Summary
ヨナのカニの口胃神経系（STNS）（
Abstract
それはよく特徴付けされているセルの数が比較的少ない（約25℃のborealisの）が含まれているため、口と胃の神経節（STG）は、携帯電話とネットワークの相互作用を研究するための優れたモデルです。 STGのセルは、出力の広い範囲を示し、胃の運動行動する責任があります。胃は3つの内歯と食べ物、そしてそれが中腸に到達する前に食べ物をフィルタリングする幽門を分解する胃工場が含まれています。 STGは、胃の工場と中枢パターン発生器（CPGは）として知られている幽門を制御する2つのリズミカルな出力を生成します。 STG内の各セルは、これらのリズムのいずれかまたは両方に参加することができます。これらのCPGはは、神経調節の研究、恒常性、携帯電話とネットワークの可変性、ネットワークの開発、およびネットワークの復旧を可能にする。
グロスと細かい解剖、ヨナのカニ（ がんのborealis）から口胃神経系の解剖（STNSは）2つの部分に分けて行われます。総解剖では胃全体はカニから解剖される。細かい解剖中にSTNSは、解剖顕微鏡と顕微解剖ツール（図1参照）を使用して胃から抽出されます。 STNSはSTG、食道神経節（OG）、および交連神経節（COG）と同様に胃の筋肉を支配する神経が含まれています。ここで、我々は細胞外記録用に使用されるSTGの細胞は細胞内および末梢神経から記録される電気生理学的実験の準備のためSTNSの完全な解剖を実行する方法を示します。目的の神経を見つけるための適切な手法がsomaの複数形と神経網を明らかにするために神経節をdesheathingの私たちの手法としてだけでなく、示されています。
Protocol
1。総解剖
- 動物の鈍い感覚と運動システムへの30分間氷上でカニを置きます。氷と一緒にすべての側面にそれを囲む。カニを取り扱う際には手袋を着用してください。
- 解剖のパンと、使用するツールをレイアウトすることで総解剖の準備。 Rongeurs、骨切りはさみ、小さなはさみ、歯鉗子、テーパーエッジとヘラ、ブラックSylgard -コーティングディッシュ、そして虫ピンが必要です。
- ピンチからそれを防止し、解剖のパンに配置すると後肢による氷のバケツからカニを削除します。
- それぞれが内側にねじれて最初の爪を外します。その後、同じねじれ運動を使用して、各脚を取り外します。
- rongeursを使用して、口を覆う上顎を削除します。また、ソフトmaxilluleを削除します。
- 再びrongeursを使用して、甲の外側後端から開始し、それの端に正しい握り方をする。 rongeursで取り締まると甲羅のその部分を折る。ヘラは、開口部を入力できるように十分な甲羅のを削除してください。反対側の目とリピートして甲羅の端まで削除を続けます。
- ヘラのテーパーのサイドで、静かに背甲の屋根から柔らかい内側の組織を削る。 STNSの損傷を防ぐために、甲羅に接触してへらをしてください。組織から分離されている甲の部分を脱却するためrongeursを使用してください。また、甲羅に組織を接続する任意の内転筋を分離するために確実に腹甲羅から軟組織の一部を分離。
- 甲羅から突き出ている二つの小さな耳小骨があると、心臓と同じくらい遠く後部背甲を離れて壊す。可能な限り前方にカット。背甲の最も前方の部分を脱却しながら、指一本でセファロンを（"顔"）安定化させる。
- 甲羅の腹側では、それらに接続された口上突起から下顎を取り除くために、外側にねじれ、そしてそれを引いて、下顎にrongeursを固定して、一度に顎を引き抜く。適切に行われれば筋肉を持つ二つの長い耳小骨は、抽出された下顎骨に接続する必要があります。
- ヘラを使って目の近くセファロンの側面から組織を離れて区切ります。層によって可能層として小骨の尾根に近いとして組織横断小さな解剖鋏、と。
- 解剖のパンの壁にカニを置き、（爪がこのために使用される）場所に固定し、それを支える。接続された任意の組織を残さないことを確実に離れて口上突起から唇を（"上唇"）カット。骨切りはさみを使用すると、Cephalon社を削除するには、腹甲に2つの斜めカットを行います。
- 歯鉗子で唇を取ると離れて腹側の小骨から唇を（"下唇"）カット。その後、静かに残りの腹甲から唇を持ち上げます。甲羅の内側を覆う組織から胃の腹側部分を分離するために小型のはさみを使用してください。胃がカニから抽出されるまで、幽門膨大部が表示されている場合、その両側に離れて組織から胃を切る。
- それでも手のひらに対して胃を休ませ、口の中に生理食塩水注ぎ、鉗子で唇が胃を開催。これは、胃を拡大し、それが簡単に開いてカットできるようになります。ダウン膨大部の間に小骨を介して幽門右の間に口の開口部からカット。次に2つの噴門枝を通して斜めに削減。胃の内側に3本の歯の先端を切り取ります。
- ダウン胃の内側にある大規模な、黒、Sylgardコーティングした皿に胃を置きます。昆虫ピンと準備のファイブコーナーを突き止めると（図1参照）全体の準備を浸漬し、冷生理食塩水で皿を埋める。
2。細かい解剖
- 、マイクロダイセクションのツールは、微細な解剖のために必要とされる。特に、鉗子と春のはさみは、タングステン針とピンホルダーとしてだけでなく、必要とされる。明確な、Sylgardコーティングした、ペトリ皿およびいくつかの細かい線のピンも用意されている必要があります。
- 最も低い倍率で始まる、口の開口部に使用される唇の近くにフラップを下に固定することによって開始します。準備をピンと張るようにし、必要な他の領域を固定するピンの残りの部分を並べ替えます。
- 慎重に準備の下の部分をカバーする斑点皮下組織を持ち上げ、つの白いドットで皮下組織のパッチを残して全体にトリミング。
- 準備の下部にある黄色の、かすかな、膜組織アップピール。 mvnsが弱く、この組織の下側に取り付けられている。それがプルアップされているように慎重に黄色の組織からmvnsを分離。黄色の組織をフォローアップし、脳と一緒にカット。
- 脳から出る太いプロセスに従うことを拡張laterallY.これらはcommisural神経です。交連神経の端に到達すると、離れて脳の側から切断されているスポンジ状、オフホワイトの組織の塊を取り除く。
- イオンと息子はコグを満たす場合には、 イオンと息子の長さを明らかにするために筋肉や組織を切り取る。
- 斑点のある皮下組織のパッチに戻り、それを遮断。これはSTGを取り巻く動脈に開口部を残してください。脇腹STGを、2つの筋肉を分離するために開口部を介してカット。これらの筋肉の端を持ち上げて、動脈からそれらを分離し、alnsと活動銀河核を露出させるそれらの下に右に切る。 STN上の嘘軟骨限り、最大隣接筋肉を区切ります。
- 、どこmvns、DGNにSTGをダウン周囲動脈組織を切り取る とDVNは満たしています。 lvnsにDVNをダウン動作とlvnsをカバーする白く、繊細な組織をカット。
- 準備の下部近くにある小骨を介してPSNを見つけます。 PSNはLVNとdlvn接合を見つけるために使用することができます。
- 次pynとPDNを見つけるためにdlvnをダウンに従ってください。 pynは多くの場合開口部に幽門膨大部を介してラップします。 PDNはdlvnのフォークオフと幽門膨大部と有酸素運動幽門弁の筋肉の間です。準備が明確なSylgard皿に転送されるとき、それらが容易に混同される可能性があるので、これらの神経の1つに接続いくつかの筋肉を残す。
- 一度にすべての神経のが発見されている、STNSと組織と胃の不必要な神経の間の任意の残りの接続を切断する。慎重にミスの接続を切断する、離れて胃の残りの部分からSTNSを移動する。
- 条件Sylgardは、もはやあまりにも粘着や乾いた感じなくなるまでSylgardの表面の上にこすることによって胃の組織の残りの質量を持つ明確なSylgard皿。 Sylgardは疎水性であり、Sylgardコーティングしたディッシュがこのように条件付けされていない場合STNSはそれに強く付着する。
- 皿にいくつかの冷生理食塩水を追加。鉗子による交連神経の上端をつかんで、明確なSylgard皿にSTNSをもたらす。
- SylgardにSTNSを突き止める。交連神経から脳を切断し、ダウン第一コグの4つの両端を固定するminutenピンを使用してください。準備はIVNが離れてSylgardから上を指していることを確認することにより右側アップしていることを確認してください。 STGは、右サイドアップのときにDGNは STGの下にわずかに終了する必要があります。神経の残りのピンは細いワイヤーピンを下に終わります。
- STNSから残りの筋肉や組織を離れて清掃してください。
- Desheathピンホルダーとわずかに引っ掛け、罰金、タングステン針を使用してSTGを。離れて細胞体からSTGシースの隅に小さな穴を確認し、シースの層の間に取得するにはその穴を使用してください。慎重にSTG神経網と細胞体を公開する分離されたシースのフラップをカット。
- 細胞体へのアクセシビリティを高めるために、細胞内記録用STGを安定させるためにシースのいずれかのフラップを突き止める。各神経が張りつめているとよく細胞外記録法（図3参照）のために間隔をあけていることを確認STNSの残りを再固定します。
3。結果
- 理想的には、神経のすべては、特に切り傷や損傷、から記録されるものの自由でなければなりません。神経のどれが絡まっていないかのように改謬されてください。 STGは、神経網の周りひげの形成に配置された細胞のすべてで無傷でなければなりません。無傷STNSは左右対称であり、 脚 、腕や頭などの前端としてmvnsとしてlvnsとホムンクルスのように見えます。
略語：
| STNS | 口と胃の神経系 |
| STG | 口と胃の神経節 |
| COG | 交連神経節 |
| OG | 食道神経節 |
| MVN | 中央値心室神経 |
| イオン | 劣って食道神経 |
| 息子 | 優れた食道神経 |
| AGN | 前方胃神経 |
| AlNの | 前方外側神経 |
| DGN | 背側胃神経 |
| DVN | 背心室神経 |
| LVN | 外側心室神経 |
| PSN | 後部胃神経 |
| pyn | 幽門神経 |
| PDN | 幽門拡張器の神経 |
| dlvn | 外側心室神経の背枝 |
| IVN | 劣った心室神経 |
図1：解剖する前に胃のSTNSのおおよその配置を示す図。
図2：ライトグリーンの胃とSTNSのオーバーレイの下の部分に様々な筋肉の図。 STG内の各セルのタイプ、それらが支配することが知られている筋肉を使って表示されています。特定のセル（ナディムラボの礼儀）からの信号を運ぶ神経を解剖するために計画する際にこのマップが便利です。
図3：細胞内電極と細胞外の井戸（マーダーとブッチャー、2007年から）とSTNSの模式図。
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Discussion
STNS郭清は、電気生理学や免疫組織化学の実験を行う際に、または細胞培養用細胞を得るための第一歩です。に関係なく、意図した実験の、総解剖は変更されません。しかし、微細な解剖は異なる場合があります。先にあなたから録音する細胞とその神経の時間の計画を立てることが重要です。 STGのほとんどのニューロンは、胃内の少なくとも1つの筋肉を支配するプロセスを持っている（図2参照）とそれらの神経支配をターゲットに分類しております。従って、細胞外記録は完全に細胞内で録音されているセルの身元を確認する必要があります。幽門リズムの周波数と堅牢性は、準備の状態を監視するために使用されます。したがって、多くの実験はLVNから細胞外記録が含まれています。 DGNは、一般的に胃のリズムを監視するために使用されます。そこに多くの調節性細胞がSTNSの前端にあり、その神経を切断すると、幽門と胃のリズムが不規則に停止するかになる可能性があるため、STNは多くの場合、ほとんどの実験に不可欠です。
細かい解剖の手順が実行される順序は重要でなくても、STGは周囲から切断された後まで、我々はそれが簡単に筋肉に固定、末梢神経の両端を保つことによって損傷することなくSTNSを削除するには見つける組織。これにより、安全かつ容易に筋肉とそれを周囲の組織を除去するのに十分なSTGとSTNをピンと張る保つ。
準備が明確なSylgard皿になると、STNSに残っているすべての組織は、実験中に、電極との干渉を避けるために削除する必要があります。それは準備が神経に損傷を与えずに、できるだけピンと張ったとしてダウン固定されているときに良い、安定した記録を取得することも容易です。それは、STGはできるだけ多くの細胞の細胞内電極のアクセスを提供するために短いピンでalnsで安全にピンダウンすることが特に重要です。それは、それらの神経がレコーディングのために必要とされていない場合でも、STGに由来神経のいずれかの少なくとも一部を解剖するのが好ましい。彼らはさらに、皿にSTGを安定させる余分なアンカーを提供することができます。最大限の支援のためにそれらはかなり短くするのが最善です。
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Acknowledgments
我々は感謝マーダーラボのメンバーを認識する。私たちは、彼女の支援と激励のために、私達の顧問、博士イヴマーダーに感謝。この研究は、国立神経疾患研究所およびストローク助成NS - 17813とNS - 058110によってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
