세포에 게이팅은 단핵구 인구에 어떤 림프구의 오염을 제거합니다. 셀은 다음과 같은 CD16의 CD11c 같은 마커의 발현에 기초하여 식별 될 수있다. CD3 + 림프구 집단은 전형적 PBMC (도 3b, 표 1)에 비해 CMC 간의 비례하여 감소된다. 상피 세포, 과립구 및 CMC 샘플에 포함 된 비 CD3 + CD45 + 백혈구의 비율이 높은 DT 세포 인구에 ominates. CD4 + T 세포 (평균 : 55.30 %, IQR : 50.53 % -68.18 %)와 CD8 + T 세포 (평균 : 25.60 %, IQR : 21.50 % -33.80 %)는 낮은 비율로 발견된다 (CMC 간의 2:1 가까이) 케냐 (그림 3C, 표 1)의 상용 성 노동자 일대에서 건강 PBMC 샘플 사이에서 관찰 된 5:1 비율에 비교했다. 혈액에서와 같이, HIV 감염은 CD4 +를 감소 CMC 사이 CD4 +와 CD8 + T 세포의 비율에 영향을 미친다 : 0.7 CD8 + 비 (중앙값 : 0.7, IQR : 0.31-2.45) (도 3c, 표 1). 그러나 건강한 사람 (그림 3C)에서 CMC의 인구 중 CD8 + T 세포의 높은 비율을 관찰하는 드문 일이 아니다. 흥미롭게도, 확장 된 CD4-CD8은 - (마이너스 배, DN) PBMC DN T 세포 주파수 T 세포 인구의 상대는 HIV 음성 인 개인 (표 1)의 많은 CMC 샘플 사이에서 관찰 할 수있다. 이러한 결과는 포피 샘플 26 altho 얻은 것과 비슷합니다우 이러한 세포가 제대로 특징이다.
일반 T 세포 표현형 마커 쉽게 CMC를 사이 정량화하지만 PBMC를 다를 수 있으며, 그림 4는 PBMC를 뚜렷한하지만 (그림 4A) CMC를 거의 존재하지 CD8 + CD161 + + (MAIT) 인구의 식별을 보여줍니다. 활성화 마커 CD69 및 HLA DR, 마이그레이션 마커 CCR5 또는 고갈 마커 PD-1은 명확하게 CD4 + 나 CD8 + 인구 (그림 4B)에서 확인 할 수있다의 표현.
CVL의 사이토킨 / 케모카인의 농도의 정량은 CMC 염색과 평행하게 분석 될 수있다. 이 CVL의 사이토 카인 환경 (면역 대 프로 염증) 및 CMC를의 표현형 사이의 상관 관계에 있습니다. 이러한 데이터는 또한 CMC를에서 케모카인 수용체의 발현 빈도가 플라즈마 또는 CVL 케모카인 (14) 중 하나의 기준 식 관련이 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수있다. 표 2 <> / 강한 CVL에 건강한 여성에서 수집 Milliplex 사이토 카인 비드 어레이 키트에 의해 정량 사이토 카인과 케모카인 분석의 평균 농도를 나타냅니다.
여성의 생식 기관의 그림 1. 해부학. 외부 운영 체제를 표시, 외부 자궁 OS, 자궁 경관 및 자궁 공동 자궁 경부의. B) 전면 각도보기에 질과의 관계를 보여주는 여성의 생식 기관, 및 전방 및 후방 원개의 A) 단면도 12:00 6시 지역이었다. 이슈 등 27의 허가를 재현. cytobrush은 자궁 경관에 삽입하고 추가 CMC를 수집하기 위해 회전하는 동안 자궁 스크레이퍼는 CMC를 수집 자궁 OS을 중심으로 회전된다. 자궁 경부 질 lavages (CVL)PBS로 자궁 경부를 세척 및 후방 원개에서 수집하여 수집된다.
2. 게이팅 및 CMC 샘플의 품질 관리를 그림. A) FSC-H 플롯 대 FSC-A로 중항의 확인이 높고 품질이 샘플 필터 기반 CMC 격리. B) 예를 몇 가지 품질 표시 후에도, PBMC 샘플에 비해 CMC 샘플에있는 중항의 낮은 비율을 보여줍니다 제어 단계. 시간 대 형광 (또는 SSC / FSC)의 게이팅 유량 문제를 식별 할 수 있으며 염색 아티팩트가 발생할 수있는 이벤트를 제외하는 데 사용할. SSC 대 FSC에 따라 림프구 인구 또는 쉽게 샘플에 따라 식별되지 않을 수 있습니다. 생존의 염료의 포함은 몇 가지 샘플이 적은 50 % 이상 가능한 세포를 포함 할 수 있으므로 매우 중요합니다. Viabili세포의 죽음에 따라 멤브레인 무결성의 손실이 염료는 세포 내에서 단백질의 아민 그룹에 액세스 할 수 있습니다로 타이 (아민 반응성) 염료, 더 밝게 라이브 세포보다 죽은 세포를 얼룩. 생존 세포 따라서 생존 염료 부정적인 인구에 게이팅에 의해 식별됩니다.
T 세포 부분 집합의 그림 3. 확인. A) CMC 샘플들 CD3 + 인구는 PBMC 샘플에 비해 일반적으로 림프구 게이트의 작은 비율입니다. 도시 된 바와 같이 CMC 샘플은 T 세포 집단의 크기로도보다 다양하다. B) CD4 +, CD8 + 및 CD4-CD8-T 세포 집단이 쉽게 CMC 및 PBMC 시료 모두에서 식별된다. CD4 : CD8 T 세포의 비율은 도시 한 바와 같이, CMC를 구비 샘플링하는 샘플과 다를 수있다. 표시 데이터는 HIV-감염되지 않은 여성에서 수집되었다.
CMC 샘플 그림 4. T 세포 표현형. A) 점막이 쉽게 PBMC 샘플에서 확인 된 (MAIT) CD8 + CD161 + + 인구는 CMC를 거의 완전히 결석 불변 T 세포를 관련. CD8 + CD161 + T 세포는 두 샘플에서 확인 할 수있다. CD69, HLA DR, CCR5 및 PD-1 등의 표현형 마커의 B) CMC를 전시 식입니다. 게이츠는 형광을 뺀 (FMO) 컨트롤을 기준으로 그려진. 표시 데이터는 HIV-감염되지 않은 여성에서 수집되었다.
| CMC를 | PBMC를 | |||||
| 인구 | HIV + (N = 34) | HIV-(N = (44)) | P 값 | HIV + (N = 28) | 에이즈 (N = 35) | P 값 |
| 중간 (IQR) | 중간 (IQR) | 중간 (IQR) | 중앙값 (IQR) | |||
| % 라이브 림프구 | 85.65 (60.25-92.63) | 88.70 (74.85-95.38) | 0.1193 | - | - | |
| 라이브 림프구 게이트 % CD3 + | 5.94 (0.90-16.80) | 1.44 (0.39-8.46) | 0.0303 | 41.15 (17.08-62.10) | 41.90 (20.40-51.30) | 0.4231 |
| P 값 B | <0.0001 | <0.0001 | ||||
| CD3 + 게이트에서 % CD8 + | 43.20 (25.75-66.00) | 25.60 (21.50-33.80) | 0.001 | 30.05 (22.75-38.78) | 14.60 (8.01-24.80) | <0.0001 |
| P 값 B | 0.0291 | <0.0001 | ||||
| CD3 + 게이트에서 % CD4 + | 31.10 (20.45-63.10) | 55.30 (50.53-68.18) | 0.0003 | 56.10 (50.10-61.28) | 77.20 (65.90-92.80) | <0.0001 |
| P 값 B | 0.002 | <0.0001 | ||||
| 비율 CD4 : CD8 | 0.71 (0.31-2.45) | 2.09 (1.55-3.01) | 0.0003 | 1.92 (1.44-2.39) | 5.34 (2.66-10.77) | <0.0001 |
| P 값 B | 0.004 | <0.0001 | ||||
| CD3 + 게이트에서 % DN | 10.40 (6.36-14.30) | 10.70 (6.76-19.10) | 0.4793 | 9.58 (6.65-15.98) | 7.01 (5.26-8.07) | 0.0032 |
P 값 | 0.8338 | 0.0006 | | ||||
표 1. CMC를하고 PBMC를있는 T 세포의 부분 집합의 상대 비율. 44 HIV 음성 34 HIV 양성 여성의 성 노동자와 PBMC 샘플 35 HIV 음성에서 28 HIV-양성이 살아있는 세포의 상대적 비중을 비교 하였다에서 CMCsamples, CD3 + T 세포와 CD4 +, CD8 +와 CD8-CD4-DN T 세포의 부분 집합. 데이터는 중간 (25 일 -75 분위, IQR 일)으로 표시하고 있습니다. 그룹 사이의 차이는 맨 - 휘트니 시험에 의해 계산 하였다. P 값은 HIV + 및 HIV 또는 CMC와 PBMC B 데이터의 비교의 결과를 나타냅니다.
| 분석 | (표준 dev에 있습니다.) 평균 | |
| PG / ML | PG / ML | |
| MIP-3A | 35.5 (90.6) | 2.9 |
| MIG | 1447 (3026) | 19.4 |
| ITAC | 2.7 (6.3) | 0.8 |
| Fractalkine | 51.6 (69.5) | 10.6 |
| IFN-A2 | 24.0 (12.0) | 40.6 |
| IFN-g | 3.9 (14.2) | 0.3 | IL-1A | 268.4 (721.3) | 6.4 |
| IL-1B | 46.8 (126.2) | 0.7 |
| IL-1RA | 4967.0 (3597) | 5.5 |
| IL-2 | 0.9 (2.6) | 0.6 |
| IL-6 | 14.8 (30.5) | 0.7 |
| IL-7 | 6.3 (10.1) | 0.1 |
| IL-8 | 1491 (2126) | 0.3 |
| 4.5 (8.6) | 0.5 | |
| IL-15 | 1.4 (2.7) | 0.7 |
| , IL-17 | 1.1 (2.2) | 0.3 |
| IP-10 | 381.4 (1100) | 2.2 |
| MCP-1 | 129.4 (340.4) | 1.6 |
| MCP-3 | 5.9 (7.1) | 3.7 |
| MDC | 84.2 (94.6) | 6.9 |
| MIP-1A 20.9 (28.9) | 6.4 | |
| MIP-1B | 28.5 (42.6) | 8.9 |
| sCD40L | 10.8 (19.3) | 9 |
| 나 sIL-2RA | 8.4 (9.8) | 7.7 |
| TNF- | 1.9 (4.1) | 0.1 |
CVL의 사이토 카인과 케모카인의 표 2. 식. 중반 생리주기에 여성 성 노동자 일대의 51 에이즈에 감염되지 않은 (비 HESN) 참가자의 샘플은 Milliplex MAP 인간의 사이토 카인 / 케모카인 비즈를 사용하여 사이토 카인 / 케모카인의 농도에 대한 측정 하였다 배열 키트 제조 업체에 따라중복 정량의 하룻밤 프로토콜. IFN : 인터페론; MCP : 단핵구 화학 주성 단백질; MDC : 대식 세포 유래 케모카인,들 : 가용; TNF : 종양 괴사 인자; MIP : 대식 세포 염증 단백질; ITAC : 인터페론 inductible T 셀 알파 화학 유인 물질; MIG : 감마 인터페론에 의해 유도 monokine; IP-10; 인터페론 inductible 단백질. 값 검출 한계 이하가 검출 절반 한계 값을 할당했다.
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Discussion
여성의 생식기 (FGT)에서 내성에 대한 지식의 큰 격차를 감안할 때, CMC를의 표현형 분석은 자궁 경부에있는 다수의 림프구 집단에 대한 통찰력의 다양한 배열을 제공 할 수 있습니다. 프로테옴 분석 및 자궁 세척에서 바이러스 부하 측정과 함께, 성병 감염 (STI)의 다른 병원균에 대한 면역은 다양한 인구에서 해부 할 수 있습니다.
기술적 고려 사항 - CMC를가 : 분리 및 CMC 샘플을 성공적으로 염색 도전이 될 수 있습니다. CMC 수집 프로토콜의 최적화는 마지막으로 다음 자궁 스크레이퍼 다음에 먼저 CVL 수집의 효율성 및 cytobrush을 강조했다. 이는 후술 다양한 이유로 샘플 배제 가능성 증가로 인해 말초 혈액 연구, 계산에 비해 계획된 샘플 크기를 증가시키는 것이 중요하다.
욕망의 테스트CMC 샘플에 D 흐름 패널 개시를 공부하기 전에 중요합니다. 그것은 특히 단핵구 게이트에, CMC 샘플에서 세포의 형광도를 모니터하는 것이 중요하다. 일부 채널에서 CMC의 형광도는 게이팅 및 신호 - 대 - 잡음 비에 영향을 미칠 수있는, PBMC를 비교하여 상승 될 수있다. 이전 PBMC 샘플을 결정하는 경우 또한, 최적의 전압은 CMC의 샘플을 확인해야한다.
데이터의 무결성을 유지하기 위해, 혈액 오염이나 성병을 혼동와 샘플을 제외하는 것이 중요합니다. 패널 유동 세포 계측법에서 세포 생존 염료의 포함은 비특이적 형광 항체를 차지 죽은 세포를 제외하려면 매우 중요합니다. 대부분의 샘플은 매우 실용적이지만, 그것은 생존의 염료에 의해 세포의 10 ~ 20 %를 제외하는 드문 일이 아니다. CD4와 CD8의 발현에 따라 부분 집합 분석이 계획되면, 분석을 진행하기 최소 100 CD3 + 이벤트를 얻는 것이 중요합니다. 다른 여자로부터 수집 샘플에서도 동일한 여자에서 다른 시점에서 t, 매우 다른 세포 수 (13)를 얻을 수 있습니다.
PBMC 제어 샘플이 CMC의 샘플을 동시에 실행할 수있는 경우에 점막 림프구의 유세포 분석은 종종 더 쉽고 더 성공적이다. 일부 CMC 샘플에서 림프구 인구는 FSC / SSC 게이팅으로 식별하기 어려운 있지만, PBMC 샘플의 포함은 어디 게이트의 더 나은 아이디어를 줄 것이다. 심지어 명확한 림프구 FSC / SSC 인구가없는 샘플에서, 별개의 CD3 + 인구는 식별 할 수 있습니다. 데이터 수집은 시간이 지남에 따라 형광에 게이팅 기술 문제 (흡입 막힘 사이토 등 거품)에 의해 중단 된 경우 아직 샘플 분석을 허용하면서 데이터 수집 아티팩트를 제거 할 수 있습니다. 이러한 게이트 배치 형광 뺀 (FMO) 튜브 적절한 제어가 필요 세포의 수가 cytobrush 샘플을 사용하기에 너무 크게되면 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 수행 될 필요가있다.
"ontent> 복수 연구 CMC 샘플 간의 항원 특이적인 T 세포 반응의 검출을 증명하고있다. CMC 사이토킨 생산은 PMA / Ionomycine, PHA, IFNγ 및 항-CD3 CMC 자극기의 주요 제한의 자극. 하나는에 의해 유도 될 수있다 조건으로 샘플 당 수행 될 수 컨트롤 수를 줄여 셀 번호.주의 깊게 모니터하고 세포 배양 오염을 방지하기 위해 추가 단계를 수행하는 것도 중요하다. 생식기는 멸균 사이트 아니며, 일부 경우에 여분 항생제 세균의 증식을 방지하기 위해 배양 배지에 추가해야합니다. CMC를가 생존의 손실이 거의 동결 보존 할 수 있지만, 복구 세포 확장이 10 계획하지 않는 자극 연구에 냉동 보관 된 시료별로 후보를 만들고, 약 50 %입니다.기술적 고려 사항 - CVLs : CVL의 컬렉션은 일반적으로 샘플로 권 결과UME 반복 ELISA에 의해 단백질 농도의 다수의 분석을 방지한다. 다른 분석은 루미 넥스 플랫폼이나 유동 세포 계측법 플랫폼을 기반으로 사이토 카인 비드 배열입니다. 다중 키트는 매우 작은 샘플 볼륨 (종종 ~ 25 μL)에서 최대 30 분석의 정량화를 허용, 여러 상용 소스에서 사용할 수 있습니다. 이러한 분석의 최적화는 하룻밤 배양 프로토콜을 사용하여 분석의 최적의 검출을 발표했다. 혈장 / 혈청 샘플에서 검출 가능한 몇 가지 분석은 CVL에시켜 검출되지 않습니다. 특히, 스핀 컬럼을 사용 CVL 샘플의 농도는 시료의 농도에 제공된 이점은 종래 비드 어레이 분석을 실행하기가 없다는 것을 시사 어떠한 분석 물의 검출을 개선하지 못했다.
생식기 점막 고유의 교란 요인 : FGT 면역학의 연구는 인정 처리하고 가능한 한 많은 혼란 변수를 고려해야합니다. 월경주기의 시간지금처럼 말초 혈액 면역 28에 영향을 설명하고, 가능성이 큰 CMC 표현형 세포 구성에 미치는 영향뿐만 아니라 CVL 샘플 (29)로부터 수집 된 단백질을 발휘되었습니다. 월경주기 상에 시료 채취 동기화는 마지막 월경 첫날 이후 에스트로겐 / 프로게스테론 수준 또는 일에 의해 측정 여부, 데이터 가변성을 감소시키는 바람직한 방법이다. 호르몬 피임의 사용은 또한 크게 점막 환경 영향과 연구를 설계하거나 분석 할 때 그 효과가 고려되어야한다. 세균성 vaginosis (BV)의 결과로 질 식물의 변화는 면역 환경 및 세포 표현형을 수정합니다. BV는 그람 염색하여 진단 할 수 있으며, 누젠트 점수는 BV의 교란 효과를 제어하기 위해 설정 될 수있다.
정액에 알로 - 응답 CEL에 신속하고 극적인 변화를 유도 할 수 있기 때문에 성적 활동은 또한 생식기 면역학에 심대한 영향을L 표현형 및 거래. 사실, 위 Lajoie 등. 성 노동의 개시 후 처음 몇 년 동안 발생하는 변화와 성 노동자와 비 성 노동자 집단 사이의 CVL 단백질 구성의 차이를 설명했다.
마지막으로, douching 문화적 관행은 점막 샘플링에 더 변화를 소개합니다. (표백제, 세제, 라임 주스 등)에 사용되는 시약에 따라, douching는 세포 인구의 주파수 / 표현형을 줄일 수 있습니다, 또는 다른 샘플에 비해 형광도를 변경합니다. 이상적으로는, 샘플링을 cytobrush 이전 douching는 기부자들 낙담한다.
미래의 응용 프로그램 : 호르몬 / 생리 변화, 바이러스 / 세균 감염 및 / 후 폐경 전에, 점막 샘플의 분석은 성병 / 점막 병원균에 대한 백신 연구에 특히 관련이 동안 점막 면역의 조절에 중요한 통찰력을 산출뿐만 아니라. HIV의 경우에,백신 연구의 주요한 목적은 점막 항체 또는 T 세포 반응을 유도하는 경우, CMC 기반 분석법의 개발은 보호 상관물을 결정하는데 중요한 역할을 할 것이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
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