L’essai TUNEL

Cell Biology

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Summary

Une des caractéristiques de l’apoptose est la fragmentation de l’ADN nucléaire par les nucléases. Ces enzymes sont activées par des caspases, la famille de protéines qui exécute le programme de mort cellulaire. Essai TUNEL est une méthode qui tire parti de cette fonctionnalité pour détecter les cellules apoptotiques. Dans ce test, une enzyme appelée transférase terminale de deoxynucleotidyl catalyse l’addition de nucléotides dUTP jusqu’aux extrémités 3' de fragments d’ADN. À l’aide de dUTPs qui sont étiquetés avec des tags chimiques qui peuvent produire la fluorescence ou la couleur, les cellules apoptotiques peuvent être spécifiquement identifiées.

Vidéo de JoVE sur l’essai TUNEL commence par discuter comment cette technique peut être utilisée pour détecter les cellules apoptotiques. Nous passons ensuite à travers un protocole général pour effectuer des essais TUNEL sur coupes tissulaires et visualiser les résultats en utilisant la microscopie à fluorescence. Enfin, plusieurs applications de l’analyse à la recherche actuelle seront couverts.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Notions essentielles de biologie cellulaire. L’essai TUNEL. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

L’essai TUNEL est plus couramment utilisé pour détecter les cellules en apoptose, ce qui est une forme de mort cellulaire programmée. L’apoptose est un processus biologique important au cours du développement et pour le maintien de l’homéostasie tissulaire. TUNEL coloration permet pour la visualisation et la quantification des cellules apoptotiques. Cela aide les scientifiques à tester l’efficacité de nouveaux traitements pour les troubles dont l’apoptose est inhibée, comme dans le cancer, ou amélioré, comme la neurodégénérescence.

Cette vidéo vous expliquera comment l’essai TUNEL peut être utilisé pour étiqueter des cellules en apoptose, un protocole étape par étape pour réaliser ce procédé dans des sections de tissu, et comment les chercheurs appliquent cette technique afin de comprendre les mécanismes de mort cellulaire.

Avant de plonger dans le protocole de l’essai TUNEL, nous allons discuter les principes qui sous-tendent cette technique.

Une des nombreuses caractéristiques caractéristique de l’apoptose est la fragmentation de l’ADN. Comment la fragmentation de l’ADN se produit-elle ? L’apoptose est effectuée par des enzymes appelées caspases présents dans le cytosol. Leur rôle principal est de cliver les protéines afin de démanteler la cellule. En outre, les caspases activer une enzyme appelée caspase-activated DNase, ou CAD, en détachant de son inhibiteur — la CISD. Activés CAD est une endonucléase qui se déplace vers le noyau et Clive l’ADN chromosomique.

Clivage de l’ADN provoque finalement l’accumulation de fragments d’ADN avec les extrémités ébréchées, et l’essai TUNEL Fluorescent étiquettes ces entaillé les extrémités des fragments d’ADN, permettant aux scientifiques détecter l’apoptose. Mais comment cela se passe-t-il ? Pour cela vous devez comprendre la réaction de TUNEL. TUNEL est synonyme de terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-fin d’étiquetage. Les deux principaux réactifs TUNEL sont transférase terminale de deoxynucleotidyl, TdT et uridine triphosphate ou dUTP, qui peut-être être étiqueté fluorescent pour la facilité de détection.

Afin de comprendre la réaction de TUNEL, revenons sur les cellules apoptotiques avec des fragments d’ADN. Ces entaillé fragments ont des groupes hydroxyles libres 3′. Une fois que vous ajoutez les réactifs TUNEL à un échantillon contenant des cellules apoptotiques, les fluorescent étiquetés dUTPs joindre à ces groupes d’hydroxyle 3′ avec l’aide de l’enzyme catalyseur TdT. Les cellules colorées à l’aide de cette procédure sont appelés cellules TUNEL, qui peuvent ensuite être visualisées à l’aide de la microscopie de fluorescence.

Maintenant que vous comprenez les principes fondamentaux et les concepts qui sous-tendent l’essai TUNEL, nous allons décrire un protocole général pour effectuer cette technique dans des sections de tissu. Les principales étapes de l’essai TUNEL incluent le tissu d’intérêt, perméabilisation du tissu, ajout de réactifs TUNEL, arrêt de la réaction de TUNEL et enfin l’analyse de fixation.

Tout d’abord, le tissu d’intérêt doit être fixé afin de préserver les structures biologiques. Fixation fonctionne par réticulation des protéines dans les cellules. Pour l’essai TUNEL, les tissus peuvent être fixées en les ajoutant à une solution contenant de paraformaldéhyde à 4 % pendant 4 à 24 heures à 4° C. Après fixation, cryosection le tissu en fines tranches de 10 µm ou moins.

L’étape suivante est la perméabilisation, ce qui permet des réactifs comme l’enzyme TdT de pénétrer dans le noyau de la cellule. Perméabilisation des sections de tissu peut être effectuée en ajoutant le tissu à la solution de protéinase K de 5 à 15 minutes à 37° C. Rincer les coupes de tissus avec une solution saline tamponnée au phosphate dans un agitateur orbital pendant 15-30 minutes à température ambiante.

Après perméabilisation, l’enzyme TdT et dUTPs fluorescent étiquetés sont ajoutés à des coupes de tissus, ainsi qu’un étiquetage tampon contenant du cobalt qui agit comme un cofacteur de la réaction de TUNEL. Ensemble, le mélange réactionnel de TUNEL et la section de tissu sont incubés pendant 1 à 3 heures à 37° C et abri de la lumière pour éviter la fluorescence de l’effacement.

Après l’incubation, tampon de butée est ajouté à la section de tissu de cesser la réaction de TUNEL, et après une courte période d’incubation les sections sont lavées avec un tampon phosphate salines. Enfin, des coupes de tissus colorés à l’aide de dUTP fluorescent étiqueté sont visualisées à l’aide de la microscopie de fluorescence et évalué pour la localisation des cellules dans un tissu donné TUNEL. On peut quantifier la mort cellulaire simplement en comptant le pourcentage de cellules TUNEL dans une section de tissu donné.

Maintenant que vous avez vu comment exécuter l’essai TUNEL pour détecter les cellules apoptotiques, nous allons discuter de comment ce test peut être utilisé pour traiter les questions posées par les biologistes cellulaires.

La mort cellulaire se produit dans le cadre normal du développement pour la sculpture des tissus et des structures et pour l’élimination des cellules inutiles. Par conséquent, scientifiques intéressent dans l’étude de ce phénomène l’effet de l’exposition prénatale à différentes substances sur l’apoptose au cours du développement. Ici, les scientifiques se sont intéressés en examinant l’effet de l’exposition prénatale à l’alcool sur le développement du cerveau. Les résultats de coloration de TUNEL effectuées sur le cerveau foetal a révélé une augmentation de l’apoptose dans les tissus qui ont été exposés avant leur naissance à l’alcool, par rapport aux animaux témoins.

Les scientifiques utilisent également l’essai TUNEL pour enquêter sur l’apoptose en réponse à une infection bactérienne. Dans cette expérience, les scientifiques a développé un modèle de pneumonie en injectant des souris avec Pseudomonas aeruginosa, qui induit une inflammation pulmonaire. Ensuite, les tissus pulmonaires a été supprimé et TUNEL coloration a été réalisée afin d’examiner l’apoptose en réponse à l’infection bactérienne. Les résultats montrent que la mort cellulaire par apoptose a augmenté chez les souris exposées à la bactérie, par rapport aux animaux témoins.

Enfin, TUNEL de coloration peut être utilisée sur des échantillons de tumeur humaine, afin de déterminer la réactivité de la tumeur aux médicaments. Dans cet exemple, des échantillons de tumeur ont été récoltés sur des patients humains et cultivées ex vivo. Ensuite, ils ont été traités avec des médicaments précliniques et évalués pour une réponse à l’aide de l’essai TUNEL. Les données obtenues montrent que le traitement avec un médicament qui inhibe la protéine de choc thermique 90 sensiblement augmente l’apoptose dans le tissu tumoral.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur l’utilisation de l’essai TUNEL pour détecter les cellules en apoptose. Cette vidéo a examiné les principes qui sous-tendent le TUNEL de coloration et un protocole étape par étape pour effectuer l’essai TUNEL sur coupes de tissus. Nous avons également examiné comment cette méthode pourrait être appliquée pour comprendre la mort cellulaire programmée lors du développement et de la maladie. Comme toujours, Merci pour regarder !

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