从酵母中提取核酸

Biology I

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Summary

使用酵母作为模式生物的众多优点之一是从培养的酵母细胞中可以提取出大量的生物大分子,包括核酸 (DNA和RNA).

本短片将讲解核酸提取的基本步骤。我们将先简单介绍酵母细胞的培养,收获和裂解,这些是提取所有生物大分子共同的起始步骤。然后,我们将讨论两种独特的分离核酸的方法:柱结合和相分离。另外,我们还将演示这些方法在实验室的几种用途,包括准备核酸用于不同的分子生物学实验,如PCR, southern杂交,定量蛋白表达水平在环境刺激下的变化,以及大量重组蛋白的纯化。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 模式生物I:酵母,果蝇和秀丽线虫. 从酵母中提取核酸. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

今天我们要向大家演示怎样从酿酒酵母,也称面包酵母中纯化核酸。核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。本短片将讨论利用相分离和层析法从酵母中分离出这些核酸分子。

尽管有许多不同的纯化酵母核酸的方法,但多数方法的初始步骤是相同的。

首先从平板上挑取酵母单克隆细胞接种到YPD培养液。然后将其转移到摇床或旋转培养箱中,30℃过夜培养。

为了优化产量,应在酵母生长对数中期时收集细胞。处于对数生长期的酵母培养液在600 nm波长下的吸光值,也就是OD值大约在0.5到1左右。一旦酵母培养液达到了合适的的吸光值,离心沉淀酵母细胞,然后用裂解缓冲液将酵母重悬以便裂解细胞。

从酵母中分离核酸的最大难题之一是破坏其坚固的细胞壁。用蛋白酶并结合物理手段可以将酵母的细胞壁破坏,没有了细胞壁的酵母细胞呈现出球状称为原生质。常用的细胞裂解方法就可以裂解原生质。

化学去污剂如十二烷基硫酸钠(SDS)通常被用来裂解原生质。SDS通过溶解细胞膜来裂解细胞。酵母细胞也可以被匀浆。例如,加入玻璃珠到细胞中然后旋涡震荡可以匀浆细胞。另外超声波破碎仪产生的超高频声波也能破坏酵母细胞壁,有助于细胞裂解。

如前所述,酵母的各种核酸纯化方法中的细胞培养,收集和裂解这些步骤都类似,但细胞裂解后,就可以用不同的方法来分离核酸。可通过柱结合或者相分离来纯化核酸。

硅胶柱能够特异性地结合DNA和RNA而不结合细胞内其它组分。通过离子交换,结合在柱上的核酸与其它的细胞组分分离开后,可进一步被洗脱下来。

相分离的原理是利用不同性质的溶剂对核酸和蛋白质的溶解度差异来纯化或浓缩核酸和蛋白质。氯仿加入到细胞匀浆中导致产生水相和有机相两个不同的相。蛋白质在有机相中而核酸分子富集在水相。水相中的DNA可以通过乙醇沉淀获得。

也可以用柱结合的方法分离酵母核酸。首先,离心收集培养的酵母细胞。

除去离心的上清。用含有酶的缓冲液将酵母重悬,涡旋振荡,然后孵育,直到细胞壁被消化。为达到最佳的酶消化条件,可在显微镜下观察细胞壁消化和原生质生成的情况。当细胞壁被消化完全后,加入裂解缓冲液,涡旋振荡混合。

离心去除细胞裂解液中的细胞碎片,使得上清中只剩下DNA,小颗粒以及可溶性蛋白。将上清液上样到硅胶柱中,然后离心过柱,DNA被柱子结合而大部分可溶性杂质则被洗脱下来。

用乙醇或者高盐缓冲液洗涤柱子以除去残留的非核酸杂质。最后用水或低盐的缓冲液将DNA或RNA从柱子上洗脱。要注意洗脱用的水或缓冲液必须不含DNA酶和RNA酶。

从酵母中纯化出的核酸可根据实验的需要有广泛的用途。酵母DNA可以被运用到不同的分子生物学技术中,例如:RCR,southern 杂交或限制性内切酶消化。

细胞基因表达水平的变化可以通过生物芯片进行检测,如你在这里看到的这个基因芯片。

假设我们有两株酵母细胞,一株在有过氧化氢的环境下培养;另一株作为对照组。纯化出这两株培养物的mRNA,分别与基因芯片杂交。分析芯片的结果,我们可以鉴定出被氧化应激调控的基因。

在这个视频中,研究人员用一个全自动设备建立了一个酵母的全基因组突变文库,该文库可以用来研究基因的功能。由于酵母基因中插入了被称为基因条形码的特定序列,可以同时对4000到6000突变株的基因组DNA进行提取并做基因芯片分析或测序。根据基因条形码的相对丰度、可判断每个突变体在多种实验条件下的适应度。

您刚观看的是JoVE’s关于酵母核酸纯化的视频。现在您应该了解了纯化核酸一些基本概念如:如何准备裂解用的酵母和怎样运用不同的提取和分离方法。我们一如既往地感谢您的观看!

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