Introduction
La majorité des nouvelles infections à VIH dans le monde se pose par transmission hétérosexuelle, les femmes représentent 47% des nouvelles infections en 2011 (ONUSIDA 1). Comprendre les voies génitales féminines (FGT), l'un des principaux portails d'entrée pour le VIH et d'autres agents pathogènes transmissibles sexuellement, est d'une grande importance sur la voie de trouver des stratégies efficaces pour prévenir l'infection. Les réponses immunitaires à la muqueuse génitale sont bien unique et diffèrent de celles mesurées dans le sang périphérique 2. Cependant, les connaissances actuelles de la dynamique immunitaires à la FGT est limitée au mieux. À ce jour, les études de l'environnement immunitaire muqueux ont surtout porté sur les tissus lymphoïdes associés à l'intestin (GALT), où il est devenu clair que les événements précoces dans les muqueuses après l'infection ont un fort impact sur la suite progression de la maladie 3,4. Prélèvement d'échantillons de la muqueuse génitale représente un grand défi et est au moins partiellement responsable de la lack de compréhension de l'immunologie de la FGT. Résoudre le casse-tête de la dynamique immunitaire entre l'hôte et l'agent pathogène dans le contexte de l'environnement distinct qui est la FGT nécessite des méthodes efficaces pour la collecte et l'analyse des échantillons de ce lieu.
La FGT est divisé en deux sections: l'appareil reproducteur supérieur qui comprend les trompes de Fallope, de l'endomètre et de l'endocol, et la zone inférieure qui contient l'exocol et du vagin (examiné par Kaushic et al 5). Il n'est pas encore clair que la contribution relative de ces différents sites est de l'infection à VIH, mais on pense que les deux sites pourraient contribuer à l'entrée du VIH 6. Les cellules T représentent 40 à 50% des leucocytes dans l'appareil reproducteur supérieure et inférieure, tandis que les macrophages constituent environ 10% (passage en revue dans Rodriguez-Garcia et al 2). Les cellules T peuvent être détectés dans le vagin, le col utérin et de l'endomètre. Les macrophages sont plus fortement localized dans l'endomètre et du tissu conjonctif du myomètre que le col de l'utérus, mais ils peuvent être détectés dans les deux tissus. Enfin, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) et les cellules de Langerhans peuvent également être détectés dans les tissus de traitement des fumées. Le phénotype et les proportions des populations immunitaires et leur susceptibilité à l'infection à VIH peuvent varier surtout selon des cycles hormonaux, l'utilisation de contraceptifs hormonaux, la vaginose bactérienne ou des activités sexuelles 5,7-9.
Diverses méthodes ont été développées pour étudier les populations immunitaires et de l'environnement de la FGT. Biopsie cervicale, cytobrosses col de l'utérus et des lavages cervico-vaginales (CVL) 10-12 sont le plus couramment utilisé dans la littérature. Collection CVL par PBS lavage est la méthode la plus simple et permet l'étude des protéines immunomodulateurs, mais les résultats du rendement des cellules extrêmement faible, et n'est donc pas adapté à l'étude des populations de cellules immunitaires de la FGT 13. Échantillons CVL sont, d'autre part, vEry utile pour évaluer l'environnement à l'abri de la FGT par mesure de l'expression de différentes cytokines, les chimiokines ou les facteurs anti-microbiens à l'aide de méthodes telles que l'ELISA, tableau cytokine de talon 14 ou la spectrométrie de masse 15,16. Caractérisation des fréquences des cellules immunitaires, les phénotypes et des fonctions peut être obtenue en collectant les cellules mononucléaires du col (CMC) par cytobrosse col de l'utérus ou de l'échantillonnage de biopsie cervicale.
L'échantillonnage de biopsie cervicale est une méthode invasive qui augmente l'inconfort et le risque de saignement et prend de 2 à 11 jours pour guérir suivant le mode opératoire en fonction de l'état immunitaire de la femme 12. D'autre part, cytobrosses cervicales, en dépit de la baisse de rendement des cellules recueillies, est un moyen moins invasif et plus commode de recueillir les cellules immunitaires de l'FGT. Les deux méthodes peuvent atteindre le même rendement de leucocytes CD45 +, mais deux cytobrosses cervicales séquentielles sont nécessaires pour obtenir la même quantité de cellules contenues in une biopsie 13. Néanmoins, cytobrosse échantillonnage fournit encore un nombre acceptable de cellules (environ 5000 CD45 + cellules / de cytobrosse) pour plus d'ex vivo phénotypage en cytométrie de flux 14. De plus, la caractérisation fonctionnelle peut être réalisée sur ces échantillons, comme la stimulation et le flux intracellulaire par cytométrie ou qPCR ont été effectuées en utilisant les CMC de cytobrosse dérivé d'identifier les réponses immunitaires spécifiques au VIH 17 ou la polarisation de la cellule Th 18. L'expansion de la population de cellules T peut également faciliter les études fonctionnelles avec CMC 19.
Il est important de noter que les biopsies et cytobrosses échantillonnent des parties distinctes de la FGT. Les biopsies sont obtenues à partir de la partie supérieure de l'épithélium et le stroma de l'exocol 12,13, tandis que cytobrosses cervicales échantillonnent l'orifice utérin, la collecte des cellules dérivées de l'épithélium de l'endocol et vraisemblablement la zone de transformation. Échantillons cytobrosse donc goûter une nouvellerégion composée d'une seule couche de l'épithélium cylindrique, tandis que les biopsies, comprennent une région bordée par un épithélium pavimenteux stratifié 5. Par conséquent, la nature des populations leucocytaires recueillies par biopsie cervicale et cytobrosse diffère. Les biopsies de recueillir une plus grande proportion de cellules T CD3 +, alors que cytobrosses se traduisent par une collection de plus grande proportion de monocytes CD14 + / 13 macrophages.
L'étude de l'immunologie de la FGT a eu un intérêt pour de nombreuses années 20-22 et nous avons accumulé beaucoup d'expertise à l'étude des CMC de cytobrosse dérivés. Nos études portent principalement sur l'étude des infectés par le VIH, non infecté et exposés au VIH séronégatifs (Hesn) femmes travailleuses du sexe de Nairobi, au Kenya. Le VIH se réplique préférentiellement dans les cellules T activées 23 et inférieure du nombre de cellules activées qui peuvent être ciblées par le VIH dans le FGT pourraient contribuer à la protection contre la contamination par le VIH. En accord avec cette hypothèse, plusieurs studies ont décrit l'activation immunitaire plus faible parmi les travailleurs du sexe de Hesn qui sont très exposés au VIH restent encore non infectées 24,25, et ce phénotype de repos est également observée dans le FGT 14. Ici, nous décrivons la méthodologie pour le traitement et l'évaluation des cellules T activation dans des échantillons provenant de CMC cytobrosses col de l'utérus par ex vivo cytométrie de flux.
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Protocol
Déclaration d'éthique: l'éthique de recherche conseils d'administration de l'Université du Manitoba et Kenyatta National Hospital / Université de Nairobi ont approuvé cette étude et du consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants à l'étude.
1. Préparation des milieux et CMC Collection Tubes
- Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (NaCl 137,93 mM, 2,67 mM de KCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM de KH 2 PO 4). Autoclave pour la stérilité. Cela peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs mois.
- Pré-aliquote de 5 ml de PBS dans 50 ml tube Falcon (un par échantillon à prélever) et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de la collecte de l'échantillon.
- Étiqueter 2-4 cryotubes ou 1,5 ml microtubes par échantillon pour recueillir lavage pour le stockage.
- Préparer un milieu de culture cellulaire: RPMI 1640 + 1% de pénicilline / streptomycine / amphotéricine B (concentration finale de 100 unités / ml, 100 pg / ml et 250 ng / ml, respectively, sans FCS / FBS ajouté.
2. Prélèvement des échantillons cytobrosse
Collection d'échantillons de cytobrosse est une procédure non-invasive qui doit être effectuée par un MD ou un gynécologue qualifié.
- Recueillir les cellules mononucléaires du col utérin (CMC) en utilisant à la fois un cytobrosse et un grattoir en bois ou en plastique. Recueillir CMC du participant en cours d'examen au spéculum en insérant le grattoir et tournant autour de l'orifice cervical (Figure 1). Insérez le cytobrosse dans les os endocervical pivoter sur 360 ° et placez juste deux la cytobrosse racloir dans le tube falcon 50ml contenant 5 mL de PBS.
- Conserver les échantillons sur glace / à 4 º C jusqu'à leur traitement. Pour maintenir la viabilité des cellules, des échantillons de processus à l'intérieur de deux heures de la collecte.
- Si possible, prélever des échantillons de sang appariés en vert meilleurs vacutainers d'héparine pour périphérique de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) d'isolement pour servir un comparateur / contrôle pour l'analyse CMC.
3. Isolation des CMC
Effectuer le traitement des échantillons dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2, dans une enceinte de sécurité biologique stérile avec des gants doubles.
- Lors de la collecte, les échantillons de CMC peuvent être contaminés avec du sang. Exclure des échantillons de contamination du sang visible de l'étude afin d'éviter l'inclusion de confusion de PBMC dans l'échantillon final. En raison du faible nombre de lymphocytes isolés à partir d'échantillons de CMC, la contamination du sang mineur peut facilement submerger la composante lymphocytaire CMC.
- Tubes vortex de faucon contenant à la fois le cytobrosse et grattoir pour 45 sec de dissocier les cellules des brosses. Les échantillons peuvent devenir mousseux cours de ce processus; ce qui est normal.
- Utilisez le cytobrosse pour gratter les restes de hors la raclette, et jeter le racleur dans une solution d'eau de Javel. Pour recueillir les cellules restant attachés à la brosse / grattoir, utilisez un gant frais de serrer la raclette entre le pouce et l'index.Faites glisser la brosse, permettant aux cellules et PBS à collecter dans le même tube de 50 ml. Jeter le cytobrosse dans une solution d'eau de Javel, et jeter le gant.
IMPORTANT: Utilisez un gant neuf pour chaque échantillon. - Monter un 100 um cellule de nylon filtre à 50 ml tube frais de faucon. En utilisant une pipette de transfert, de recueillir la suspension du PBS-cellule à partir du tube d'échantillon et filtrer à travers le filtre dans le tube frais.
- Ajouter 5 ml de RPMI 1640 avec le tube de l'échantillon initial. En utilisant la pipette de transfert, laver les parois du tube d'échantillon avec le RPMI, et transférer à travers le filtre vers le nouveau tube de collecte. Laver le fond du filtre en nylon avec le RPMI ainsi.
- Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 514 x g. Il est essentiel de laisser le frein de la centrifugeuse au cours de cette étape de réduction, afin d'empêcher le délogement de la pastille CMC.
- Retirez délicatement le surnageant du tube, en prenant soin de ne pas perturber le culot. taille de Pellet sera très variable; en sortemoi les échantillons, la pastille est assez grande en raison de la présence de grands nombres de cellules epitheliales, tandis que dans d'autres cas, le culot est à peine visible et très transparente.
- Reprendre le culot par agitation douce du tube Falcon. Ajouter 5 ml de PBS pour laver l'échantillon.
- Centrifuger à nouveau pendant 10 min à 514 xg sans frein de la centrifugeuse.
- Prenez soin de le surnageant et remettre en suspension le culot comme ci-dessus. Les cellules sont prêtes pour la cryoconservation soit (en utilisant un protocole de cryoconservation PBMC), la stimulation ou la cytométrie en flux phénotypage.
4. CMC coloration de surface et cytométrie en flux
- Reprendre le culot de l'étape 3.10 dans 100 pi de solution de blocage et transférer soit dans une plaque de 96 puits ou FACS tube. La solution de blocage (pour bloquer les récepteurs Fcy) recette est la suivante: IgG de souris de 1,8 pl (concentration finale de 0,2 pg / pl), 5 pl de FBS et 93,2 ul de lavage FACS (PBS + 2% de FBS).La coloration peut être effectué dans une plaque de 96 puits si la taille des granulés sont assez petites, mais peut avoir besoin d'être effectuée dans des tubes FACS si pastilles sont systématiquement grande. Il est important pour titrer les anticorps en conséquence.
- Bloquer les échantillons pendant 10 min sur la glace / à 4 ° C.
- Laver les cellules avec 100 pi de FACS de lavage (PBS + 2% de FBS) dans des plaques à 96 puits ou 500 pl dans des tubes FACS. Centrifugeuse à 600 g pendant 10 min à 4 ° C avec le frein à faible (ou hors tension, si un réglage du frein bas n'est pas disponible).
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot de cellules par agitation. Ajouter viabilité Stain (Live Dead colorant de viabilité réparable). Préparer viabilité colorant selon les instructions du fabricant. Il peut avoir besoin d'être titrée pour une utilisation dans chaque configuration laboratoire / de cytomètre. Incuber pendant 30 min à l'obscurité à 4 ° C.
- Laver les cellules 100 μl/500 pi de PBS (pour tubes plaque / FACS 96 puits). Centrifuger à 600 g pendant 10 min à faible / pas de frein. Retirer supernatant et remettre les cellules.
- Incuber les cellules avec le cocktail d'anticorps de marqueur de surface, dans un volume total de 100 pl. IMPORTANT: Optimiser et titrer chaque cytométrie en flux panneau avant la coloration de l'échantillon. Incuber les cellules pendant 30 min à l'obscurité à 4 ° C.
- Répétez l'étape 4.5. si la coloration dans une plaque à 96 puits, les cellules de transfert à un tube FACS et diluer à un volume final de 750 ul de FACS pour lessive contenant 1% de paraformaldehyde (PFA) (ou Cytofix, dilué à 1 4). Passez à acquisition de données sur un cytomètre de flux.
5. Prélèvement et la préparation de col de l'utérus vaginale Lavage (CVL)
- Avant cytobrosse échantillonnage, utiliser une seringue pour laver l'endocol avec 2 ml de PBS stérile et aspirer le liquide de lavage du cul de sac postérieur.
- Recueillir l'échantillon de lavage aspiré dans un tube Falcon de 15 ml et garder sur la glace / à 4 º C jusqu'à leur traitement.
- Extrait Centrifugeuse à 400 g pendant 7 min pour éliminer les débris cellulaires.
- Collect le surnageant, aliquote de l'échantillon dans 1 ml ou 500 aliquotes et conserver à -70 ° C. Aliquotes peuvent être décongelés pour ELISA ou analyse de réseau de billes de protéines CVL, mais éviter de multiples cycles de gel / dégel.
- Si l'on désire remettre en suspension le culot de débris cellulaires dans la suite de l'ARN pour mesurer l'expression de l'ARN en suivant le protocole du fabricant.
6. D'acquisition de données
- Préparer une série de tubes de compensation qui correspond à la face d'anticorps. Exécutez les tubes de compensation pour ajuster chevauchement spectral. Analyser les échantillons sur un cytomètre de flux multicolore qui est configuré pour les anticorps conjugués à un fluorochrome utilisés dans le panneau.
- Acquérir un échantillon PBMC premier à ajuster Forward Scatter (FSC) et Side Scatter (SSC) tension afin de détecter la population de lymphocytes. Essayez de les garder à 100 sur chaque axe sur une échelle linéaire. Exécution d'un contrôle PBMC, il sera beaucoup plus facile de trouver de la population de lymphocytes CMC.
- Le seuil de FSC pour les échantillons de CMC peut être augmentée par rapport à des échantillons de PBMC en raison de salir l'axe SSC à de faibles valeurs de FSC.
- Vortex chaque tube avant d'acquérir. Acquérir la totalité du tube afin de maximiser le nombre d'événements de grille de lymphocytes recueillis. Surveillez attentivement la machine pour éviter le colmatage.
- Exporter les données dans un programme d'analyse de cytométrie de flux tel que FlowJo.
7. Stratégie gate
- Sélectionnez Transférer diffusion latérale haute (FSC-H) / Forward zone de diffusion latérale (FSC-A) pour déterminer la population de maillot.
- Sélectionnez Temps par rapport marqueur fluorescent (comme par exemple FITC) pour contrôler la qualité de l'acquisition. Changement dans le taux d'écoulement peut introduire des artefacts dans les données. Exclure toute zone qui affiche un écart dans le débit.
- Identifier la population de lymphocytes sur SSC-A/FSC-A terrain. Utilisez un contrôle CMSP pour faciliter l'identification. Notez que la population de lymphocytes CMC pourrait ne pas être aussi clair que le contrôle des PBMC. </ Li>
- Porte sur SSC-A/viability colorant d'exclure les cellules mortes de cellules vivantes. La mort des cellules non spécifiquement incorporer les anticorps, qui présentera des artefacts.
- Porte sur la SSC-A/CD3 d'identifier la population de cellules T. A partir de cette grille, identifier les populations CD4 + et CD8 +.
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Representative Results
cytométrie de flux multiparamétrique est un outil puissant pour étudier les phénotypes et les fonctions de sous-ensembles de cellules dans les tissus non définies auparavant. L'analyse des échantillons de CMC peut fournir des informations à la fois sur les lymphocytes et monocytes populations avec les stratégies de déclenchement appropriées.
Une stratégie de déclenchement CMC représentant, par rapport à un profil PBMC identifié, est présenté à la figure 2. L'FSC-A par rapport FSC-H parcelle permet l'exclusion des doublets de cellules, qui sont très répandus dans les échantillons de CMC par rapport aux PBMC, même après filtration (Figure 2A). contrôle de la qualité comprend l'enlèvement des problèmes de flux de fenêtrage temps, où les changements de débit ou des artefacts dus à des amas d'échantillons peuvent être facilement identifiés (figure 2B). L'identification des populations de lymphocytes / monocytes est relativement similaire dans les deux échantillons de PBMC et de CMC (Figure 2B). Exclusion des cellules mortes par la viabilité colorant empêche l'inclusioncellules apoptotiques qui ont de non spécifiquement repris conjugués d'anticorps fluorescents. Viabilité est plus faible dans les échantillons de CMC par rapport aux PBMC, et peut être très variable d'un échantillon à l'(figure 2B).
Cette analyse portera sur le phénotypage la population de lymphocytes T, mais les échantillons CMC contiennent également des monocytes. Après gating sur la population de monocytes, les cellules sont déclenchés en fonction d'un colorant de viabilité et un canal de vidage (figure 3A). Le canal de décharge contient des anticorps contre CD56, CD3 et CD19, et déclenchement sur les cellules de canal négatif benne permettra d'éliminer toute contamination des lymphocytes dans la population de monocytes. Les cellules peuvent alors être identifiées sur la base de l'expression de marqueurs tels que CD16 et CD11c. La population de lymphocytes CD3 + est typiquement réduite en proportion par rapport à la CMC parmi les PBMC (figure 3B, le tableau 1). La proportion élevée de cellules épithéliales, les granulocytes et CD3 + CD45 + leucocytes non contenues dans les échantillons d CMCominates plus de la population de cellules T. Lymphocytes T CD4 + (médiane: 55,30%, IQR: 50.53% -68,18%) et des cellules T CD8 + (médiane: 25,60%, IQR: 21,50% -33,80%) se trouvent dans un rapport inférieur (près de 2h01 entre CMC) par rapport au ratio 05:01 observé parmi les échantillons sains PBMC du commerce du sexe cohorte de travailleurs au Kenya (figure 3C, tableau 1). Comme dans le sang, l'infection par le VIH affecte les proportions de CD4 + et de cellules T CD8 + chez les CMC, la diminution de la CD4 +: CD8 + rapport de 0,7 (médiane: 0,7, IQR: 0,31 à 2,45) (Figure 3C, tableau 1). Cependant, il n'est pas rare d'observer une plus grande proportion de cellules T CD8 + chez les populations de CMC à partir de sujets en bonne santé (Figure 3C). Fait intéressant, une étendue CD4-CD8-(double négation, DN) T population de cellules par rapport à PBMC DN T fréquence de cellule peut être observée chez de nombreux échantillons de CMC personnes séronégatives (tableau 1). Ces résultats sont similaires à ceux obtenus pour les échantillons prépuce 26, although ces cellules sont mal caractérisés.
Marqueurs phénotypiques des lymphocytes T typiques sont facilement quantifiables parmi les CMC, mais peuvent varier à partir de PBMC; La figure 4 illustre l'identification d'un CD161 + + + (MAIT) population CD8 qui est distincte dans les PBMC mais presque absentes dans les CMC (Figure 4A). L'expression des marqueurs d'activation CD69 et HLA DR, CCR5 marqueur de migration ou marqueurs d'épuisement PD-1 peut être clairement identifié sur CD4 + ou CD8 + populations (figure 4B).
La quantification de la concentration de cytokines / chimiokines dans CVL peut être analysé en parallèle avec CMC coloration. Cela permet de corrélation entre la cytokine milieu CVL (pro-inflammatoire contre immuno) et le phénotype de CMC. Ces données peuvent également être utilisées pour déterminer si la fréquence de l'expression des récepteurs de chimiokine sur les CMC est liée à l'expression relative de plasma ou de chimiokines CVL 14. Tableau 2 </ Strong> représente la concentration moyenne de cytokines et de chimiokines analytes dans CVL collectées à partir de femmes en bonne santé et testés par les kits de tableau Milliplex cytokine de talon.
Figure 1. Anatomie de l'appareil reproducteur féminin. A) Vue en coupe de l'appareil reproducteur féminin, montrant la relation entre le vagin à l'orifice externe du col utérin, canal cervical et la cavité utérine. B) Front angle de vue du col, montrant l'orifice externe, et la partie antérieure et cul de sac postérieur régions à 12:00 et 06:00, respectivement. Reproduit avec la permission de Reusch et al 27. Le racleur est entraîné en rotation autour du col de l'orifice du col de recueillir CMC, tandis que le cytobrosse est inséré dans le canal cervical et une rotation supplémentaire de recueillir CMC. Lavages vaginaux col de l'utérus (CVL)sont recueillies par lavage de l'endocol avec du PBS et en la collectant dans le cul de sac postérieur.
Figure 2. Gate et le contrôle de la qualité des échantillons de CMC. A) Identification des maillots par le FSC-A par rapport au FSC-H terrain démontre le faible pourcentage de maillots dans les échantillons de CMC par rapport aux échantillons de PBMC, même après de filtrage du CMC isolement. B) Des exemples d'échantillons élevées et de mauvaise qualité sont présentés pour la qualité de plusieurs étapes de commande. Déclenchement du temps par rapport à la fluorescence (ou SSC / FSC) peut identifier les problèmes de débit et être utilisé pour exclure les événements qui peuvent entraîner des artefacts de coloration. Une population de lymphocytes basé sur FSC par rapport SSC peut ou ne peut pas être facilement identifiés en fonction de l'échantillon. L'inclusion d'un colorant de viabilité est crucial, car certains échantillons peuvent contenir des cellules viables de moins de 50%. Viability (amine-réactif) les colorants colorent les cellules mortes plus vives que les cellules vivantes, comme la perte d'intégrité de la membrane lors de la mort cellulaire permet au colorant pour accéder à des groupes amine sur les protéines à l'intérieur de la cellule. Les cellules viables sont donc identifiés par gating sur la population de colorant viabilité négatif.
Figure 3. Identification des sous-ensembles de cellules T. A) La population CD3 + dans les échantillons de CMC est généralement une proportion moindre de la grille de lymphocyte par rapport à des échantillons de PBMC. Échantillons de CMC sont également plus variable de la taille de la population de cellules T, comme indiqué. B) CD4 +, CD8 + et des populations de cellules CD4-CD8-T sont facilement identifiés à la fois dans des échantillons de PBMC et de CMC. CD4: taux de lymphocytes T CD8 peut varier d'un échantillon à entre les CMC, comme indiqué. Les données présentées ont été recueillies auprès de femmes non infectées par le VIH.
Figure 4. Phénotypes de cellules T dans des échantillons de CMC. A) La muqueuse associée cellules T invariantes (MAIT) CD8 + CD161 + + population qui est facilement identifié dans des échantillons de PBMC est presque entièrement absent dans CMC. Les cellules CD8 + CD161 + T peuvent être identifiés dans les deux échantillons. B) CMC exposition expression de marqueurs phénotypiques dont CD69, HLA DR, CCR5 et PD-1. Portes ont été établis sur la base de la fluorescence moins un (FMO) contrôles. Les données présentées ont été recueillies auprès de femmes non infectées par le VIH.
| CMC | CMSP | |||||
| Population | VIH + (n = 34) | VIH (n = 44) | P valeur un | VIH + (n = 28) | VIH (n = 35) | P valeur un |
| médiane (IQR) | médiane (IQR) | médiane (IQR) | médiane (IQR) | |||
| % de lymphocytes vivants | 85,65 (60.25-92.63) | 88,70 (74.85-95.38) | 0,1193 | - | - | |
| % CD3 + dans des lymphocytes grille en direct | 5,94 (0.90-16.80) | 1,44 (0.39-8.46) | 0,0303 | 41,15 (17.08-62.10) | 41,90 (20.40-51.30) | 0,4231 |
| valeur p b | <0,0001 | <0,0001 | ||||
| % CD8 + CD3 + dans la porte | 43,20 (25.75-66.00) | 25,60 (21.50-33.80) | 0,001 | 30,05 (22.75-38.78) | 14,60 (8.01-24.80) | <0,0001 |
| valeur p b | 0,0291 | <0.0001 | ||||
| % CD4 + CD3 + dans la porte | 31.10 (20,45 à 63,10) | 55,30 (50.53-68.18) | 0,0003 | 56,10 (50.10-61.28) | 77,20 (65.90-92.80) | <0,0001 |
| valeur p b | 0,002 | <0,0001 | ||||
| Rapport CD4: CD8 | 0,71 (0.31-2.45) | 2,09 (1.55-3.01) | 0,0003 | 1,92 (1.44-2.39) | 5,34 (2.66-10.77) | <0,0001 |
| valeur p b | 0,004 | <0,0001 | ||||
| % DN CD3 + porte | 10,40 (6.36-14.30) | 10,70 (6.76-19.10) | 0,4793 | 9,58 (6.65-15.98) | 7.01 (05.26 à 08.07) | 0,0032 |
valeur de p | 0.8338 | 0,0006 | | ||||
Tableau 1. Des proportions relatives des sous-ensembles de cellules T dans les CMC et les CMSP. CMCsamples de 44 séronégatifs et 34 travailleuses du sexe séropositives et des échantillons de PBMC de 35 séronégatifs et 28 séropositifs ont été comparés pour leur proportion relative de cellules vivantes, des cellules T CD3 + et CD4 +, CD8 + et CD8-CD4-DN sous-ensembles de cellules T. Les données sont présentées sous forme de médiane (25 e -75 e interquartile, IQR). Les différences entre les groupes ont été calculés par le test de Mann-Whitney. p valeurs indiquent le résultat d'une comparaison entre un VIH + et VIH-b ou CMC et PBMC données.
| Analyte | Signifie un (Std dev.) | |
| pg / ml | pg / ml | |
| MIP-3a | 35,5 (90,6) | 2.9 |
| MIG | 1447 (3026) | 19,4 |
| ACTI | 2,7 (6,3) | 0,8 |
| Fractalkine | 51,6 (69,5) | 10,6 |
| IFN-a2 | 24,0 (12,0) | 40,6 |
| IFN-g | 3,9 (14,2) | 0,3 | IL-1a | 268,4 (721,3) | 6.4 |
| IL-1b | 46,8 (126,2) | 0,7 |
| IL-1ra | 4967,0 (3597) | 5.5 |
| IL-2 | 0,9 (2,6) | 0,6 |
| IL-6 | 14,8 (30,5) | 0,7 |
| IL-7 | 6,3 (10,1) | 0,1 |
| IL-8 | 1491 (2126) | 0,3 |
| 4,5 (8,6) | 0,5 | |
| IL-15 | 1,4 (2,7) | 0,7 |
| IL-17 | 1.1 (2.2) | 0,3 |
| IP-10 | 381,4 (1100) | 2.2 |
| MCP-1 | 129,4 (340,4) | 1.6 |
| MCP-3 | 5.9 (7.1) | 3.7 |
| MDC | 84,2 (94,6) | 6.9 |
| MIP-1a 20,9 (28,9) | 6.4 | |
| MIP-1b | 28,5 (42,6) | 8.9 |
| SCD40L | 10,8 (19,3) | 9 |
| sIL-2Ra | 8,4 (9,8) | 7.7 |
| TNF-a | 1,9 (4,1) | 0,1 |
Tableau 2. L'expression de cytokines et de chimiokines en CVL. Échantillons de 51 séronégatifs (non Hesn) participants de la femelle cohorte des travailleurs du sexe au milieu du cycle menstruel ont été analysés pour la concentration cytokine / chimiokine l'aide de la cytokine humaine / chimiokine perle Milliplex CARTE Kit de matrice selon le fabricantDe protocole nuit, dosé en double exemplaire. IFN: interféron; MCP: protéine chimiotactique des monocytes; MDC: chimiokines macrophages dérivés, s: soluble; TNF: facteur de nécrose tumorale; MIP: protéine inflammatoire des macrophages; ACTI: l'interféron alpha inductible de cellules T chemoattractant; MIG: monokine induite par l'interféron gamma; IP-10; interféron protéine inductible. Values dessous de la limite de détection ont été assignées une valeur de la moitié de la limite de détection.
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Discussion
Compte tenu des grandes lacunes dans les connaissances à l'égard de l'immunité à l'appareil génital féminin (FGT), analyse phénotypique de CMC peut fournir un large éventail de points de vue dans les populations de lymphocytes multiples au col. Couplée à l'analyse protéomique et des mesures de la charge virale dans le lavage de l'utérus, l'immunité aux infections sexuellement transmissibles (IST s) et d'autres agents pathogènes peut être disséqué dans diverses populations.
Considérations techniques - CMC: L'isolement et la coloration réussie d'échantillons CMC peut être difficile. Optimisation du protocole de collecte de CMC a mis l'accent sur l'efficacité de la collecte de la CVL en premier, suivi par le racleur col de l'utérus, puis enfin la cytobrosse. Il est important d'augmenter la taille des échantillons prévus par rapport à ceux calculés pour les études du sang périphérique en raison de la probabilité accrue d'exclusion de l'échantillon pour une variété de raisons, discutées ci-dessous.
Test du désirpanneau d de débit sur des échantillons de CMC est essentiel avant d'étudier l'initiation. Il est important de surveiller l'autofluorescence des cellules dans des échantillons de CMC, en particulier dans la grille de monocytes. CMC autofluorescence dans certains canaux peut être élevée par rapport à CMSP, ce qui peut affecter gating et le rapport signal-bruit. En outre, les tensions optimales doivent être confirmés pour des échantillons de CMC s'il a déjà été déterminé sur des échantillons de PBMC.
Afin de préserver l'intégrité des données, il est important d'exclure les échantillons présentant une contamination sanguine ou confondre les IST. L'inclusion d'un colorant de la viabilité des cellules en cytométrie de flux panneau est essentiel d'exclure les cellules mortes qui ont non spécifique des anticorps fluorescents. Alors que la plupart des échantillons sont très viable, il n'est pas rare d'exclure 10-20% des cellules par la viabilité colorant. Si l'analyse des sous-ensembles en fonction des CD4 et CD8 expression est prévu, il est important d'obtenir au moins 100 CD3 + événements pour procéder à l'analyse. Échantillons prélevés dans différentes femmes, et même de la même femme une t différents points dans le temps, peut donner le nombre de cellules très différentes 13.
Analyse par cytométrie de flux des lymphocytes de la muqueuse est souvent plus facile et plus efficace si un échantillon témoin PBMC peut être exécuté en même temps que les échantillons de CMC. Dans certains échantillons de CMC, la population de lymphocytes est difficile d'identifier par le FSC / SSC déclenchement, mais l'inclusion de l'échantillon PBMC donnera une meilleure idée de l'endroit où la porte. Même dans les échantillons sans un lymphocyte clair FSC / SSC de la population, CD3 + populations distinctes peuvent être identifiées. Si l'acquisition de données est interrompu par des problèmes techniques (cytomètre apport colmatage, bulles, etc) gating sur la fluorescence au cours du temps peut supprimer les artefacts de collecte de données, tout en permettant l'analyse de l'échantillon. Des contrôles appropriés, tels que la fluorescence moins l'un des tubes (FMO) pour le placement de grille peuvent avoir besoin d'être effectuée sur les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) lorsque le nombre de cellules nécessaires est trop important pour utiliser des échantillons de cytobrosse.
ontenu "> De multiples études ont démontré la détection des réponses de cellules T spécifiques de l'antigène parmi les échantillons de CMC. CMC production de cytokine peut également être induite par PMA / Ionomycine, PHA, IFNy et de l'anti-CD3 stimulation. L'une des principales limitations des stimulations CMC nombre de cellules, ce qui réduit le nombre de conditions et des contrôles pouvant être effectués par échantillon. Il est également crucial de surveiller attentivement et prendre des mesures supplémentaires pour prévenir la contamination de culture cellulaire. L'appareil génital n'est pas un site stérile, et, dans certains cas, des antibiotiques supplémentaires doivent être ajoutés au milieu de culture pour empêcher la prolifération bactérienne. Bien que CMC peuvent être cryoconservés avec peu de perte de viabilité, la récupération est d'environ 50%, ce qui rend les échantillons cryoconservés de mauvais candidats pour les études de stimulation moins l'expansion des cellules est prévu 10.Considérations techniques - CVL: Collection de CVL se traduit généralement par échantillon limité volume, ce qui empêche l'analyse d'un grand nombre de concentrations de protéine répétée par ELISA. Un dosage alternatif est la matrice de cytokine bourrelet, sur la base de la plate-forme Luminex ou plate-forme de cytométrie en flux. Multiplexés kits sont disponibles auprès de plusieurs sources commerciales, ce qui permet la quantification d'un maximum de 30 analytes dans un volume d'échantillon très petit (souvent ~ 25 pi). L'optimisation de ces essais ont révélé une détection optimale des analytes en utilisant le protocole d'incubation pendant une nuit. Certains analytes qui sont détectables dans les échantillons de plasma / sérum ne sont pas détectables dans CVL. Notamment, la concentration des échantillons CVL utilisant des colonnes de centrifugation n'a pas amélioré la détection de tous les analytes, ce qui suggère qu'il n'y a pas d'avantage à une concentration de l'échantillon avant l'exécution de l'essai d'arrangement de billes.
Facteurs de confusion spécifiques à la muqueuse génitale: Études de FGT immunologie doivent prendre soin de reconnaître et de tenir compte pour autant de facteurs de confusion possible. Le cycle menstruel hen maintenant été démontrée à l'impact de l'immunité sang périphérique 28, et exerce des effets plus importants sur la CMC et la composition phénotype cellulaire ainsi que des protéines à partir d'échantillons prélevés CVL 29 probable. Synchronisation prélèvement de l'échantillon à la phase du cycle menstruel est la meilleure façon de réduire la variabilité des données, qu'elle soit mesurée par les niveaux d'oestrogène / progestérone ou les jours depuis le premier jour de la dernière menstruation. L'utilisation de la contraception hormonale a également une grande influence sur l'environnement de la muqueuse et son effet doit être pris en considération lors de la conception ou l'analyse d'une étude. L'altération de la flore vaginale résultant dans la vaginose bactérienne (BV) modifie également l'environnement immunitaire et phénotypes cellulaires. BV peut être diagnostiquée par la coloration de Gram et un score de Nugent peut être mis en place pour contrôler l'effet confusionnel de BV.
L'activité sexuelle a également un impact profond sur l'immunologie des organes génitaux, puisque allo-réponses à sperme peuvent induire des changements rapides et spectaculaires dans cell phénotype et le trafic. En effet, Lajoie et al. ont décrit les différences dans la composition des protéines CVL entre travailleurs du sexe et les populations de travailleurs non-sexuels, avec des changements qui se produisent dans les premières années après le début du travail du sexe.
Enfin, les pratiques culturelles telles que les douches seront introduire davantage de variation dans la muqueuse échantillonnage. En fonction du réactif utilisé (eau de Javel, les détergents, le jus de citron vert, etc), les douches vaginales peut réduire la fréquence / phénotype des populations de cellules, ou de modifier autofluorescence par rapport aux autres échantillons. Idéalement, les douches vaginales avant cytobrosse échantillonnage doit être déconseillée chez les bailleurs de fonds.
Les applications futures: En plus de rendement des indications importantes sur la régulation de l'immunité muqueuse au cours de la variabilité menstruel / hormonal, une infection virale / bactérienne et avant / après la ménopause, l'analyse des échantillons de la muqueuse est particulièrement pertinent pour les études de vaccins contre IST / agents pathogènes des muqueuses. Dans le cas du VIH,où un objectif majeur des études de vaccins est d'obtenir un anticorps muqueux ou la réponse des cellules T, le développement de tests basés sur CMC jouent un rôle crucial dans la détermination des corrélats de protection.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm cell strainer for 50 ml Falcon tube | BD | 352360 | CMC processing |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30027.01 | CMC processing |
| Fetal bovine serum | Life technology | 16000044 | CMC processing |
| Fungizone | Life technology | 15290-018 | CMC processing |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333-20ml | CMC processing |
| 50 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-49A | CMC processing |
| Blood Bank disposable transfer pipette | Fisher | 13-711-6M | CMC processing |
| Cytobrush plus | Cooper surgical | C0121 | CMC sampling |
| Disposable cervical scraper | Quick medical | 2183 | CMC sampling |
| 15 ml Falcon tube | Fisher | 14-959-70c | CVL processsing |
| 1.5 ml tube Eppendorf | Fisher | 05-402-18 | CVL storage |
| LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit | Invitrogen | Various | Flow cytometry reagent |
| Fixation buffer (4% PFA) | BD | 554655 | Flow cytometry regeant |
| IgG mouse | Sigma | I8765 | Flow cytometry regeant |
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