Transwell 移行アッセイ

Cell Biology
 

Summary

化学手掛かりに応答細胞の移行は、がんなどの開発、免疫と疾患状態に不可欠です。 細胞遊走を定量化するには、簡易測定法は transwell 移行アッセイまたはボイデン室アッセイとして今知られている博士スティーブン ボイテンによって 1961 年に開発されました。この設定では、上部と下部のコンパートメントに multiwell プレートの井戸を隔てる挿入で構成されます。その移行検討するセルは、上部コンパートメントにシードし、走化性因子の解決が下部コンパートメントに置かれます。インキュベーション後、走化性による移行の定量化を下部コンパートメント内のセルをカウントできます。

このビデオは、細胞移行研究の一般的に使用される実験の設定を確認します。その後、いくつかの主要考慮事項を強調表示し、付着性のセルを含む実験を実行するための一般的なプロトコルの概要を説明します。最後に、現在移行に影響を与えるさまざまな要因を研究に使用されているこのセットアップの様々 な適応を確認します。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 細胞生物学の必需品. Transwell 移行アッセイ. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Transwell 移行アッセイは、科学者が細胞運動を定量化することができる古典的な手法です。移行は個別に、またはクラスターを移動する細胞の能力を指します。細胞運動、細胞骨格の正確な再編を通じて可能し、移行は通常の手がかりとして行動刺激への応答で発生します。

今日、transwell 移行アッセイは、誘致キューへの応答での移行を評価する単純な商工会議所セットアップを利用して説明します。

我々 は、transwell 室に関するいくつかの背景情報を提供することによって開始されます。

装置は最初、白血球の遊走を研究に使用した 1961 年に博士スティーブン boyden 教授によって設計されました。したがって、このメソッドはボイデン室アッセイではまたとして知られています。

単純な boyden 教授室で外壁は井戸の 96 ウェル プレートのもののようです。各ウェル中円筒形インサートはの transwell が配置されます。Insert は、細孔サイズ定義のポリカーボネート膜をに。井戸に置かれたとき、2 つのコンパートメントに商工会議所を分割します。上部コンパートメントは、渡り鳥行動は調査されるべき細胞はシードされます、下部貯水池は、走化性因子のソリューションが配置されています。定義により、走化性因子は「細胞を誘致」することで細胞の運動性を促進する能力を持つ分子です。

これらの魅力的な力により上部コンパートメント内のセルは、下部貯水池に毛穴に移行します。セル次の動き、いくつかの悪性黒色腫細胞のような付着性のプロパティがある場合は「つく」膜下側に。この場合、ステンド グラス、膜を修正できる、細胞を顕微鏡下で数えることができます。その一方で、精子のような非付着性のセルは、下部貯水池に移行されます。この場合、診断の助けを借りて貯水池ソリューション内のセルを数えることができます。

この試金のためのセットアップは簡単ですが、実験する前に考慮する必要がありますいくつかのものがあります。それらのいくつかを確認してみましょう。

細胞の移動を観察する密度を最適化することを確認あるからシードのソリューションは。セルの数が少なすぎることができます検出できない移行と密度を高める、移行を列挙するが難しく、膜を人口過剰。第 2 考察は、挿入の細孔サイズです。それは、細胞の種類に応じて慎重に選択する必要があります。孔径が小さすぎると、細胞は通過することになります。

また、細孔径が大きすぎる場合のセルだけフォールスルーされます、移行ではないです。最後に、これらは相互に依存、走化性因子の濃度と移行の許可するインキュベーション時間の意識なりません。コンパートメント間で濃度勾配を維持中に適切な培養時間の最適な濃度は、化学療法魅力による細胞移動を誘導します。逆に、得られた結果の分析を混同することができます化学勾配の損失につながる部屋の中で走化性因子の平衡によって長時間の孵化を伴うことがあります。

念頭に置いてこれらの考慮点、付着性細胞の移動を測定するためのプロトコルを説明しましょう。

細胞試金するプロテアーゼ培プロテアーゼが重要な膜受容体を変性および最終的に移行に影響できるので用意しています。細胞を準備した後最適な播種密度に懸濁液を希釈する必要があります。商工会議所を準備するために transwells は、multiwell プレートのウェルに配置されます。細胞懸濁液は、膜に触れるや気泡を導入することなしに、transwell 戻必要があります。

走化性因子のソリューションは、ソリューションに触れる挿入の膜を確かめるより低い貯蔵所に戻です。移行のためのインキュベーション時間は実験的考慮事項によって異なります。インキュベーション後、膜挿入を 70% エタノールに浸漬固定です。乾燥への挿入を可能にした後染色液セルが追加されます。

次に、細胞は約 30 分間室温で孵化します。次の孵化、挿入を洗浄洗浄液の助けを借りて。最後に、膜を摘出し、顕微鏡スライド上に配置することができます。細胞膜の下側には、存在に移行した細胞の数と走化性因子の不在を表します。

以来、プロトコルのための感じを今、研究者が自分たちの探求にこのメソッドを使用している方法を簡単に見てをみましょう。

この試金の最も一般的なアプリケーションの 1 つは未知化合物の走化性因子の特性を評価する.ここでは、科学者は両生類卵から分泌される物質である allurin の存在下でカエルの精子のスイミング パスを調べるに興味があった。これを行うには、彼らはまず transwell 挿入の上にアクティブなカエルの精子を戻します。下に、彼らは allurin 追加しました。移行するセルを可能にした後、それらは顕微鏡下で貯留層ソリューションで精子を数えた。この手法を使用すると、精子の移動における allurin 濃度の影響を描いた濃度反応曲線を生成することができました。

セルが病原体によって攻撃されるとき、移行、接続、およびその後感染症を解決する免疫細胞を募集する走化性因子を送信します。この現象は、これらの科学者培養上皮細胞チップの下側をテストします。その後、彼らは、異なる系統の細菌のこれらの細胞を感染しています。最後に、彼らはトップの商工会議所に免疫細胞を導入しました。感染した細胞が免疫細胞の遊走を誘導するいくつかの塩基を生成することが知られています。この実験の結果を示した異なる種類の細菌の感染に対して好中球の浸潤の程度が異なる。

最後に、癌細胞の浸潤と転移細胞外マトリックスを常に興味を持って細胞生物学者。ここでは、科学者がどのように特定の塩基を確認したい 3 D マトリックスを通してこのような移行に貢献することができます。彼らは遺伝子組み換え細胞の 2 つの別々 のプール: 緑の蛍光を表現する 1 つおよび別の赤、蛍光タンパク質。彼らは、transwells の上部に細胞外マトリックス模倣を戻します。

凝固させる為、一度、彼らは、transwell を反転し、細胞膜の下側への 2 つのプールをシードします。次に、彼らは multiwell プレートに挿入を交換し、走化性因子ソリューションを上部室に戻します。これは 3 D マトリックスを通じてを移動する下部細胞を生じる。共焦点レーザー顕微鏡の助けを借りて、これらの研究者は、3 D の細胞の遊走を再建され、細胞の 2 グループの移行パターンを区別します。

ゼウスの transwell 遊走アッセイによるビデオを見てきただけ。コンポーネントの理解とこのメソッドのプロトコルで、あなたは今、なぜそれは細胞生物学者により広く使用知っています。このセットアップのシンプルさにもかかわらず、この方法が適応できる構成の範囲では、細胞運動研究の不可欠ななります。いつも見てくれてありがとう!

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