胚胎干细胞培养及诱导分化

Developmental Biology

GE Global Research must subscribe to JoVE's Advanced Biology collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

(ES) 胚胎干细胞培养需要维持这些细胞的未分化的状态来保留它们的自我更新和多向分化潜能的能力的条件。干细胞生物学家将不断优化方法,提高效率的 ES 细胞培养,并同时试图直接胚胎干细胞分化成特定细胞类型可以在再生医学中使用。

此视频介绍 ES 细胞培养的基本原则和演示一般协议成长和胚胎干细胞的通道。我们也看一看在悬滴用于区分 ES 细胞的方法。最后,这个视频将描述几种应用胚胎干细胞培养和分化技术,包括用于生成功能方法心脏肌肉细胞体外

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 发育生物学精要. 胚胎干细胞培养及诱导分化. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

胚胎干细胞或胚胎干细胞,有大量的从定期成人细胞区分它们的独特属性。因此,科学家们设计了特殊的栽培技术,以维持或利用这些属性。当培养正确,ES 细胞可以无限分裂下去,使更多的自己。同时,通过改变培养条件,ES 细胞可以被定向分化为几乎任何的细胞类型,发现在我们的身体;这种能力的胚胎干细胞被称为"全能"。

在这个视频中,你将要学习如何培养、 传胚胎干细胞,使他们保持其独特的性能、 如何诱导分化的胚胎干细胞形成特定类型的细胞,和胚胎干细胞培养及分化技术的方式使用和精制的研究人员今天。

在 ES 细胞维修程序的细节之前,它是重要的是首先要了解什么可以防止或驱动器 ES 细胞分化。为了使胚胎干细胞,以保留其独特的性质,自我更新及多向分化潜能,他们必须培养他们生长介质中抑制自发分化的具体因素。

这是大多数通常由培养胚胎干细胞的"送纸器"图层上完成,通常小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠。饲养层细胞"喂饱"ES 细胞某些因素,例如激活素 A,这有助于维持 ES 细胞在它们的分化状态。

最近,科学家也开发了无饲养层培养方法在哪 ES 细胞种植在媒体与添加在已定义的食谱的必要因素。这种方法降低了变异,非人类组件移除 ES 细胞培养,这是临床应用的前提。

胚胎干细胞的另一个特点是他们自然生长在集群或殖民地,并往往有时离解成单个细胞,尤其是人类 ES 细胞成活率较低。因此,一般传人类胚胎干细胞需要保留他们在完整块通过机械的"采摘"。

当胚胎干细胞在非附着条件下长大时,他们形成 3D 聚合称为胚体或 EBs,其中胚胎干细胞将分化成各种不同的细胞类型。由不同的分化条件,例如,添加特定生长因子的媒体,科学家正在开发直接 ES 细胞分化成特定细胞类型的方法。

现在,你理解原则背后 ES 细胞维持和分化,让我们看看如何培养、 传 MEF 馈线上的胚胎干细胞。

小鼠从早期小鼠胚胎,获得,然后失活的化学物质或辐射以防止进一步划分。灭活的小鼠应镀上糊化的组织培养皿培养胚胎干细胞而开始前至少一天。当馈线被完全安定时,ES 细胞解冻,种子放在盘子。

在接下来的几天中,胚胎干细胞将长成大殖民地。殖民地开始触摸和保险丝之前,ES 文化应该传代。你应该观察胚胎干细胞的形态,来看看他们都分化的迹象。未分化的 ES 殖民地一般看上去定义良好且均匀,而分化的细胞会显得像迟钝的、 形状不规则的"铺路石"。

如果殖民地显示 70%或更多的分化,或者如果他们是稀疏,机械切出的未分化的殖民地,将它们转移到新的进纸器板。否则为只需删除不同的区域或殖民地并进行传代。

一旦有区别的殖民地已经清除了,蛋白水解酶,胶原酶,像添加解除细胞从培养在 37 ° C 的合适的时间量板。然后添加新鲜 ES 媒体停止的酶促反应。殖民地是机械地脱落,从板和转移到离心管中,在那里他们被分解成所需大小与温柔吹打。胚胎干细胞是由离心收集、 ES 媒体再悬浮和准备的馈线盘子镀。

学习如何通过胚胎干细胞后, 让我们来看一个更常见的技术,用于胚胎干细胞分化成胚状体机构挂滴方法。

若要开始,胚胎干细胞分离与像胶原酶、 蛋白水解酶的帮助下和稀释至所需浓度在媒体包含特定谱系分化因子。ES 细胞悬液然后存入滴到细菌培养皿的盖子上。盖子是快速倒并放在盘子里,所以媒体滴会倒挂,允许胚体发展。

大约两天后,可以收集并进一步培养非信徒盘子镀与 EBs 滴。在适当的时间点为所需的细胞谱系,胚体被镀回上糊贴壁组织培养皿为进一步分化。

现在,我们已经涵盖的基本技术的培养和分化胚胎干细胞,让我们看看他们如何针对特定实验的需要。

正如前面提到的可以指示胚胎干细胞分化为特定类型的细胞在不同培养条件下。在这个实验中,科学家制造出人类胚胎干细胞的运动神经元。这是通过第一次添加因素对区分指引他们走向的神经的沿袭,其次是化学品和专门将这些细胞变成运动神经元的电镀条件的胚体。使用类似的方法,研究人员已成功地向有节奏地跳动的心脏肌肉细胞分化的胚胎干细胞。

因为分化的胚胎干细胞模仿当胚胎是自然发生的事件,我们也可以使用它们来调查的早期胚胎发育生物学。正在研究的现象之一就是 x 染色体失活或 XCI,藉以两条 x 染色体之一沉默在每个单元格的雌性哺乳动物的关键过程。通过可视化特定 Rna 和蛋白质在发展中国家 EBs 的分布,科学家有获得了宝贵的见解的 XCI 生物学。

最后,为了提高一致性和效率的 ES 细胞实验,科学家们要不断地尝试设计出更好的技术,培养胚胎干细胞。一种方法是成长在一个单一的层,称为非殖民地类型单层培养,或和氏璧的胚胎干细胞。

还记得人类胚胎干细胞容易不开心的当他们不变的更像 3D 聚合吗?科学家发现化学物质称为岩石抑制剂增加游离的胚胎干细胞,使它们作为单个细胞悬浮液,传,并在高密度镀的生存。和氏璧化工技术的优点是每个单元格将更加平等地暴露生长因子和营养物质在介质中,而使它容易种植 ES 细胞在大量减少文化内的非均质性。

你刚看了关于如何培养和胚胎干细胞分化的朱庇特的视频。你现在应该知道哪些因素是重要的维持 ES 细胞在其未分化的状态,并且如何我们可以利用 ES 细胞多向分化潜能,在培养皿中生成特定类型的细胞。展望未来,科学家们将努力开发更有效和明确培养和分化生产条件可以用在再生医学应用的专门的细胞类型。谢谢观赏 !

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE

Applications