胚性幹細胞の培養と分化

Developmental Biology

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Summary

胚性幹 (ES) 細胞を培養、多能性と自己複製能力を維持するために画一的な州のこれらのセルを維持する条件が必要です。幹細胞生物学者は ES 細胞培養の効率を改善する方法を最適化する継続的と同時に ES 細胞の再生医療で使用できる特定の細胞型への分化を指示しようとしています。

このビデオでは、ES の細胞培養の基本的な原則を説明し、成長し、ES 細胞を通過する一般的なプロトコルを示します。我々 も吟味の掛かるドロップ、ES 細胞を区別するために使用する方法。最後に、このビデオは ES の細胞培養のいくつかのアプリケーションを記述して、筋肉細胞の in vitro分化技術、機能を生成するために使用法を含む心臓します。

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JoVE Science Education Database. 発生生物学の必需品. 胚性幹細胞の培養と分化. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

胚性幹細胞や ES 細胞正規大人の細胞からそれらを区別するユニークなプロパティの数を持っています。したがって、科学者たちは、維持したり、これらのプロパティを活用する特別な養殖技術を考案しています。適切に培養した ES 細胞は彼ら自身の多くを無期限に分割できます。同時に、培養条件を変えることによって ES 細胞に指示できる私たちの体は、ほぼ任意のセル型に分化ES 細胞のこの能力は、「多分化能」と呼ばれる

このビデオであなたは文化および使用し、今日の研究者によって洗練された、彼らは、彼らのユニークな特性を維持、ES に分化誘導する方法フォームの特定の細胞の種類、細胞、ES 細胞を培養・分化技術方法がされている ES 細胞を通過する方法を学ぶつもりです。

ES 細胞維持の手順の詳細に入る前にまず何を防いだり、ES 細胞の分化をドライブを理解することが重要です。ES 細胞の多能性と自己複製の独自のプロパティを保持するために、彼ら培養の培地に特定の要因への分化を抑制する必要があります。

これはほとんど「送り装置」のレイヤーに ES 細胞を培養によって行われます通常、通常マウスの胚性線維芽細胞または MEFs。フィーダー細胞「フィード」ES 細胞アクチビン A など、ES 細胞の未分化状態を維持するために役立つ特定の要因。

最近、科学者はまたどの ES 細胞がメディアで定義されたレシピの追加に必要な要因と栽培されてフィーダー フリー培養方法を開発しました。この方法では、変動を削減し、臨床応用のための前提条件である ES 細胞培養から人間でないコンポーネントを削除します。

ES 細胞のもう一つの特徴は彼らが当然のことながらクラスターまたはコロニーで成長し、単一セル、特にヒト ES 細胞解離するとき低い生存率を持っている傾向があります。その結果、機械の「狩り」をそのまま塊でそれらを保持必要があります一般的に、ヒト ES 細胞を継

ES 細胞は、非付着条件で栽培されて、胚様体や EBs、ES 細胞がすべての異なったセルタイプに区別として知られている 3 D 集計が形成されます。、中に特定の成長因子の添加などの分化条件を変化させることにより科学者に特定の細胞型 ES 細胞分化を直接法を開発します。

今では原理を ES 細胞の維持と分化を理解すると、文化し、MEF の送り装置に ES 細胞を通過する方法を見てみましょう。

MEFs 初期マウス胚から得られる、化学薬品またはさらに分割することからそれらを防ぐために放射線によって不活化し、.不活化 MEFs は、ES 細胞の培養を開始する前に少なくとも 1 日の糊のティッシュの培養皿の上にメッキする必要があります。送り装置は完全に解決、ES 細胞が融解およびプレートに播種します。

次の数日間、ES 細胞は大きなコロニーに成長されます。タッチし、ヒューズに植民地を始める前に ES 文化を継代する必要があります。1 つは差別化の兆候を見せているかどうか参照してくださいに ES 細胞の形態を観察する必要があります。分化した細胞の鈍い、不規則な形をした「石畳。」ようになりますしながら、未分化 ES コロニー一般に見て明確に定義された、均一な

植民地分化の 70% 以上を示す場合、彼らがまばらな場合、機械的に未分化コロニーをカットし、新しいフィーダー プレートに転送。そうでなければ、単に差別化された領域または植民地を削除し、継と進みます。

差別化されたコロニーがクリーンアップされて時間の適切な量の 37 ° C で培養プレートからセルを解除するコラゲナーゼのような蛋白質分解酵素が追加されます。新規メディアの ES は、酵素反応を停止する追加されます。植民地は、機械的にプレートから外れ、どこ彼らは穏やかなピペッティングを任意の大きさに分割されている遠心管に転送。ES 細胞は遠心分離によって収集された、ES メディアで再停止される、準備された送り装置の版の上にメッキします。

ES 細胞を通過する方法を学習した後、胚様体の吊り下げに ES 細胞を区別するために使用されるより一般的な手法の 1 つを見てみましょうドロップします。

まず、ES 細胞がコラゲナーゼのような蛋白質分解酵素の助けを借りて、デタッチされ、系統固有の差別化要因を含んでいる媒体で必要な濃度に希釈しています。ES 細胞懸濁液、細菌のシャーレの蓋の上に滴に堆積します。蓋がすぐに反転し、メディア滴逆さまに掛かるであり、開発する胚様体を許可するので、皿の上に配置します。

約 2 日後 EBs と滴を収集し、さらに培養するため非付着プレートの上にメッキできます。目的の細胞系譜の適切な時点で胚様体をさらに差別化のため糊の付着性のティッシュの培養皿の上に戻ってめっき。

今では養殖、ES 細胞を分化の基本的なテクニックを説明しましたので、どのように彼らはの実験ニーズに合わせてを見てみましょう。

前述したように、ES 細胞は異なる培養条件下で特定のセルタイプに区別するために監督することができます。この実験では、科学者はヒト ES 細胞から運動ニューロンを生産しました。これは、神経系統、続いて化学物質と運動ニューロンに具体的にこれらのセルを回すめっき条件に向かってそれらを直接胚様体を区別する最初の追加要因によって行われました。同様のアプローチを使用して、研究者は中心の筋肉細胞を打つリズミカルに ES 細胞を区別することに成功しています。

ES 細胞は胚開発自然に発生するイベントを模倣, ので我々 は、初期胚発生の生物学を調査するのにそれらをも使用できます。研究されている現象の一つは、x 染色体の不活性化、または嘲りながら、雌の哺乳類の各セルに 1 つ 2 つよりの沈黙させてという重要なプロセスです。特定の Rna と EBs の開発中のタンパク質の分布を可視化、科学者は、嘲りながらの生物学に貴重な洞察力を得ています。

最後に、一貫性と ES 細胞実験の効率を増加する科学者が継続的にしようと ES 細胞の培養により良い技術を考案します。1 つのアプローチは、非植民地型単層培養、または NCM と呼ばれる、単一のレイヤーに ES 細胞を成長することです。

ヒト ES 細胞が不幸になるときに彼らは 3 D 集計として成長していない傾向があることを覚えていますか。科学者たちは、ROCK 阻害薬として知られている化学物質が単一細胞懸濁液として継代するし、高密度でめっきするように解離の ES 細胞の生存率を高めることが示されています。NCM 手法の利点は、成長因子や栄養素中、大量に ES 細胞を成長しやすくしつつ、文化の中での不均一性を減らすことにすべてのセルがより均等に公開することです。

ゼウスの文化および胚性幹細胞を区別する方法のビデオを見てきただけ。今、どのような要因が ES 細胞の未分化状態でどのように我々 は ES の利点を取ることができる細胞皿に特定の細胞型を生成する多能性を維持するために重要な知っておくべきです。今後は、科学者はより効率的かつ明確に定義された培養と分化を生成する条件再生医療アプリケーションで使用することができます特殊な細胞の種類を開発する作業になります。見てくれてありがとう!

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