应用 TUNEL 法检测

Cell Biology

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Summary

细胞凋亡的主要标志之一是由核酸酶核 DNA 碎片。这些酶被激活的半胱氨酸蛋白酶,执行细胞死亡程序的蛋白质家族。应用 TUNEL 法检测是一种方法,利用此功能来检测细胞凋亡。在这种测定方法,一种叫做采用脱氧核糖核酸末端转移酶酶催化破碎 DNA 的两端自由 3' 末端核苷酸的加法。通过使用能产生荧光或颜色的化学标记标记的 dUTPs,可以具体确定凋亡细胞。

应用 TUNEL 法检测朱庇特的视频开始讨论如何使用这种技术来检测细胞凋亡。然后我们通过一般的协议,用于在组织切片上执行 TUNEL 分析和可视化结果使用荧光显微镜。最后,将涵盖的测定对当前研究的几个应用程序。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 细胞生物学精要. 应用 TUNEL 法检测. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

应用 TUNEL 法检测是最常用来检测细胞凋亡,这是一种程序性的细胞死亡。细胞凋亡是重要的生物过程,在发展中,并保持组织的平衡。TUNEL 染色允许可视化和量化的凋亡细胞。这将有助于科学家测试对细胞凋亡是或者抑制,像癌症,或者增强,与神经变性疾病的新疗法的疗效。

这个视频将解释如何使用应用 TUNEL 法检测细胞凋亡,组织切片,执行此方法的分步议定书的标签和研究人员正在如何应用这种技术来了解细胞死亡机制。

应用 TUNEL 法检测的协议之前,让我们讨论这项技术背后的原则。

DNA 断裂是细胞凋亡的许多标志性特征之一。Dna 是如何发生的?细胞凋亡是由酶称为半胱氨酸蛋白酶在胞浆内目前进行的。他们的主要作用是劈开蛋白质以拆除该单元格。此外,半胱氨酸蛋白酶激活酶的分离及其抑制剂称为半胱氨酸蛋白酶激活的头或 CAD,— — ICAD。激活的 CAD 是核酸内切酶,旅行到原子核和劈开染色体 DNA。

对 DNA 的切割与刻痕的末端,最终导致 DNA 片段的积累和应用 TUNEL 法检测荧光标签这些刻痕两端的支离破碎的 DNA,让科学家们检测细胞凋亡。但这是如何发生?为此,你必须理解 TUNEL 反应。TUNEL 代表采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的末端缺口末端标记。两个主要 TUNEL 试剂是采用脱氧核糖核酸末端转移酶,或 TdT,和脱氧尿嘧啶核苷三磷酸或末端,可能为了便于检测荧光标记。

为了了解 TUNEL 反应,让我们回到凋亡细胞的 DNA 片段。这些刻痕片段有免费的 3 ′ 端羟基。一旦你添加到示例包含凋亡细胞 TUNEL 试剂,荧光标记的 dUTPs 将附加到这些 3 ′ 端羟基的催化剂酶 TdT 的帮助。细胞染色使用此过程被称为 TUNEL 阳性细胞,然后可以使用荧光显微镜可视化。

现在,你理解的基本原理和应用 TUNEL 法检测背后的概念,让我们概述为执行这项技术在组织切片的一般协议。应用 TUNEL 法检测的主要步骤包括固定利息,通透的组织,添加 TUNEL 试剂,停止 TUNEL 反应,和最后分析的组织。

第一,感兴趣的组织必须固定以保持生物结构。固定工作由交联蛋白质在细胞内。为应用 TUNEL 法检测,可以通过将它们添加到 4 — — 24 小时在 4 ° C.含有 4%多聚甲醛溶液固定组织后固定,适于组织成薄片的 10 微米或更少。

下一步是通透性,如 TdT 酶试剂允许穿透细胞的细胞核。通透的切片可以进行添加组织蛋白酶 K 解决方案 5 – 15 分钟在 37 ° c。在室温 15-30 分钟在摇床上冲洗切片与磷酸盐缓冲液。

之后通透性,TdT 酶和荧光标记的 dUTPs 添加到切片和含钴作为辅酶 TUNEL 反应贴标缓冲区。在一起,TUNEL 反应混合物组织切片在 37 ° C,1 — — 3 小时孵化和避光,防止褪色荧光。

之后孵化,停止缓冲区添加到组织部分停止 TUNEL 反应,和短孵育后的部分用清水洗净磷酸盐缓冲生理盐水。最后,使用荧光标记的原位组织切片的可视化使用荧光显微镜和本地化 TUNEL 阳性细胞内一个特定组织的评估。一个可以简单地通过计数的给定的组织切片中 TUNEL 阳性细胞百分比量化细胞死亡。

现在,您已经看到如何执行 TUNEL 法检测凋亡细胞,让我们讨论一下如何使用这种测定方法,以解决提问细胞生物学家。

细胞死亡发生作为发展的组织和结构,造型和消除不必要细胞的正常部分。因此,科学家们感兴趣这现象研究产前接触到不同物质对细胞凋亡的影响在开发过程中。在这里,科学家们感兴趣地审查生前酒精暴露对脑发育的影响。TUNEL 染色结果对胎儿的大脑显示凋亡增加产前被暴露于酒精,而对照组的动物组织中执行。

科学家们还使用应用 TUNEL 法检测探讨细胞凋亡在对细菌感染的反应。在这个实验中,科学家开发出肺炎模型小鼠注射铜绿假单胞菌,导致肺部炎症。然后在此基础上,肺组织中移除了,TUNEL 染色为例,考察对细菌感染的反应细胞凋亡。结果表明,细胞凋亡增加小鼠暴露于细菌,而对照组的动物。

最后,TUNEL 染色可用于人类肿瘤样本,以便确定肿瘤对药物的反应。在此示例中,肿瘤样本取自人类患者,体外。接下来,他们用临床前药物治疗,采用 tunel 反应评估。获得的数据表明,显著抑制热休克蛋白 90 药物治疗提高肿瘤组织中的细胞凋亡。

你刚看了朱庇特的视频使用 TUNEL 法检测细胞凋亡。这个视频审查背后 TUNEL 染色,并一步一步的协议在组织切片上执行应用 TUNEL 法检测的原则。我们还审查了如何可以应用这种方法了解细胞程序性的死亡过程的发展和疾病。一如既往,感谢您收看 !

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