Drosophila Optogenetik: Eine Methode zur Manipulation neuronaler Schaltkreise

Overview

Die Optogenetik ermöglicht die Verwendung von Licht, um Neuronen zu manipulieren, die gentechnisch verändert sind, um bestimmte Opsine auszudrücken – lichtempfindliche Proteine, deren Lichtaktivierung eine Veränderung des Zustands des Neurons auslöst. Hier beschreiben wir einen optogenetischen Ansatz in Drosophila mit dem Opsin Channelrhodopsin2. Das Beispielprotokoll verfügt über einen Optogenetik-Assay, der die neuronale Schaltung hinter dem Fluchtverhalten der Fliege untersucht.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus de Vries und Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2013).

1. Generieren Sie Channelrhodopsin Fliegen

1. Cross UAS-ChR2 fliegt mit dem Gal4 Treiber Ihrer Wahl, wir verwenden G105-Gal4, das in Foma-1 Neuronen im optischen Lappen ausgedrückt wird.
2. Um die Möglichkeit einer visuellen Reaktion auf die Blaulichtstimulation zu eliminieren, befinden sich beide Fluglinien in einem w⁺norpA Hintergrund.
3. Endergebnis: w⁺norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Nachdem erwachsene Fliegen ausschließen, setzen Sie ausgewählte Weibchen auf frische Nahrung, ergänzt mit 10 M All-Trans-Retinal (ein Co-Faktor für ChR2 erforderlich) und vor Licht geschützt, für 3 Tage, bevor Sie den Verhaltenstest durchführen.

2. Machen Sie 10 M All-Trans-Retinal Enhanced Food

1. Lösen Sie 100 mg All-Trans-Retinal in 17,6 ml 95% Ethanol auf, um 20 mM Netzhaut herzustellen. Halten Sie All-Trans-Retinal jederzeit vor Licht geschützt.
2. Schmelzen Sie Standard-Maismehl fliegen Nahrung in der Mikrowelle, und lassen Sie abkühlen, bis warm zu berühren.
3. Mischen Sie 50 l von 20 mM All-Trans-Retinal in Fläschchen von 10 ml Fliegenfutter.
4. Lassen Sie Fläschchen abkühlen und vor Licht schützen.

3. Ausrüstung

1. Pipettenspitzen: In der Nähe der Spitze werden Standard-Pipettenspitzen von 1.000 l geschnitten, wodurch ein Porendurchmesser von 2,25 mm entsteht.
2. Plattform (siehe Abbildung 1).
   1. Ein Delrin-Sockel, 17 cm X 25 cm, wurde mit Gewindelöchern an jeder Ecke gebaut, um 1/4" NPT-Kühlmittelschlauchanschlüsse zu passen.
   2. Ein vertikaler Halter aus Delrin ist an der Mitte der Basis befestigt. Die Gesamtabmessungen betragen 25 mm X 40 mm X 65 mm (Breite X Tiefe X Höhe). Eine 10 mm breite Nut verläuft über die Länge des Halters, mit einer Daumenschraube an der Unterseite. An der Oberseite des Halters ist eine Plattform befestigt, 25 mm X 40 mm X 10 mm, mit einem Loch von 3,5 mm Durchmesser, das an der Nut im Halter ausgerichtet ist.
3. LED-Arrays (siehe Abbildung 1).
   1. Vier Arme Kühlmittelschlauch, 18 cm lang, werden mit dem Kühlmittelschlauchanschluss am Plattformboden befestigt. Kühlmittelschlauch wird nur als Strukturträger verwendet und nicht für Kühlzwecke verwendet.
   2. Richtig verteilte Rillen werden in das letzte Kühlmittel-Hosing jedes Arms geschnitten, um einen Kühlkörper am Ende jedes Arms zu befestigen.
   3. Eine blaue LED Rebel Tri-Stars wird an jedem Kühlkörper mit vorgeschnittenem Thermoklebeband montiert. An jedem Tri-Star ist ein Carclo 18° Tri-Objektiv angebracht.
   4. LED Tri-Stars sind mit den BuckPuck DC-Treibern und einem Netzteil wie angegeben verkabelt. Wir haben unser Setup mit jedem BuckPuck organisiert, der zwei Tri-Stars in Serie antreiben kann.
   5. Die Beleuchtung aller vier LED-Tri-Stars bei 700 mA ergab eine Bestrahlung summ 2^auf unserer Plattform.
4. Kamera: Die Kamera ist auf einem kleinen Stativ montiert und auf der Oberseite der Plattform fokussiert.

4. Verhaltens-Assay

1. Kurz anästhesieren Fliegen auf Eis.
2. Platzieren Sie einzelne Fliegen in Pipettenspitzen, mit Klebeband, um beide Enden der Spitze zu schließen.
3. Nachdem die Fliegen erwacht sind und aktiv die Pipettenspitze erforschen, entfernen Sie das Band und legen Sie eine Pipette in die Nut in vertikalen Halter. Die Daumenschraube wird verwendet, um die Pipettenspitze an Ort und Stelle zu befestizen und die Unterseite der Spitze zu schließen.
4. Während die Fliege die Pipettenspitze erkundet (normalerweise 30 - 60 Sek.), starten Sie die Kameraaufnahme kurz bevor die Fliege von der Spitze auf die Plattform kommt.
5. Nachdem die Fliege auf die Plattform aufgetaucht ist, warten Sie 1-2 Sekunden, und schalten Sie die blauen LEDs ein. Verwenden Sie einen Timer, um die Zeit manuell zu messen, bis die Fliege den Flug einleitet.

Representative Results

Abbildung 1: Experimentelle Einrichtung zeigt die Plattform mit dem vertikalen Halter und den vier Kühlmittel-Hosingarmen, die Kühlkörper mit LED-Arrays halten. (A) Die Einrichtung unter Umgebungsbeleuchtung. (B) Die Einrichtung, wenn die LEDs beleuchtet werden. (C) Eine Nahansicht einer Tri-Star LED auf dem Kühlkörper. (D) Eine Nahaufnahme des Tri-Sterns mit angeschlossenem Tri-Objektiv. (E) Ein Schaltplan des Buckpuck-Treibers und der LED-Schaltung. (F) Schaltplan für die BuckPuck- und LED-Schaltung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Heat Sink 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm square X 30 mm high
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blue Rebel LED on Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiring Harness for BuckPuck Driver	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermal adhesive tape	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Base
Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Hose Connector	McMaster-Carr	5307K39	¼" NPT Male
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim camera	Casio	EX-FH20