原代神经元培养物

Neuroscience

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Summary

大脑的复杂构造使得神经科学家们通常需要使用一个简单的系统来进行实验操作和观察。一种有效的方法是获得原代培养物,即解剖神经系统组织,将其解离成单细胞,再在体外培养这些细胞。原代培养物使得能方便地对神经元和神经胶质细胞进行遗传操作和延时成像等必要的实验手段。此外,这些培养物还提供了一个可完全控制的环境,能用于研究复杂的现象,如细胞间的相互作用。

本短片概述了得到原代神经元培养物的主要步骤,包括选择和解剖感兴趣的组织,机械和化学分解组织以产生单细胞悬浮液,将细胞铺板,以及在适当的培养液中维持培养物。短片还介绍了几个典型实验,以显示如何使用培养的细胞来研究在活神经元中蛋白质的运输,形态的变化,及进行电生理学研究。

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JoVE Science Education Database. 神经科学的基本知识. 原代神经元培养物. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

大脑是人体最复杂的器官之一,因此神经科学家们通常需要一个更简单的系统来进行实验操作和观察。细胞培养就是一个这样的系统,它能够方便我们获得活的神经元。一般情况下,培养细胞是指将它们培养在被称为培养基的特殊的溶液中,处于无菌可控制的环境里-通常是在一个温暖的培养箱里。原代培养是一种从生物体的解剖组织中得到的细胞培养。不同类型的原代神经元培养物可以来源于多种生物体,不同的发育阶段和不同的神经系统组织。

本短片将介绍产生原代神经元培养物的方法和一些普遍使用这些细胞的实验。

许多对神经科学研究非常重要的动物模型都可以用来制备原代神经元培养物。小鼠和大鼠是两个在生物医学研究中最常用的哺乳动物 – 来自胚胎,新生幼仔和成熟个体的神经元组织,都可以被解剖出来用于培养。通常会优先选择胚胎和围产期的幼鼠,因为这时脑细胞还不成熟,不容易被损坏。

不同的神经系统组织可以被分离来获得不同类型的原代神经元培养物。例如,可解剖大脑的特定部分,如小脑,大脑皮层和海马。脊髓或外周神经系统的部分,如背根神经节,也可以被解剖并培养以培养特定类型的神经元。

尽管组织来源不同,制备原代神经元培养物的一般方法,都可归纳为几个主要步骤:解剖,解离,铺板,和维持。

让我们从第一步:解剖开始深入了解这些步骤。在准备解剖和培养时,灭菌是防止培养物受到污染的关键。工具必须用酒精进行消毒,层流通风橱通常被用来除去空气中的污染物。

要培养啮齿动物的神经元,需将组织从刚被安乐死的动物中取出,转移到冷的缓冲盐溶液中。使用解剖显微镜,组织的更小部分 - 如海马 - 可以被仔细地分离出来以供进一步处理。

接下来,需要将样品分离成它的细胞组分,这个过程被称为解离。首先用手术刀或剪刀绞碎解剖组织。将得到的组织碎片转移到新的容器中。然后加入一种蛋白水解酶,如胰蛋白酶或木瓜蛋白酶来消化将细胞结合在一起的细胞外基质蛋白。在温暖的恒温箱或水浴中短暂的孵育后,用缓冲液轻轻地洗涤组织碎片,以去除酶。

软化的组织碎片现在就可以通过研磨来解离了,这需要用移液管将组织抽吸多次,使细胞被离散出来成为单一的细胞悬浮液。这时,可以对细胞进行计数测浓度,并用像台盼蓝的染料来检查细胞的存活率,这有助于确定悬浮液应稀释为多少才能得到良好的生长。

神经元终于准备好可以培养了!让我们看看要使它们保持存活和健康所需注意的一些重要因素。用于神经元生长的培养液的组成十分重要。通常要向培养液中加入帮助神经元存活和生长的特殊添加剂。其他添加物还可是抑制非神经元细胞,例如神经胶质细胞分裂的药物。

一旦神经元细胞悬浮液与培养液混合后,就可将细胞铺板在所需的容器中。这些容器可以是培养皿,培养平板或者被放在这些容器内的玻璃盖玻片。因为神经元不能在玻璃上直接生长,盖玻片需预先处理,以得到更加适合细胞附着和生长的表面。这些处理包括用合成的胞外基质蛋白,如多聚赖氨酸和层粘连蛋白来包被; 或用酸蚀刻,以使表面粗糙。

铺板后,神经元被培养在温暖,湿润的培养箱内。神经元突起的生长可在数小时到几天内观察到。为了维持培养物,需每周一次用新鲜的培养液更换部分旧的培养液。通常在铺板后几天到几个星期内的任何时间里,原代神经元培养物都可被用于实验。

现在,您已经有了在培养液中生长的神经元,您可以用这些细胞做什么呢?

使用神经元培养物的一个常用基本方法是通过转染或病毒转导进行遗传操作。例如,编码一种突变的蛋白质的遗传物质,可以被引入到培养的神经元中来改变神经元功能。此外,双链RNA转染是一种抑制蛋白质表达的有效技术。有许多方法和试剂可以用于遗传操作,这使得它成为研究众多问题的一个特别有用的工具。

通过转染神经元培养物可解决的一个典型问题是:某些蛋白质或蛋白质复合物是如何以及在哪里被运输到神经元的各种形态结构的?为得到答案,将神经元用编码感兴趣蛋白质的DNA转染,它可以与荧光蛋白,如绿色荧光蛋白GFP融合。然后,可以用实时成像监控荧光标记蛋白的运动模式和定位。这种方法能用于研究如神经递质受体到细胞表面的运输。

原代神经元培养物对电生理学研究也非常有用,其中,单个细胞的电活动可以用微电极来测量。培养的神经元是单层生长,这意味着很容易定位单个细胞,并且如药物施加等操作可以迅速且均匀地起作用。例如,一种测试化合物对一个单一神经元活性的影响可以通过膜片钳技术在培养的神经元上测定。

您刚观看的是JoVE对原代神经元培养物的介绍。本短片中,我们演示了如何准备这些培养物以及运用它们的常见实验的类型。原代神经元培养物可以从各种各样的组织来源制备,通常使用的方法要涉及解剖,分离成细胞悬浮液,以及在培养箱中培养液里生长。感谢观看!

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