Introduction
नए एचआईवी संक्रमण के बहुमत दुनिया भर में महिलाओं के लिए 2011 में (यूएनएड्स 1) नए संक्रमण के 47% का प्रतिनिधित्व करने के साथ, विषमलैंगिक प्रसारण के माध्यम से उत्पन्न होती हैं. महिला जननांग पथ (FGT), एचआईवी और अन्य यौन संचारित रोगजनकों के लिए मुख्य प्रवेश पोर्टलों में से एक को समझना, संक्रमण को रोकने के लिए कारगर रणनीति पाने की राह पर उच्च महत्व का है. जननांग म्यूकोसा में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया स्पष्ट रूप से अद्वितीय हैं और परिधीय रक्त 2 में मापा उन लोगों से अलग. हालांकि, FGT में प्रतिरक्षा गतिशीलता की मौजूदा ज्ञान पर सबसे अच्छा सीमित है. तिथि करने के लिए, mucosal प्रतिरक्षा पर्यावरण की पढ़ाई काफी हद तक यह संक्रमण के बाद mucosal ऊतकों में जल्दी घटनाओं बाद रोग प्रगति 3,4 पर एक मजबूत प्रभाव है कि स्पष्ट हो गया है, जहां पेट जुड़े lymphoid ऊतकों (GALT), पर ध्यान केंद्रित किया है. जननांग म्यूकोसा से नमूने इकट्ठा करने के लिए एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है और लाख के लिए कम से कम आंशिक रूप से जिम्मेदार हैFGT के इम्यूनोलॉजी की समझ का कश्मीर. FGT इस स्थान से नमूने इकट्ठा करने और विश्लेषण करने के लिए कारगर तरीकों में जरूरी है कि अलग वातावरण के संदर्भ में मेजबान और रोगज़नक़ के बीच प्रतिरक्षा गतिशील की पहेली को सुलझाने.
FGT दो वर्गों में बांटा गया है: फैलोपियन ट्यूब, अंतर्गर्भाशयकला और अंतर्गर्भाशयग्रीवा, और बहिर्जरायुग्रीवा होता है जो निचले पथ और योनि भी शामिल है कि ऊपरी प्रजनन पथ (Kaushic द्वारा समीक्षा एट अल 5). यह इन अलग अलग साइटों के सापेक्ष योगदान एचआईवी संक्रमण के लिए है क्या अभी भी स्पष्ट नहीं है, लेकिन यह दोनों साइटों एचआईवी प्रविष्टि 6 में योगदान कर सकता है कि माना जाता है. टी कोशिकाओं मैक्रोफेज (रोड्रिगेज-गार्सिया में समीक्षा एट अल 2) लगभग 10% शामिल है, जबकि ऊपरी और निचले प्रजनन इलाकों में ल्यूकोसाइट के 40-50% का प्रतिनिधित्व करते हैं. टी कोशिकाओं योनि, गर्भाशय ग्रीवा, और अंतर्गर्भाशयकला में पता लगाया जा सकता है. मैक्रोफेज और अधिक मजबूती locali हैंवे दोनों के ऊतकों में पाया जा सकता है, गर्भाशय ग्रीवा से अंतर्गर्भाशयकला और myometrial संयोजी ऊतक में जेड. अंत में, plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं (पीडीसी) और Langerhans कोशिकाओं को भी FGT ऊतकों में पाया जा सकता है. phenotype और प्रतिरक्षा आबादी और एचआईवी संक्रमण के लिए अपनी संवेदनशीलता का अनुपात हार्मोनल चक्र के अनुसार महत्वपूर्ण बात भिन्न हो सकते हैं, हार्मोनल गर्भ निरोधकों, बैक्टीरियल vaginosis या यौन गतिविधियों 5,7-9 का उपयोग.
विविध तरीकों FGT की प्रतिरक्षा आबादी और पर्यावरण अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है. सरवाइकल बायोप्सी, ग्रीवा cytobrushes और cervicovaginal lavages (CVL) 10-12 सबसे अधिक साहित्य भर में इस्तेमाल कर रहे हैं. पीबीएस पानी से धोना द्वारा CVL संग्रह सरलतम विधि है और बेहद कम सेल उपज में प्रतिरक्षा modulatory प्रोटीन लेकिन परिणाम के अध्ययन की अनुमति देता है, और इसलिए FGT 13 की प्रतिरक्षा सेल आबादी के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है. CVL नमूने, दूसरे हाथ पर, v रहे हैंऐसे एलिसा, साइटोकाइन मनका सरणी 14 या मास स्पेक्ट्रोमेट्री 15,16 जैसे तरीकों का उपयोग विभिन्न साइटोकिन्स, chemokines या रोगाणुरोधी कारकों की अभिव्यक्ति को मापने के द्वारा FGT की प्रतिरक्षा पर्यावरण के मूल्यांकन के लिए उपयोगी ery. प्रतिरक्षा सेल आवृत्तियों, phenotypes और कार्यों की विशेषता ग्रीवा cytobrush से या गर्भाशय ग्रीवा बायोप्सी नमूना द्वारा गर्भाशय ग्रीवा कोशिकाओं mononuclear (सीएमसी) को इकट्ठा करके प्राप्त किया जा सकता है.
सरवाइकल बायोप्सी नमूना रक्तस्राव की बेचैनी और खतरा बढ़ जाता है और महिला को 12 साल की प्रतिरक्षा स्थिति के आधार पर प्रक्रिया के बाद चंगा करने के लिए 2-11 दिन लगते हैं कि एक आक्रामक तरीका है. दूसरी ओर, ग्रीवा cytobrushes, एकत्र कोशिकाओं की कम उपज के बावजूद, FGT से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक कम आक्रामक और अधिक सुविधाजनक तरीका है. दोनों तरीकों CD45 + ल्यूकोसाइट की ही उपज तक पहुँच सकते हैं, लेकिन दो अनुक्रमिक ग्रीवा cytobrushes निहित कोशिकाओं का एक ही राशि प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं मैंn एक बायोप्सी 13. बहरहाल, cytobrush नमूने अभी भी 14 प्रवाह cytometry से आगे पूर्व vivo phenotyping के लिए कोशिकाओं का एक स्वीकार्य संख्या (लगभग 5,000 CD45 + कोशिकाओं / cytobrush) प्रदान करता है. उत्तेजना और intracellular प्रवाह cytometry या qPCR एचआईवी विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 17 या वें सेल ध्रुवीकरण 18 की पहचान करने के लिए cytobrush व्युत्पन्न CMCs का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है के रूप में इसके अलावा, कार्यात्मक विशेषता, इन नमूनों पर किया जा सकता है. टी कोशिकाओं की आबादी का विस्तार भी CMCs 19 के साथ कार्यात्मक अध्ययन की सुविधा हो सकती है.
यह बायोप्सी और cytobrushes FGT के विशिष्ट भागों का नमूना है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. ग्रीवा cytobrushes अंतर्गर्भाशयग्रीवा और शायद परिवर्तन क्षेत्र के उपकला से ली गई कोशिकाओं को इकट्ठा करने, गर्भाशय ग्रीवा ओएस नमूना जबकि बायोप्सी, बहिर्जरायुग्रीवा 12,13 के उपकला और stroma के बेहतर भाग से निकाली गई है. Cytobrush नमूने इसलिए फिर से एक नमूनाबायोप्सी, एक स्क्वैमस स्तरीकृत उपकला 5 से अटे एक क्षेत्र शामिल हैं, जबकि इलाके, खानेदार उपकला की एक परत से बना. नतीजतन, ग्रीवा बायोप्सी और cytobrush द्वारा एकत्र श्वेतकोशिका आबादी की प्रकृति अलग है. Cytobrushes CD14 + monocytes / मैक्रोफेज 13 के एक उच्च अनुपात के संग्रह में परिणाम जबकि बायोप्सी, CD3 + टी कोशिकाओं की एक उच्च अनुपात इकट्ठा.
FGT के इम्यूनोलॉजी के अध्ययन के कई साल 20-22 के लिए एक ब्याज कर दिया गया है और हम cytobrush व्युत्पन्न CMCs के अध्ययन के साथ विशेषज्ञता का एक बड़ा सौदा जमा किया है. हमारी पढ़ाई, एचआईवी संक्रमित असंक्रमित और एचआईवी उजागर seronegative नैरोबी, केन्या से (HESN) महिला यौनकर्मियों के अध्ययन पर ज्यादातर ध्यान केंद्रित. एचआईवी preferentially FGT में एचआईवी से लक्षित किया जा सकता है कि सक्रिय कोशिकाओं के 23 और कम संख्या एचआईवी के अधिग्रहण के खिलाफ संरक्षण के लिए योगदान कर सकता सक्रिय टी कोशिकाओं में replicates. इस परिकल्पना, कई Studi के साथ लाइन मेंतों अभी तक 24,25 असंक्रमित बने हुए हैं, और इस मौन phenotype भी FGT 14 में मनाया जाता है अत्यधिक एचआईवी के संपर्क में हैं जो HESN यौनकर्मियों के बीच कम प्रतिरक्षा सक्रियण का वर्णन किया है. यहाँ, हम प्रसंस्करण के लिए पद्धति का वर्णन और पूर्व vivo प्रवाह cytometry द्वारा गर्भाशय ग्रीवा cytobrushes से व्युत्पन्न सीएमसी नमूनों में टी कोशिकाओं सक्रियण का आकलन.
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Protocol
आचार बयान: Manitoba के विश्वविद्यालय और नैरोबी के Kenyatta नेशनल अस्पताल / विश्वविद्यालय दोनों के अनुसंधान नैतिकता बोर्डों इस अध्ययन को मंजूरी दे दी और लिखित सूचित सहमति सभी अध्ययन प्रतिभागियों से प्राप्त हुई थी.
1. मीडिया की तैयारी और सीएमसी संग्रह ट्यूबों
- फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) समाधान (137.93 मिमी NaCl, 2.67 मिमी KCl, 8.1 मिमी ना 2 4 HPO, 1.47 मिमी के.एच. 2 पीओ 4) तैयार करें. बाँझपन के लिए आटोक्लेव. यह कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- पूर्व विभाज्य 5 एमएल पीबीएस में 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब (एकत्र होने के लिए नमूना प्रति एक) और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान नमूना संग्रह समय तक.
- भंडारण के लिए पानी से धोना एकत्र करने के लिए नमूना प्रति 2-4 cryovials या 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों लेबल.
- सेल संस्कृति मीडिया तैयार: 1640 RPMI + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / Amphotericin बी (अंतिम एकाग्रता 100 इकाइयों / एमएल, 100 माइक्रोग्राम / एमएल और 250 एनजी / एमएल, respectivकोई FCS / FBS के साथ एली ने कहा,.
Cytobrush नमूने की 2. संग्रह
Cytobrush नमूनों का संग्रह एक प्रशिक्षित एमडी या स्त्री रोग विशेषज्ञ द्वारा निष्पादित किया जाना चाहिए कि एक गैर इनवेसिव प्रक्रिया है.
- एक cytobrush और एक लकड़ी या प्लास्टिक खुरचनी दोनों का उपयोग कर ग्रीवा कोशिकाओं mononuclear (सीएमसी) लीजिए. (चित्रा 1) खुरचनी डालने और गर्भाशय ग्रीवा ओएस के चारों ओर घूर्णन द्वारा वीक्षक परीक्षा के तहत प्रतिभागी से सीएमसी लीजिए. , Endocervical ओएस में cytobrush डालें 360 डिग्री बारी बारी से, और तुरंत पीबीएस के 5 मिलीलीटर युक्त 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में cytobrush और खुरचनी दोनों जगह.
- प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर / बर्फ पर नमूने रखें. संग्रह के 2 घंटे के भीतर सेल व्यवहार्यता, प्रक्रिया के नमूने बनाए रखने के लिए.
- यदि संभव हो तो, परिधीय रक्त mononuclear सेल सीएमसी विश्लेषण के लिए एक तुलनित्र / नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए (PBMC) अलगाव के लिए हरी शीर्ष हेपरिन vacutainers में मिलान रक्त के नमूने लेने.
CMCs के 3. अलगाव
डबल दस्ताने के साथ एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में, एक जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला में नमूना प्रसंस्करण प्रदर्शन.
- संग्रह के दौरान, सीएमसी नमूने खून से दूषित हो सकता है. अंतिम नमूना में PBMC के confounding शामिल किए जाने को रोकने के क्रम में अध्ययन से दिखाई रक्त संदूषण के साथ नमूनों को बाहर निकालें. कारण सीएमसी नमूनों से अलग लिम्फोसाइटों की कम संख्या को मामूली रक्त संदूषण आसानी सीएमसी लिम्फोसाइट घटक डूब कर सकते हैं.
- ब्रश से कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए 45 सेकंड के लिए cytobrush और खुरचनी दोनों युक्त भंवर फाल्कन ट्यूबों. नमूने इस प्रक्रिया के दौरान झागदार बन सकता है; यह सामान्य है.
- खुरचनी बंद किसी भी शेष सामग्री परिमार्जन, और एक ब्लीच समाधान में खुरचनी त्यागने के लिए cytobrush का प्रयोग करें. ब्रश / खुरचनी से जुड़ी किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, अंगूठे और तर्जनी के बीच खुरचनी निचोड़ एक ताजा दस्ताने का उपयोग करें.कोशिकाओं और पीबीएस वही 50 मिलीलीटर ट्यूब में एकत्र होने की अनुमति, ब्रश नीचे स्लाइड. एक ब्लीच समाधान में cytobrush त्यागें, और दस्ताने त्यागें.
महत्वपूर्ण: प्रत्येक नमूने के लिए एक नया दस्ताने का प्रयोग करें. - एक ताजा 50 एमएल फाल्कन ट्यूब के लिए एक 100 माइक्रोन नायलॉन सेल झरनी फिट. एक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, नमूना ट्यूब से पीबीएस सेल निलंबन लीजिए और ताजा ट्यूब में झरनी के माध्यम से फिल्टर.
- मूल नमूना ट्यूब RPMI 1640 के 5 मिलीलीटर जोड़ें. हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, RPMI साथ नमूना ट्यूब के पक्ष धोने, और नया संग्रह ट्यूब के लिए फिल्टर के माध्यम से हस्तांतरण. साथ ही RPMI साथ नायलॉन फिल्टर के नीचे धो लें.
- 514 x जी पर 10 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र. यह सीएमसी गोली की dislodging को रोकने के क्रम में, इस कदम के दौरान अपकेंद्रित्र ब्रेक से छोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है.
- धीरे गोली को परेशान नहीं करने के ख्याल रख रही है, ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला हटायें. गोली आकार उच्च चर हो जाएगा; इतने मेंअन्य मामलों में, गोली मुश्किल से दिखाई और अत्यधिक पारदर्शी है, जबकि मुझे नमूने, गोली, कारण उपकला कोशिकाओं की बड़ी संख्या की उपस्थिति के लिए काफी बड़ा है.
- फाल्कन ट्यूब की कोमल आंदोलन के द्वारा गोली Resuspend. नमूना धोने के लिए पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
- कोई अपकेंद्रित्र ब्रेक के साथ 514 XG पर 10 मिनट के लिए फिर से अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ऊपर के रूप में गोली फिर से निलंबित. कोशिकाओं (एक PBMC cryopreservation प्रोटोकॉल का उपयोग) cryopreservation, उत्तेजना या phenotyping प्रवाह cytometry या तो के लिए तैयार हैं.
4. सीएमसी सतह धुंधला और फ्लो
- अवरुद्ध समाधान के 100 μl में कदम 3.10 से गोली Resuspend और एक 96 अच्छी तरह से थाली या FACS ट्यूब में या तो हस्तांतरण. अवरुद्ध समाधान (Fcγ रिसेप्टर्स ब्लॉक) के रूप में नुस्खा है: 1.8 μl माउस आईजीजी (अंतिम एकाग्रता 0.2 माइक्रोग्राम / μl), 5 μl FBS और 93.2 μl FACS धोने (पीबीएस 2% FBS).धुंधला गोली आकार काफी छोटे हैं, तो एक 96 अच्छी तरह से थाली में प्रदर्शन किया जा सकता है, लेकिन छर्रों नियमित बड़े हैं FACS ट्यूबों में प्रदर्शन करने की आवश्यकता हो सकती है. यह तदनुसार एंटीबॉडी टाइट्रेट करना महत्वपूर्ण है.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ / पर 10 मिनट के लिए नमूनों को ब्लॉक
- 96 अच्छी तरह प्लेटें में FACS धो (पीबीएस 2% FBS) के 100 μl, या FACS ट्यूबों में 500 μl के साथ कोशिकाओं को धो लें. कम पर ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र (बंद या एक कम ब्रेक सेटिंग उपलब्ध नहीं है).
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और आंदोलन से सेल गोली फिर से निलंबित. व्यवहार्यता दाग (लाइव मृत fixable व्यवहार्यता डाई) जोड़ें. निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यवहार्यता डाई तैयार करें. यह प्रत्येक प्रयोगशाला / cytometer सेटअप में इस्तेमाल के लिए titrated होना पड़ सकता है. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए सेते
- (96 अच्छी तरह से थाली / FACS ट्यूबों के लिए) कोशिकाओं पीबीएस के 100 μl/500 μl धो लें. कम / कोई ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र. Supernatan निकालेंटी और resuspend कोशिकाओं.
- 100 μl की कुल मात्रा में, सतह मार्कर एंटीबॉडी के कॉकटेल के साथ कोशिकाओं को सेते हैं. महत्वपूर्ण: अनुकूलन और धुंधला नमूना करने से पहले पैनल cytometry प्रत्येक प्रवाह टाइट्रेट. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते
- 4.5 कदम दोहराएँ. एक FACS ट्यूब के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली, स्थानांतरण की कोशिकाओं में धुंधला और 1% paraformaldehyde (पीएफए) युक्त FACS धो के 750 μl के अंतिम मात्रा को पतला (या CytoFix, 4 में 1 पतला). एक प्रवाह cytometer पर डाटा अधिग्रहण करने के लिए आगे बढ़ें.
5. संग्रह और सरवाइकल योनि Lavage की तैयारी (CVL)
- नमूना cytobrush के लिए पहले, बाँझ पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ अंतर्गर्भाशयग्रीवा धोने और पीछे तोरणिका से पानी से धोना निकालना एक सिरिंज का उपयोग करें.
- एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में aspirated पानी से धोना नमूना ले लीजिए और प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर / बर्फ पर रहते हैं.
- सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 7 मिनट के लिए 400 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र.
- सह-70 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीग्राम या 500 μl aliquots, और दुकान में सतह पर तैरनेवाला, विभाज्य नमूना llect Aliquots एलिसा या CVL प्रोटीन का मनका सरणी के विश्लेषण के लिए thawed, लेकिन कई फ्रीज / पिघलना चक्र से बचने के किया जा सकता है.
- अगर वांछित, निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करते हुए आरएनए अभिव्यक्ति को मापने के लिए बाद में शाही सेना में सेलुलर मलबे की गोली resuspend.
6. डाटा अधिग्रहण
- एंटीबॉडी पैनल से मेल खाता है कि मुआवजा ट्यूबों का एक सेट तैयार करते हैं. वर्णक्रमीय ओवरलैप को समायोजित करने के लिए मुआवजा ट्यूबों चलाएँ. कि cytometer किसी भी बहुरंगा प्रवाह पर नमूने पैनल में इस्तेमाल fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए कॉन्फ़िगर किया गया है.
- लिम्फोसाइट आबादी का पता लगाने के क्रम में आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) वोल्टेज समायोजित करने के लिए पहली बार एक PBMC नमूना मोल. एक रैखिक पैमाने पर प्रत्येक अक्ष पर 100 में उन्हें रखने की कोशिश करें. एक PBMC नियंत्रण चल रहा है यह काफी आसान सीएमसी लिम्फोसाइट आबादी को खोजने के लिए कर देगा.
- सीएमसी के नमूने लिए FSC दहलीज कम FSC मूल्यों पर एसएससी अक्ष ऊपर धब्बा कारण PBMC नमूने के सापेक्ष वृद्धि की आवश्यकता हो सकती है.
- प्राप्त करने से पहले प्रत्येक ट्यूब भंवर. एकत्र लिम्फोसाइट फाटक की घटनाओं की संख्या को अधिकतम करने के लिए पूरे ट्यूब मोल. Clogging से बचने के लिए सावधानी से मशीन की निगरानी.
- ऐसे FlowJo के रूप में एक प्रवाह cytometric विश्लेषण कार्यक्रम में डेटा निर्यात करें.
7. Gating रणनीति
- उच्च फॉरवर्ड पक्ष तितर बितर (FSC-एच) का चयन करें / आगे की ओर बिखराव क्षेत्र (FSC-ए) स्वेटर आबादी का निर्धारण करने के लिए.
- अधिग्रहण की गुणवत्ता के लिए नियंत्रित करने के लिए (उदाहरण FITC के रूप में) फ्लोरोसेंट मार्कर बनाम समय का चयन करें. प्रवाह की दर में परिवर्तन डेटा में कलाकृतियों को पेश हो सकता है. प्रवाह की दर में विसंगति से पता चलता है कि किसी भी क्षेत्र को बाहर निकालें.
- SSC-A/FSC-A भूखंड पर लिम्फोसाइट आबादी की पहचान. पहचान की सुविधा के लिए एक PBMC नियंत्रण का प्रयोग करें. सीएमसी लिम्फोसाइट आबादी PBMC नियंत्रण के रूप में स्पष्ट नहीं हो सकता है ध्यान दें. </ ली>
- SSC-A/viability पर गेट जीवित कोशिकाओं से मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए डाई. मृत कोशिकाओं को गैर विशेष रूप से कलाकृतियों को लागू करेगा, जो एंटीबॉडी शामिल कर सकते हैं.
- SSC-A/CD3 पर गेट टी सेल की आबादी की पहचान करने के लिए. इस गेट से, सीडी 4 + और सीडी 8 + आबादी की पहचान.
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Representative Results
Multiparameter फ्लो पहले से uncharacterized ऊतकों में सेल सबसेट के phenotypes और कार्यों को काटना एक शक्तिशाली उपकरण है. सीएमसी नमूनों के विश्लेषण से उचित gating रणनीतियों के साथ लिम्फोसाइट और monocyte आबादी दोनों पर जानकारी प्राप्ति कर सकते हैं.
एक प्रतिनिधि सीएमसी gating रणनीति, एक मेल PBMC प्रोफाइल की तुलना में, चित्रा 2 में दिखाया गया है. FSC एच साजिश बनाम FSC द्वारा एक भी छानने के बाद, PBMC की तुलना में सीएमसी के नमूनों में अत्यधिक प्रचलित हैं जो सेल दोहरी, के बहिष्कार के लिए अनुमति देता है (2A चित्रा). गुणवत्ता नियंत्रण के कारण नमूना झुरमुटों के लिए प्रवाह दर या कलाकृतियों में परिवर्तन आसानी से (चित्रा 2B) की पहचान की जा सकती है, जहां समय, पर gating द्वारा प्रवाह मुद्दों को हटाने शामिल है. लिम्फोसाइट / एककेंद्रकश्वेतकोशिका आबादी की पहचान PBMC और सीएमसी के नमूने (चित्रा 2 बी) दोनों में अपेक्षाकृत समान है. व्यवहार्यता डाई से मृत कोशिकाओं के बहिष्कार के शामिल किए जाने से रोकता हैगैर विशेष रूप से फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी conjugates ले लिया है कि के apoptotic कोशिकाओं. व्यवहार्यता PBMC की तुलना में सीएमसी नमूनों में कम है, और चित्रा (2 बी) नमूने के लिए नमूना से अत्यधिक चर हो सकता है.
इस विश्लेषण टी लिम्फोसाइट आबादी phenotyping पर ध्यान दिया जाएगा, लेकिन सीएमसी नमूने भी monocytes होते हैं. एककेंद्रकश्वेतकोशिका आबादी पर gating के बाद, कोशिकाओं एक व्यवहार्यता डाई और एक डंप चैनल (चित्रा 3) के आधार पर gated हैं. डंप चैनल CD56, CD3 और CD19 के खिलाफ एंटीबॉडी होते हैं, और डंप चैनल नकारात्मक कोशिकाओं पर gating एककेंद्रकश्वेतकोशिका आबादी में किसी भी लिम्फोसाइट प्रदूषण को खत्म होगा. कोशिकाओं तो ऐसे CD16 और CD11c के रूप में मार्करों की अभिव्यक्ति के आधार पर पहचाना जा सकता है. CD3 + लिम्फोसाइट आबादी आमतौर पर PBMC (चित्रा 3 बी, 1 टेबल) की तुलना में सीएमसी के बीच अनुपात में कम हो जाता है. उपकला कोशिकाओं, granulocytes और सीएमसी के नमूने में निहित गैर CD3 + CD45 + ल्यूकोसाइट की उच्च अनुपात डीटी सेल की आबादी से अधिक ominates. सीडी 4 + टी कोशिकाओं (मंझला: 55.30%, IQR: 50.53% -68.18%) और सीडी 8 + टी कोशिकाओं (मंझला: 25.60%, IQR: 21.50% -33.80%) एक कम अनुपात में पाए जाते हैं (सीएमसी के बीच 02:01 के करीब) केन्या (चित्रा -3 सी, 1 टेबल) में वाणिज्यिक सेक्स वर्कर पलटन से स्वस्थ PBMC नमूनों के बीच मनाया 05:01 अनुपात की तुलना में. रक्त में के रूप में, एचआईवी संक्रमण सीडी 4 + कम है, सीएमसी के बीच सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं के अनुपात को प्रभावित करता है: 0.7 करने के लिए सीडी 8 + अनुपात (मंझला: 0.7, IQR: 0.31-2.45) (चित्रा -3 सी, 1 टेबल). हालांकि, यह स्वस्थ व्यक्तियों (चित्रा -3 सी) से सीएमसी आबादी के बीच सीडी 8 + टी कोशिकाओं की एक उच्च अनुपात का पालन करने के लिए असामान्य नहीं है. दिलचस्प है, एक विस्तारित सीडी 4-सीडी 8-(नकारात्मक डबल, डी.एन.) PBMC डी.एन. टी सेल आवृत्ति के लिए टी सेल की आबादी के सापेक्ष एचआईवी नेगेटिव व्यक्तियों (तालिका 1) के कई सीएमसी नमूनों के बीच मनाया जा सकता है. इन परिणामों चमड़ी नमूने 26, यद्यपि के लिए प्राप्त उन लोगों के लिए समान हैंऊ इन कोशिकाओं को खराब होती रहे.
विशिष्ट टी सेल प्ररूपी मार्करों आसानी CMCs के बीच मात्रा निर्धारित कर रहे हैं लेकिन PBMCs से अलग हो सकता, चित्रा 4 PBMCs में अलग लेकिन चित्रा (4 ए) CMCs में लगभग अनुपस्थित है कि एक सीडी 8 + CD161 + + (MAIT) आबादी की पहचान को दर्शाता है. सक्रियण मार्कर CD69 और एचएलए डीआर, प्रवास मार्कर CCR5 या थकावट मार्कर पीडी -1 स्पष्ट रूप से सीडी 4 + या सीडी 8 + आबादी (चित्रा 4 बी) पर पहचाना जा सकता है की अभिव्यक्ति.
CVL में साइटोकिन्स / chemokines की एकाग्रता की मात्रा सीएमसी धुंधला के साथ समानांतर में विश्लेषण किया जा सकता है. इस CVL साइटोकाइन परिवेश (immunoregulatory बनाम समर्थक भड़काऊ) और CMCs के phenotype के बीच संबंध के लिए अनुमति देता है. ये आंकड़े यह भी CMCs पर केमोकाइन रिसेप्टर अभिव्यक्ति की आवृत्ति प्लाज्मा या CVL chemokines 14 या तो के रिश्तेदार अभिव्यक्ति से संबंधित है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तालिका 2 <> / मजबूत CVL में स्वस्थ महिलाओं से एकत्र की है और Milliplex साइटोकाइन मनका सरणी किट द्वारा assayed साइटोकाइन और केमोकाइन analytes का मतलब एकाग्रता इंगित करता है.
महिला प्रजनन पथ के चित्रा 1. एनाटॉमी. बाहरी ओएस दिखा, बाहरी ग्रीवा ओएस, गर्भाशय ग्रीवा नहर और गर्भाशय गुहा गर्भाशय ग्रीवा की. बी) फ्रंट कोण देखने को योनि के संबंध दिखा महिला प्रजनन पथ, और पूर्वकाल और कूल्हों तोरणिका के ए) क्रॉस अनुभागीय दृश्य 12:00 और 6:00 पर क्षेत्रों, क्रमशः. रॉयश एट अल 27 से अनुमति के साथ Reproduced. cytobrush ग्रीवा नहर में डाला और अतिरिक्त सीएमसी एकत्र करने के लिए घुमाया जा रहा है, जबकि गर्भाशय ग्रीवा खुरचनी, सीएमसी एकत्र करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा ओएस के चारों ओर घुमाया जा रहा है. सरवाइकल योनि lavages (CVL)पीबीएस के साथ अंतर्गर्भाशयग्रीवा धोने और पीछे तोरणिका से इकट्ठा करके एकत्र कर रहे हैं.
2. Gating और सीएमसी के नमूनों की गुणवत्ता नियंत्रण चित्रा. ए) FSC एच साजिश बनाम FSC-A द्वारा singlets की पहचान उच्च और खराब गुणवत्ता के नमूने के फिल्टर आधारित सीएमसी अलगाव. बी) उदाहरण कई गुणवत्ता के लिए दिखाए जाते हैं, के बाद भी PBMC नमूनों की तुलना में सीएमसी नमूनों में singlets के कम प्रतिशत को दर्शाता है नियंत्रण कदम. समय बनाम प्रतिदीप्ति (या एसएससी / एफएससी) का gating प्रवाह की दर मुद्दों की पहचान कर सकते हैं और धुंधला कलाकृतियों में हो सकता है कि घटनाओं को छोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. एसएससी बनाम FSC पर आधारित एक लिम्फोसाइट आबादी या आसानी से नमूना के आधार पर पहचाना जा सकता है और नहीं. एक व्यवहार्यता डाई के शामिल किए जाने के कुछ नमूने से कम 50% व्यवहार्य कोशिकाओं को हो सकती है, के रूप में महत्वपूर्ण है. Viabiliकोशिका मृत्यु पर झिल्ली अखंडता के नुकसान डाई सेल के भीतर प्रोटीन पर amine समूहों का उपयोग करने की अनुमति देता है के रूप में Ty (amine प्रतिक्रियाशील) रंजक, अधिक चमकीले जीवित कोशिकाओं से मृत कोशिकाओं दाग. व्यवहार्य कोशिकाओं इसलिए व्यवहार्यता डाई नकारात्मक जनसंख्या पर gating द्वारा पहचाने जाते हैं.
टी सेल सबसेट का आंकड़ा 3. पहचान. ए) सीएमसी नमूनों के बीच CD3 + आबादी PBMC नमूनों की तुलना में आम तौर पर लिम्फोसाइट गेट के एक छोटे अनुपात है. के रूप में दिखाया सीएमसी नमूने, टी सेल आबादी के आकार में भी अधिक चर रहे हैं. बी) सीडी 4 +, सीडी 8 + और सीडी 4-सीडी 8-टी सेल आबादी आसानी सीएमसी और PBMC नमूने दोनों में पहचाने जाते हैं. सीडी 4: CD8 टी सेल अनुपात के रूप में दिखाया, CMCs बीच नमूने के लिए नमूना से भिन्न हो सकती हैं. दिखाया गया डेटा एचआईवी uninfected महिलाओं से एकत्र की गई थी.
सीएमसी नमूनों में चित्रा 4. टी सेल phenotypes. ए) mucosal आसानी PBMC नमूनों में पहचान की है कि (MAIT) सीडी 8 + CD161 + + आबादी CMCs में लगभग पूरी तरह से अनुपस्थित है अपरिवर्तनीय टी कोशिकाओं जुड़े. सीडी 8 + CD161 + टी कोशिकाओं दोनों नमूनों में पहचाना जा सकता है. CD69, एचएलए डीआर, CCR5 और पीडी -1 सहित प्ररूपी मार्करों के बी) CMCs प्रदर्शनी अभिव्यक्ति. गेट्स प्रतिदीप्ति शून्य से एक (FMO) नियंत्रण के आधार पर तैयार किया गया. दिखाया गया डेटा एचआईवी uninfected महिलाओं से एकत्र की गई थी.
| CMCs | PBMCs | |||||
| आबादी | एचआईवी + (n = 34) | एचआईवी (एन = 44) | पी मूल्य एक | एचआईवी + (n = 28) | एचआईवी (एन = 35) | पी मूल्य एक |
| मंझला (IQR) | मंझला (IQR) | मंझला (IQR) | मंझला (IQR) | |||
| % लाइव लिम्फोसाइटों | 85.65 (60.25-92.63) | 88.70 (74.85-95.38) | 0.1193 | - | - | |
| लाइव लिम्फोसाइट गेट में% CD3 + | 5.94 (0.90-16.80) | 1.44 (0.39-8.46) | 0.0303 | 41.15 (17.08-62.10) | 41.90 (20.40-51.30) | 0.4231 |
| पी मूल्य बी | <0.0001 | <0.0001 | ||||
| CD3 + फाटक में% सीडी 8 + | 43.20 (25.75-66.00) | 25.60 (21.50-33.80) | 0.001 | 30.05 (22.75-38.78) | 14.60 (8.01-24.80) | <0.0001 |
| पी मूल्य बी | 0.0291 | <0.0001 | ||||
| CD3 + फाटक में% सीडी 4 + | 31.10 (20.45-63.10) | 55.30 (50.53-68.18) | 0.0003 | 56.10 (50.10-61.28) | 77.20 (65.90-92.80) | <0.0001 |
| पी मूल्य बी | 0.002 | <0.0001 | ||||
| अनुपात सीडी 4: सीडी 8 | 0.71 (0.31-2.45) | 2.09 (1.55-3.01) | 0.0003 | 1.92 (1.44-2.39) | 5.34 (2.66-10.77) | <0.0001 |
| पी मूल्य बी | 0.004 | <0.0001 | ||||
| CD3 + फाटक में% डी.एन. | 10.40 (6.36-14.30) | 10.70 (6.76-19.10) | 0.4793 | 9.58 (6.65-15.98) | 7.01 (5.26-8.07) | 0.0032 |
पी मूल्य | 0.8338 | 0.0006 | | ||||
तालिका 1. CMCs और PBMCs में टी सेल सबसेट के रिश्तेदार अनुपात. 44 एचआईवी नेगेटिव और 34 एचआईवी पॉजिटिव महिला यौनकर्मियों और PBMC नमूने 35 एचआईवी नेगेटिव से और 28 एचआईवी सकारात्मक जीवित कोशिकाओं की उनके रिश्तेदार अनुपात के लिए तुलना में थे से CMCsamples, CD3 + टी कोशिकाओं और सीडी 4 +, सीडी 8 + और सीडी 8-सीडी 4-DN टी सेल सबसेट. डेटा औसत (25 वें -75 अन्तःचतुर्थक, IQR ध) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. समूहों के बीच अंतर मान व्हिटनी परीक्षण द्वारा गणना की गई. पी मानों एक एचआईवी + और एचआईवी या सीएमसी और PBMC ख डेटा के बीच एक तुलना के परिणाम से संकेत मिलता है.
| विश्लेष्य पदार्थ | एक (एसटीडी देव.) मतलब | |
| स्नातकोत्तर / मिलीलीटर | स्नातकोत्तर / मिलीलीटर | |
| एमआईपी -3 ए | 35.5 (90.6) | 2.9 |
| मिग | 1447 (3026) | 19.4 |
| ITAC | 2.7 (6.3) | 0.8 |
| Fractalkine | 51.6 (69.5) | 10.6 |
| IFN-A2 | 24.0 (12.0) | 40.6 |
| IFN-G | 3.9 (14.2) | 0.3 | आईएल -1 ए | 268.4 (721.3) | 6.4 |
| आईएल -1 बी | 46.8 (126.2) | 0.7 |
| आईएल 1Ra | 4967.0 (3597) | 5.5 |
| आईएल -2 | 0.9 (2.6) | 0.6 |
| आईएल -6 | 14.8 (30.5) | 0.7 |
| आईएल -7 | 6.3 (10.1) | 0.1 |
| आईएल -8 | 1491 (2126) | 0.3 |
| 4.5 (8.6) | 0.5 | |
| आईएल -15 | 1.4 (2.7) | 0.7 |
| आईएल -17 | 1.1 (2.2) | 0.3 |
| आईपी 10 | 381.4 (1100) | 2.2 |
| MCP-1 | 129.4 (340.4) | 1.6 |
| MCP-3 | 5.9 (7.1) | 3.7 |
| एमडीसी | 84.2 (94.6) | 6.9 |
| एमआईपी-1A 20.9 (28.9) | 6.4 | |
| एमआईपी -1 बी | 28.5 (42.6) | 8.9 |
| sCD40L | 10.8 (19.3) | 9 |
| एसआईएल-2RA | 8.4 (9.8) | 7.7 |
| TNF-A | 1.9 (4.1) | 0.1 |
CVL में साइटोकिन्स और chemokines की तालिका 2. अभिव्यक्ति. मध्य मासिक धर्म चक्र में महिला सेक्स वर्कर पलटन के 51 एचआईवी uninfected (गैर HESN) प्रतिभागियों से नमूने Milliplex एमएपी मानव Cytokine / प्रतिलिपि मनका का उपयोग साइटोकाइन / केमोकाइन एकाग्रता के लिए assayed गया सरणी किट निर्माता के अनुसारदो प्रतियों में assayed के रातोंरात प्रोटोकॉल,. IFN: इंटरफेरॉन; एमसीपी: monocyte chemotactic प्रोटीन; एमडीसी: बृहतभक्षककोशिका व्युत्पन्न chemokines, एस: घुलनशील; TNF: ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर; एमआईपी: बृहतभक्षककोशिका भड़काऊ प्रोटीन; ITAC: इंटरफेरॉन inductible टी सेल अल्फा chemoattractant; मिग: गामा इंटरफेरॉन द्वारा प्रेरित monokine; आईपी 10; इंटरफेरॉन inductible प्रोटीन. एक मान पता लगाने की सीमा से नीचे का पता लगाने के आधे सीमा के एक मूल्य सौंपा गया.
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Discussion
महिला जननांग पथ (FGT) में प्रतिरक्षा करने के लिए सम्मान के साथ ज्ञान में बड़े अंतराल को देखते हुए, CMCs के प्ररूपी विश्लेषण ग्रीवा में कई लिम्फोसाइट आबादी में अंतर्दृष्टि की एक विस्तृत सरणी प्रदान कर सकते हैं. प्रोटिओमिक विश्लेषण और गर्भाशय ग्रीवा के पानी से धोना में वायरल लोड माप के साथ युग्मित, यौन संचारित संक्रमण (एसटीआई) है और अन्य रोगजनकों के लिए प्रतिरक्षा के विभिन्न आबादी में विच्छेदित किया जा सकता है.
तकनीकी कारणों से - CMCs: अलगाव और सीएमसी के नमूनों की सफल धुंधला चुनौतीपूर्ण हो सकता है. सीएमसी संग्रह प्रोटोकॉल का अनुकूलन अंत में फिर ग्रीवा खुरचनी द्वारा पीछा पहली CVL एकत्रित की प्रभावशीलता, और cytobrush पर जोर दिया है. यह नीचे चर्चा के कारणों की एक किस्म के लिए नमूना बहिष्कार की वृद्धि की संभावना के कारण परिधीय रक्त अध्ययन, के लिए गणना की तुलना में योजना बनाई नमूना आकार को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है.
इच्छा का परीक्षणसीएमसी नमूनों पर डी प्रवाह पैनल दीक्षा अध्ययन करने से पहले महत्वपूर्ण है. यह विशेष रूप से एककेंद्रकश्वेतकोशिका गेट में, सीएमसी नमूनों में सेल autofluorescence नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है. कुछ चैनलों में सीएमसी autofluorescence gating और संकेत करने वाली शोर अनुपात को प्रभावित कर सकता है, जो PBMCs की तुलना में ऊपर उठाया जा सकता है. पहले से PBMC नमूनों पर निर्धारित इसके अलावा, अगर इष्टतम voltages सीएमसी नमूने के लिए पुष्टि की जानी चाहिए.
डेटा अखंडता की रक्षा करने के लिए, यह रक्त संक्रमण या यौन रोगों confounding नमूनों के साथ बाहर करने के लिए महत्वपूर्ण है. पैनल प्रवाह cytometry में एक सेल व्यवहार्यता डाई का समावेश गैर विशेष रूप से फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी ऊपर ले कि मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए महत्वपूर्ण है. सबसे नमूने अत्यधिक व्यवहार्य हो रहे हैं, यह व्यवहार्यता डाई द्वारा कोशिकाओं के 10-20% बाहर करने के लिए असामान्य नहीं है. CD4 और CD8 अभिव्यक्ति पर आधारित सबसेट विश्लेषण की योजना बनाई है, तो इसे विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने के लिए कम से कम 100 CD3 + घटनाओं प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. अलग महिलाओं से एकत्र नमूनों, और यहां तक कि एक ही औरत को एक से अलग अलग समय बिंदुओं टी, एकदम अलग सेल नंबर 13 उपज कर सकते हैं.
एक PBMC नियंत्रण नमूना सीएमसी नमूनों के साथ एक साथ चलाया जा सकता है अगर mucosal लिम्फोसाइटों के प्रवाह cytometric विश्लेषण अक्सर आसान और अधिक सफल है. कुछ सीएमसी नमूनों में लिम्फोसाइट आबादी FSC / एसएससी gating द्वारा की पहचान मुश्किल है, लेकिन PBMC नमूना का समावेश जहां फाटक के पास की एक बेहतर विचार दे देंगे. यहां तक कि एक स्पष्ट लिम्फोसाइट FSC / एसएससी आबादी बिना नमूने में, अलग CD3 + आबादी पहचाना जा सकता है. डाटा अधिग्रहण समय के साथ प्रतिदीप्ति पर gating तकनीकी मुद्दों (सेवन clogging cytometer, आदि, बुलबुले) से बाधित है, तो अभी भी नमूना विश्लेषण की अनुमति है जबकि डेटा संग्रह कलाकृतियों को हटा सकते हैं. ऐसे फाटक प्लेसमेंट के लिए प्रतिदीप्ति शून्य से एक (FMO) ट्यूबों के रूप में उपयुक्त नियंत्रण आवश्यक कोशिकाओं की संख्या cytobrush नमूने का उपयोग करने के लिए भी पर्याप्त है जब परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) पर प्रदर्शन करने की आवश्यकता हो सकती है.
"ontent> कई अध्ययनों सीएमसी नमूनों के बीच प्रतिजन विशेष टी सेल प्रतिक्रिया का पता लगाने का प्रदर्शन किया है. सीएमसी cytokine उत्पादन भी पीएमए / Ionomycine, संसदीय सौध, IFNγ और विरोधी CD3 सीएमसी stimulations के प्रमुख सीमाओं की उत्तेजना. एक है द्वारा प्रेरित किया जा सकता है स्थितियां और नमूना प्रति प्रदर्शन किया जा सकता है कि नियंत्रण की संख्या कम कर देता है जो सेल नंबर,. यह ध्यान से नजर रखने और सेल संस्कृति प्रदूषण को रोकने के लिए अतिरिक्त कदम उठाने के लिए भी महत्वपूर्ण है. जननांग पथ एक बाँझ साइट नहीं है, और कुछ मामलों में अतिरिक्त एंटीबायोटिक दवाओं बैक्टीरियल अतिवृद्धि को रोकने के लिए संस्कृति मीडिया में जोड़ा जाना चाहिए. CMCs व्यवहार्यता का थोड़ा नुकसान के साथ cryopreserved जा सकता है, वसूली सेल विस्तार 10 की योजना बनाई है जब तक उत्तेजना पढ़ाई के लिए cryopreserved नमूने गरीब उम्मीदवार बना रही है, लगभग 50% है.तकनीकी कारणों से - CVLs: CVL का संग्रह आमतौर पर सीमित नमूना खंड में परिणामUme, दोहराया एलिसा द्वारा प्रोटीन सांद्रता की एक बड़ी संख्या के विश्लेषण को रोकने. एक वैकल्पिक परख Luminex मंच या फ्लो प्लेटफार्म पर आधारित साइटोकाइन मनका सरणी, है. मल्टिप्लेक्स किट एक बेहद छोटा सा नमूना मात्रा (अक्सर ~ 25 μl) में करने के लिए 30 analytes की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है, कई वाणिज्यिक स्रोतों से उपलब्ध हैं. इन assays के अनुकूलन रात ऊष्मायन प्रोटोकॉल का उपयोग analytes की इष्टतम पहचान उजागर किया है. प्लाज्मा / सीरम नमूनों में detectible हैं कि कुछ analytes CVL में detectible नहीं हैं. विशेष रूप से, स्पिन स्तंभों का उपयोग CVL नमूनों की एकाग्रता नमूना एकाग्रता के लिए कोई लाभ पिछले मनका सरणी परख चलाने के लिए नहीं है, सुझाव है कि किसी भी का पता लगाने में सुधार नहीं किया.
जननांग mucosa के लिए विशिष्ट confounders: FGT इम्यूनोलॉजी के अध्ययन को स्वीकार करते हैं देखभाल करने के लिए और संभव के रूप में कई confounding चर के लिए खाते चाहिए. मासिक धर्म चक्र के घंटेके रूप में अब परिधीय रक्त उन्मुक्ति 28 प्रभाव को दिखा, और संभावना अधिक सीएमसी phenotype और कोशिका की संरचना पर प्रभाव डालता है और साथ ही CVL नमूने 29 से एकत्र प्रोटीन डालती गया. मासिक धर्म चक्र के चरण के लिए नमूना संग्रह तुल्यकालन पिछले मासिक धर्म के पहले दिन के बाद एस्ट्रोजन / प्रोजेस्टेरोन स्तर या दिनों से मापा, चाहे डेटा परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए पसंदीदा तरीका है. हार्मोनल गर्भनिरोधक का उपयोग भी बहुत mucosal वातावरण को प्रभावित करती है और एक अध्ययन डिजाइन या विश्लेषण करते समय उसके प्रभाव को ध्यान में रखा जाना चाहिए. बैक्टीरियल vaginosis (BV) में जिसके परिणामस्वरूप योनि वनस्पति के बदलाव भी प्रतिरक्षा पर्यावरण और सेलुलर phenotypes संशोधित करता है. बी.वी. ग्राम धुंधला से निदान किया जा सकता है और एक Nugent स्कोर बी.वी. के confounding प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए स्थापित किया जा सकता है.
वीर्य को allo-प्रतिक्रियाओं सेल में तेजी और नाटकीय परिवर्तन पैदा कर सकते हैं के बाद से यौन गतिविधि भी, जननांग इम्यूनोलॉजी पर गहरा प्रभाव पड़ता हैएल phenotype और तस्करी. दरअसल, Lajoie एट अल. यौन कार्य की दीक्षा के बाद पहले कुछ वर्षों में होने वाली परिवर्तन के साथ सेक्स वर्कर और गैर सेक्स वर्कर आबादी के बीच CVL प्रोटीन संरचना में अंतर, का वर्णन किया है.
अंत में, इस तरह के douching के रूप में सांस्कृतिक प्रथाओं mucosal नमूने में आगे के परिवर्तन लागू होगा. (ब्लीच, डिटर्जेंट, नीबू का रस, आदि) का इस्तेमाल किया अभिकर्मक पर निर्भर करता है, douching सेल आबादी की आवृत्ति / phenotype कम कर सकते हैं, या अन्य नमूनों की तुलना में autofluorescence बदल. आदर्श रूप में, नमूना cytobrush करने से पहले douching दाताओं के बीच हतोत्साहित किया जाना चाहिए.
भविष्य अनुप्रयोगों: हार्मोनल / मासिक धर्म परिवर्तनशीलता, वायरल / बैक्टीरियल संक्रमण और / के बाद रजोनिवृत्ति से पहले, mucosal नमूनों के विश्लेषण से एसटीआई / mucosal रोगजनकों के खिलाफ टीके के अध्ययन के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है दौरान mucosal उन्मुक्ति के नियमन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि उपज के अलावा. एचआईवी के मामले में,टीका अध्ययन का एक प्रमुख लक्ष्य एक mucosal एंटीबॉडी या टी सेल प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना है जहां, सीएमसी आधारित assays के विकास के संरक्षण के संबद्ध निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभानी होगी.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
References
- Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R. Innate and adaptive anti-HIV immune responses in the female reproductive tract. Journal of reproductive immunology. 97, 74-84 (2013).
- Douek, D. HIV disease progression: immune activation, microbes, and a leaky gut. Topics in HIV medicine : a publication of the International AIDS Society, USA. 15, 114-117 (2007).
- Hofer, U., Speck, R. F. Disturbance of the gut-associated lymphoid tissue is associated with disease progression in chronic HIV infection. Seminars in immunopathology. 31, 257-266 (2009).
- Kaushic, C., Ferreira, V. H., Kafka, J. K., Nazli, A. HIV infection in the female genital tract: discrete influence of the local mucosal microenvironment. American journal of reproductive immunology. 63, 566-575 (2010).
- Hladik, F., Hope, T. J. HIV infection of the genital mucosa in women. Current HIV/AIDS reports. 6, 20-28 (2009).
- Sharkey, D. J., Tremellen, K. P., Jasper, M. J., Gemzell-Danielsson, K., Robertson, S. A. Seminal fluid induces leukocyte recruitment and cytokine and chemokine mRNA expression in the human cervix after coitus. Journal of immunology. 188, 2445-2454 (2012).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal immunology. 6, 1081-1090 (2013).
- St John, E. P., Martinson, J., Simoes, J. A., Landay, A. L., Spear, G. T. Dendritic cell activation and maturation induced by mucosal fluid from women with bacterial vaginosis. Clinical immunology. 125, 95-102 (2007).
- Liebenberg, L. J., et al. Stability and transport of cervical cytobrushes for isolation of mononuclear cells from the female genital tract. Journal of immunological methods. 367, 47-55 (2011).
- Hirbod, T., Kaldensjo, T., Broliden, K. In situ distribution of HIV-binding CCR5 and C-type lectin receptors in the human endocervical mucosa. PloS one. 6, (2011).
- Hasselrot, K., et al. Feasibility and safety of cervical biopsy sampling for mucosal immune studies in female sex workers from Nairobi, Kenya. PloS one. 7, (2012).
- McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, (2014).
- Lajoie, J., et al. A distinct cytokine and chemokine profile at the genital mucosa is associated with HIV-1 protection among HIV-exposed seronegative commercial sex workers. Mucosal immunology. 5, (2012).
- Burgener, A., et al. Comprehensive Proteomic Study Identifies Serpin and Cystatin Antiproteases as Novel Correlates of HIV-1 Resistance in the Cervicovaginal Mucosa of Female Sex Workers. Journal of proteome research. 10, (2011).
- Burgener, A., et al. A systems biology examination of the human female genital tract shows compartmentalization of immune factor expression. Journal of virology. 87, (2013).
- Bere, A., Denny, L., Naicker, P., Burgers, W. A., Passmore, J. A. HIV-specific T cell responses detected in the genital tract of chronically HIV-infected women are largely monofunctional. Immunology. 139, (2013).
- McKinnon, L. R., et al. Characterization of a Human Cervical CD4+ T Cell Subset Coexpressing Multiple Markers of HIV Susceptibility. Journal of immunology. , (2011).
- Bere, A., Denny, L., Burgers, W. A., Passmore, J. A. Polyclonal expansion of cervical cytobrush-derived T cells to investigate HIV-specific responses in the female genital tract. Immunology. 130, 23-33 (2010).
- Iqbal, S. M., et al. Elevated T cell counts and RANTES expression in the genital mucosa of HIV-1-resistant Kenyan commercial sex workers. The Journal of infectious diseases. 192, 728-738 (2005).
- Hirbod, T., et al. Stable CD4 expression and local immune activation in the ectocervical mucosa of HIV-infected women. Journal of immunology. 191, 3948-3954 (2013).
- Horton, R. E., et al. A comparative analysis of gene expression patterns and cell phenotypes between cervical and peripheral blood mononuclear cells. PloS one. 4, (2009).
- Begaud, E., et al. Reduced CD4 T cell activation and in vitro susceptibility to HIV-1 infection in exposed uninfected Central Africans. Retrovirology. 3, 35 (2006).
- McLaren, P. J., et al. HIV-exposed seronegative commercial sex workers show a quiescent phenotype in the CD4+ T cell compartment and reduced expression of HIV-dependent host factors. The Journal of infectious diseases. 202 Suppl 3, (2010).
- Card, C. M., et al. Reduced Cellular Susceptibility to In Vitro HIV Infection Is Associated with CD4T Cell Quiescence. PloS one. 7, (2012).
- Prodger, J. L., et al. Foreskin T-cell subsets differ substantially from blood with respect to HIV co-receptor expression, inflammatory profile, and memory status. Mucosal immunology. 5, 121-128 (2012).
- Reusch, L. M., et al. Nonlinear optical microscopy and ultrasound imaging of human cervical structure. Journal of biomedical optics. 18, (2013).
- Oertelt-Prigione, S.
- Rahman, S., et al. Mucosal serpin A1 and A3 levels in HIV highly exposed sero-negative women are affected by the menstrual cycle and hormonal contraceptives but are independent of epidemiological confounders. American journal of reproductive immunology. 69, 64-72 (2013).
