TUNEL 法

Cell Biology

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Summary

アポトーシスの特徴の 1 つは、核酸分解酵素による核 DNA の断片化です。これらの酵素は、細胞死プログラムを実行する蛋白質族カスパーゼによってアクティブ化されます。Tunel は、アポトーシス細胞を検出するこの機能を活用する方法です。このアッセイでは、ターミナルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素は、断片化された DNA の無料 3' 端に dUTP のヌクレオチドの付加を触媒します。蛍光色を生成すること化学のタグでラベル付けされている dUTPs を使用して、アポトーシス細胞は具体的に識別されます。

この手法を使用して、アポトーシス細胞を検出する方法を議論すること、tunel ゼウスのビデオを開始します。我々 は、組織切片の TUNEL 法を実行して、蛍光顕微鏡を用いた結果を可視化するための一般的なプロトコルを通過します。最後に、アッセイの現在の研究のいくつかのアプリケーションがカバーされます。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 細胞生物学の必需品. TUNEL 法. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

TUNEL 法はプログラムされた細胞死の形態であるアポトーシス細胞の検出によく使用されます。アポトーシスは、開発中および組織の恒常性を維持するために重要な生物学的プロセスです。可視化やアポトーシス細胞の定量 TUNEL 染色ができます。これにより科学者の障害にアポトーシスが抑制、癌のようなまたは神経変性のように強化された新しい治療法の有効性をテストできます。

このビデオは、tunel を使用して細胞のアポトーシス、ティッシュ セクションでこのメソッドを実行するための段階的なプロトコルにラベルを付ける方法を説明する研究者が細胞死の機構を理解するためにこの手法を適用する方法と。

TUNEL の試金のプロトコルを掘り下げる前に、この手法の背後にある原理を説明しましょう。

アポトーシスの多くの認刻極印の特徴の 1 つは、DNA の断片化です。DNA の断片化が発生するしくみアポトーシスはカスパーゼは細胞質内に存在と呼ばれる酵素によって行われます。その主な役割は、セルを分解するために蛋白質を切断することです。さらに、カスパーゼはそのインヒビターから取り外すことによって DNase のカスパーゼ活性化、または CAD と呼ばれる酵素を有効に-ICAD。アクティブ化された CAD は核に移動し、染色体 DNA を切断する酵素です。

DNA の胸の谷間最終的に、ニックを両端に持つ DNA 断片の蓄積を原因し、tunel 蛍光ラベルのこれらアポトーシスを検出することができる、断片化された DNA の両端を傷します。しかし、どのようにこれが起こるか。そのため TUNEL 反応を理解しなければなりません。Tunel 反応は遊離トランスフェラーゼを介した dUTP ニック終わりの分類の略です。2 つのメインの TUNEL 試薬は、ターミナルトランスフェラーゼ、または TdT の, とデオキシウリジン三リン酸または dUTP は、蛍光検出の容易さのために分類することがあります。

TUNEL 反応を理解するために DNA のフラグメントとアポトーシスに戻って行きましょう。フラグメントがニックこれらは無料 3 ' ヒドロキシル グループがあります。Tunel 反応試薬をアポトーシス細胞を含むサンプルに追加する蛍光に分類された dUTPs TdT の触媒酵素の助けを借りて、これらの 3 ' の水酸基を付けます。この手順を使用して染色細胞は蛍光顕微鏡を用いた視覚化し、ことができます TUNEL 陽性細胞と呼ばれます。

今では基本的な原則と TUNEL 法の背後にある概念を理解すると、組織のセクションでこの手法を実行するための一般的なプロトコルを紹介しましょう。固定金利、TUNEL 試薬、TUNEL 反応と最後に、解析を停止を追加して、組織の透過の組織 TUNEL 法の主要な手順が含まれます。

まず、興味の組織は生物学的構造を維持するために固定する必要があります。固定は、架橋タンパク質細胞内で動作します。Tunel、組織を 4 ° C で 4-24 時間 4% パラホルムアルデヒドを含むソリューションに追加することで解決できます。固定、cryosection 10 μ m 以下の薄いスライスに組織。

次のステップは透過は、TdT 酵素など試薬細胞核を貫通することができます。ティッシュ セクションの透過は 37 ° C で 5-15 分のプロティナーゼ K ソリューションに組織を追加することによって行うことが室温で 15-30 分間軌道シェーカーのリン酸緩衝生理食塩水で切片をすすいでください。

次の透過、TdT 酵素と蛍光に分類された dUTPs は、TUNEL 反応の補酵素として機能するコバルトを含むラベル バッファーと共に、ティッシュ セクションに追加されます。一緒に、TUNEL 反応混合物とティッシュ セクション 37 ° C、1-3 時間インキュベート、フェージングから蛍光を防ぐために光から保護します。

次の孵化、停止バッファーが TUNEL 反応を停止するティッシュ セクションに追加され短い潜伏後のセクションに洗われて、リン酸緩衝生理食塩水。最後に、蛍光顕微鏡を使用して、特定の組織内の TUNEL 陽性細胞の局在の評価は組織切片を蛍光タグ dUTP を使用して染色、可視化します。1 つは、単に与えられた組織切片における TUNEL 陽性細胞の割合を数えることによって細胞死を定量化できます。

アポトーシス細胞を検出する tunel を実行する方法を見てきた、この試金を使用して、細胞生物学者からの質問に対処する方法を見ていきましょう。

細胞死は不要な細胞の除去のための組織と構造、彫刻の開発の正常な部分として発生します。したがって、科学者研究に興味がこの現象アポトーシスに及ぼすさまざまな物質への出生前暴露開発中。ここでは、科学者たちは脳の発達に及ぼす出生前アルコール露出を調べることに興味があります。TUNEL 染色の結果は、胎児脳対照動物と比較してアルコールに曝露された組織で明らかに増加したアポトーシスに対して実行されます。

科学者は、細菌感染への応答でアポトーシスを調査するのに、tunel を使用するもできます。この実験では、科学者たちは、緑膿菌、肺の炎症を誘発するとマウスを注入することにより肺炎のモデルを開発しました。肺組織が摘出し、細菌感染への応答でアポトーシスを調べる TUNEL 染色を行った。結果は、細胞のアポトーシスが対照群と比較して、細菌に暴露したマウスの増加を示します。

最後に、TUNEL 染色使用できますひと腫瘍サンプルの薬に対する腫瘍の反応性を決定するために。この例では腫瘍のサンプルは人間の患者から収穫され体外培養します。次に、前臨床試験薬で治療され、TUNEL 法による応答を評価しました。得られたデータは、熱ショックタンパク質 90 を大幅抑制薬による治療が腫瘍組織のアポトーシスを増加を示します。

アポトーシス細胞を検出する、tunel を使用してゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオは、TUNEL 染色、し手順プロトコル ティッシュ セクションで、tunel を実行するの背後にある原理を検討しました。このメソッド開発と病気の間にプログラムされた細胞死を理解する適用する方法も確認しました。いつも見てくれてありがとう!

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