Overview
Uno dei tratti distintivi dell'apoptosi è la frammentazione del DNA nucleare da parte delle nucleasi. Questi enzimi sono attivati dalle caspasi, la famiglia di proteine che eseguono il programma di morte cellulare. Il test TUNEL è un metodo che sfrutta questa funzione per rilevare le cellule apoptotiche. In questo test, un enzima chiamato desossinucleotidil transferasi terminale catalizza l'aggiunta di nucleotidi dUTP alle estremità libere 3' del DNA frammentato. Utilizzando dUTP etichettati con tag chimici in grado di produrre fluorescenza o colore, le cellule apoptotiche possono essere identificate in modo specifico.
Il video di JoVE sul test TUNEL inizia discutendo di come questa tecnica possa essere utilizzata per rilevare le cellule apoptotiche. Passiamo quindi attraverso un protocollo generale per eseguire saggi TUNEL su sezioni di tessuto e visualizzare i risultati utilizzando la microscopia a fluorescenza. Infine, saranno trattate diverse applicazioni del test alla ricerca attuale.
Procedure
Il test TUNEL è più comunemente usato per rilevare le cellule sottoposte ad apoptosi, che è una forma di morte cellulare programmata. L'apoptosi è un importante processo biologico durante lo sviluppo e per il mantenimento dell'omeostasi tissutale. La colorazione TUNEL consente la visualizzazione e la quantificazione delle cellule apoptotiche. Questo aiuta gli scienziati a testare l'efficacia di nuovi trattamenti per i disturbi in cui l'apoptosi è inibita, come nel cancro, o migliorata, come nella neurodegenerazione.
Questo video spiegherà come il test TUNEL può essere utilizzato per etichettare le cellule sottoposte ad apoptosi, un protocollo passo-passo per eseguire questo metodo in sezioni di tessuto e come i ricercatori stanno applicando questa tecnica per comprendere i meccanismi di morte cellulare.
Prima di approfondire il protocollo del test TUNEL, discutiamo i principi alla base di questa tecnica.
Una delle molte caratteristiche distintive dell'apoptosi è la frammentazione del DNA. Come avviene la frammentazione del DNA? L'apoptosi è effettuata da enzimi chiamati caspasi presenti nel citosol. Il loro ruolo primario è quello di scindere le proteine al fine di smantellare la cellula. Inoltre, le caspasi attivano un enzima chiamato DNasi attivata dalla caspasi, o CAD, staccandolo dal suo inibitore: ICAD. La CAD attivata è un'endonucleasi che viaggia verso il nucleo e fende il DNA cromosomico.
La scissione del DNA alla fine causa l'accumulo di frammenti di DNA con estremità graffiate, e il test TUNEL etichetta fluorescentemente queste estremità nicked di DNA frammentato, consentendo agli scienziati di rilevare l'apoptosi. Ma come avviene? Per questo devi capire la reazione TUNEL. TUNEL è l'acronimo di terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling. I due principali reagenti TUNEL sono la deossinucleotidil transferasi terminale, o TdT, e la deossiuridina trifosfato, o dUTP, che possono essere etichettati fluorescentemente per facilitare il rilevamento.
Per capire la reazione TUNEL, torniamo alle cellule apoptotiche con frammenti di DNA. Questi frammenti ossidrilici hanno gruppi idrossilici liberi di 3′. Una volta aggiunti i reagenti TUNEL a un campione contenente cellule apoptotiche, i dUTP etichettati fluorescentemente si attaccano a questi gruppi ossidrilici 3′ con l'aiuto dell'enzima catalizzatore TdT. Le cellule colorate con questa procedura sono chiamate cellule positive TUNEL, che possono quindi essere visualizzate utilizzando la microscopia a fluorescenza.
Ora che hai compreso i principi e i concetti di base alla base del test TUNEL, descriviamo un protocollo generale per l'esecuzione di questa tecnica nelle sezioni di tessuto. I passaggi principali del test TUNEL includono il fissaggio del tessuto di interesse, la permeabilizzazione del tessuto, l'aggiunta di reagenti TUNEL, l'arresto della reazione TUNEL e infine l'analisi.
In primo luogo, il tessuto di interesse deve essere fissato al fine di preservare le strutture biologiche. La fissazione funziona incrociando le proteine all'interno delle cellule. Per il test TUNEL, i tessuti possono essere fissati aggiungendoli a una soluzione contenente il 4% di paraformaldeide per 4-24 ore a 4°C. Dopo la fissazione, criosezionare il tessuto in fette sottili di 10 μm o meno.
Il passo successivo è la permeabilizzazione, che consente ai reagenti come l'enzima TdT di penetrare nel nucleo cellulare. La permeabilizzazione delle sezioni tissutali può essere eseguita aggiungendo il tessuto alla soluzione di proteinasi K per 5-15 minuti a 37°C. Risciacquare le sezioni di tessuto con soluzione salina tamponata con fosfato su uno shaker orbitale per 15-30 minuti a temperatura ambiente.
Dopo la permeabilizzazione, l'enzima TdT e i dUTP etichettati fluorescentemente vengono aggiunti alle sezioni tissutali, insieme a un tampone di etichettatura contenente cobalto che funge da cofattore per la reazione TUNEL. Insieme, la miscela di reazione TUNEL e la sezione tissutale vengono incubate per 1-3 ore a 37 ° C e protette dalla luce per evitare che la fluorescenza svanisca.
Dopo l'incubazione, il tampone di arresto viene aggiunto alla sezione tissutale per cessare la reazione TUNEL e dopo una breve incubazione le sezioni vengono lavate con soluzione salina tamponata con fosfato. Infine, le sezioni di tessuto colorate con dUTP marcato fluorescentemente vengono visualizzate utilizzando la microscopia a fluorescenza e valutate per la localizzazione di cellule POSITIVE TUNEL all'interno di un determinato tessuto. Si può quantificare la morte cellulare semplicemente contando la percentuale di cellule TUNEL positive in una determinata sezione di tessuto.
Ora che hai visto come eseguire il test TUNEL per rilevare le cellule apoptotiche, discutiamo di come questo test può essere utilizzato per rispondere alle domande poste dai biologi cellulari.
La morte cellulare si verifica come una parte normale dello sviluppo per la scultura di tessuti e strutture e per l'eliminazione di cellule non necessarie. Pertanto, gli scienziati interessati a questo fenomeno studiano l'effetto dell'esposizione prenatale a diverse sostanze sull'apoptosi durante lo sviluppo. Qui, gli scienziati erano interessati a esaminare l'effetto dell'esposizione prenatale all'alcol sullo sviluppo del cervello. I risultati della colorazione TUNEL eseguita sul cervello fetale hanno rivelato un aumento dell'apoptosi nei tessuti esposti prenatale all'alcol, rispetto agli animali di controllo.
Gli scienziati usano anche il test TUNEL per studiare l'apoptosi in risposta all'infezione batterica. In questo esperimento, gli scienziati hanno sviluppato un modello di polmonite iniettando topi con Pseudomonas aeruginosa, che induce l'infiammazione polmonare. Quindi, il tessuto polmonare è stato rimosso e la colorazione TUNEL è stata eseguita per esaminare l'apoptosi in risposta all'infezione batterica. I risultati mostrano che la morte delle cellule apoptotiche è aumentata nei topi esposti ai batteri, rispetto agli animali di controllo.
Infine, la colorazione TUNEL può essere utilizzata su campioni di tumore umano, al fine di determinare la risposta del tumore ai farmaci. In questo esempio, i campioni di tumore sono stati raccolti da pazienti umani e coltivati ex vivo. Successivamente, sono stati trattati con farmaci pre-clinici e valutati per una risposta utilizzando il test TUNEL. I dati ottenuti mostrano che il trattamento con un farmaco che inibisce la proteina 90 da shock termico aumenta significativamente l'apoptosi nel tessuto tumorale.
Hai appena visto il video di JoVE sull'utilizzo del test TUNEL per rilevare le cellule sottoposte ad apoptosi. Questo video ha esaminato i principi alla base della colorazione TUNEL e un protocollo passo-passo per eseguire il test TUNEL sulle sezioni di tessuto. Abbiamo anche esaminato come questo metodo potrebbe essere applicato per comprendere la morte cellulare programmata durante lo sviluppo e la malattia. Come sempre, grazie per aver guardato!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
