Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Bei Drosophilie-Fliegen aktiviert ein sich abzeichnender visueller Stimulus, der den Ansatz eines Raubtiers signalisiert, neuronale Schaltkreise, die eine Fluchtreaktion auslösen. Um den neuronalen Kreislauf zu manipulieren, der eine solche Reaktion steuert, drücken Sie ein transgenes lichtempfindliches Opsin aus, wie Kanalrhodopsin-2 in bestimmten Neuronen innerhalb dieses Kreislaufs.
Channelrhodopsin ist ein lichtempfindlicher Kationenkanal, der sich öffnet, wenn er hellem blauem Licht ausgesetzt wird. Der anschließende Zufluss von Natriumionen erhöht ein Aktionspotential, das das Neuron dazu bringt, informationen entlang des Kreislaufs zu feuern und weiterzuleiten. Zusätzlich zum Lichtreiz ist der Cofaktor All-Trans-Retinal erforderlich, damit sich Channelrhodopsin öffnet.
Daher, bieten All-Trans-Retinal in der Fliege Nahrung, da es in der Regel in sehr geringen Mengen vorhanden ist. Zusätzlich, bei der Untersuchung der Rolle von Neuronen in einem neuronalen Kreislauf in einer Reaktion auf einen visuellen Reiz beteiligt, verwenden Sie Fliegen, die visuell blind sind, um andere Lichtreaktionen zu verhindern.
Schließlich verwenden Sie ein blaues LED-Licht, um das gleiche Verhalten auszulösen, das durch den sich abzeichnenden Stimulus verursacht wird. Im Beispielprotokoll werden wir die Lebensmittelzubereitung und die lichtinduzierte Verhaltensreaktion von Fliegen sehen, die Kanalrhodopsin in optischen Lappenneuronen exdrücken.
- Beginnen Sie mit dem Schmelzen von Standard-Maismehl fliegen Nahrung in einer Mikrowelle, und lassen Sie es abkühlen, bis warm zu berühren. Nach dem Abkühlen, mischen Sie 50 Mikroliter von zuvor vorbereitet 20-Millimolar All-Trans-Retinal in jede Durchstechflasche. Dann lassen Sie Fläschchen abkühlen und vor Licht geschützt bleiben, bis erforderlich.
Zuerst kurz die Fliegen auf Eis anästhesieren. Dann legen Sie einzelne Fliegen in P1000 Pipettenspitzen mit der Spitze geschnitten, um einen Porendurchmesser von etwa 2,25 Millimetern zu bilden, und versiegeln Sie jedes Ende mit Klebeband. Sobald die Fliege erwacht ist und die Pipette Spitze erforscht, entfernen Sie das Band, und legen Sie die Spitze schnell in die Nut in den vertikalen Halter. Sichern Sie den Chip an Ort und Stelle mit einer Daumenschraube, die den Boden der Spitze schließt.
Fliegen erkunden in der Regel die Spitze für zwischen 30 und 60 Sekunden. Wenn sich die Fliege der Spitze der Spitze nähert, starten Sie die Kameraaufnahme kurz bevor die Fliege auf die Plattform kommt. Nachdem die Fliege auf die Plattform aufgetaucht ist, warten Sie ein bis zwei Sekunden und schalten Sie dann die blauen LEDs ein. Verwenden Sie einen Timer, um die Zeit manuell zu messen, bis die Fliege den Flug initiiert.
