Summary
요나 크랩의 stomatogastric 신경계 (STNS) (
Abstract
그것이 잘 특징 세포의 비교적 적은 수의 (약 25 C. 보레알리스)를 포함하고 있기 때문에 stomatogastric 신경절 (STG)는 휴대 전화 및 네트워크 상호 작용을 공부를위한 훌륭한 모델입니다. STG의 세포는 출력의 광범위한 전시와 복부의 모터 동작에 대한 책임이 있습니다. 위 세 가지 내부 치아와 음식, 그리고 midgut에 도달하기 전에 음식을 필터 pylorus를 나누기 위의 밀 포함되어 있습니다. STG는 위장 공장 및 중앙 패턴 발생기 (CPGs)로 알려진 pylorus를 제어하는 두 리듬 출력을 생산하고 있습니다. STG의 각 세포는 이러한 리듬 중 하나 또는 둘 모두에 참여할 수 있습니다. 이러한 CPGs는 neuromodulation의 연구, 항상성, 휴대 전화 및 네트워크 다양성, 네트워크 개발 및 네트워크 복구를 위해 수 있습니다.
요나 크랩 (암 보레알리스)에서 stomatogastric 신경계 (STNS)의 절개는 두 부분으로 이루어집니다, 총 훌륭한 절개를. 총 해부에서 전체 복부는 게에서 해부하는 것입니다. 미세 절개 동안 STNS은 해부 현미경과 미세 해부 도구를 (그림 1 참조)를 사용하여 위장에서 추출됩니다. STNS는 STG, oesophageal 신경절 (OG), 그리고 commissural 신경 (COG)뿐만 아니라 복부 근육을 신경을 분포시키다 신경을 포함합니다. 여기, 우리는 세포 레코딩에 사용 될 STG의 세포가 intracellularly와 주변 신경에서 녹화한 것입 전기 생리학 실험 준비 STNS의 전체 절개를 수행하는 방법을 보여줍니다. 원하는 신경을 찾기위한 적절한 기술은 somata와 neuropil을 나타내기 위해 신경을 desheathing 우리의 기술뿐만 아니라 표시됩니다.
Protocol
1. 총 해부
- 동물의 무딘 감각과 모터 시스템에 30 분간 얼음에 게 놓으십시오. 얼음 사방에 포위하라. 게를 다룰 때 장갑을 착용하여야한다.
- 해부의 팬 및 사용 도구를 밖으로 누워하여 총 해부 준비. Rongeurs는 뼈가 절단 가위, 작은 가위, 톱니 포셉, 테이퍼 에지있는 주걱, 검은 Sylgard - 코팅 요리, 그리고 곤충 핀이 필요합니다.
- 곤란 않도록하고 해부 냄비에 배치하기 위해 뒷다리 다리로 얼음 양동이에서 게를 제거합니다.
- 안으로 각 하나를 복잡하게 먼저 발톱을 제거합니다. 그런 다음 동일한 비틀 모션을 사용하여 각 다리를 제거합니다.
- rongeurs 사용하여 입을 덮고있는 maxilla를 제거합니다. 또한 부드러운 maxillule를 제거합니다.
- rongeurs를 사용하면 다시 등딱지의 측면 후부 월말부터 시작하고 그것의 가장자리에 좋은 입씨름을. rongeurs로 다운 클램프와 등딱지의 일부를 끊다. 주걱가 시작을 입력할 수 있도록 충분히 등딱지의를 제거했는지 확인하십시오. 눈 등딱지 가장자리를 제거 계속 반대쪽에 반복합니다.
- 주걱의 테이퍼 측면으로 부드럽게 등의 등딱지의 지붕에서 떨어져 부드러운 내부 조직을 다쳤어요. STNS 손상을 방지하기 위해 등딱지 접촉에 주걱 보관하십시오. 조직에서 분리되었습니다 등딱지의 일부를 떨어져 부수 rongeurs을 사용합니다. 또한 등딱지에 조직을 연결하는 내전근 근육을 분리해야하는 복부 등딱지에서 부드러운 조직의 일부를 별도의.
- 등딱지에서 튀어나온 두 개의 작은방이 ossicles가 심장까지 후부로 등의 등딱지 멀리 떨어져. 멀리 앞쪽에 가능한 컷. 등의 등딱지의 가장 앞쪽에 부품을 떠나 어길 때 한 손가락으로 cephalon을 (이하 "얼굴") 안정화.
- 등딱지의 복부 측면에서 그들에게 부착 epistome에서 mandible을 이동시키다하는 바깥쪽을 왜곡하고, 그것을 돌아서, mandible에 rongeurs를 고정하여 한 번에 mandibles 하나를 빼낸다. 정상적으로 완료하면 근육을 가진 두 개의 긴 ossicles가 추출 mandible에 첨부해야합니다.
- 주걱을 사용하여 눈을 근처 cephalon의 측면에서 조직을 멀리 분리합니다. 계층에 의해 가능한 레이어로 소골편의 능선에 가까운 조직을 가로질러 작은 절개 가위와.
- 해부의 냄비의 벽에 게를 휴식과 (발톱이에 사용할 수 있습니다) 장소에 고정 그것을 소품. 멀리 어느 조직이 첨부된 떠나지 않도록하는 epistome에서 labrum (이하 "윗입술") 잘라. 뼈가 절단 가위를 사용하면 cephalon를 제거하는 복부 등딱지 두개의 대각선 인하합니다.
- 톱니 포셉로 labrum를 타고 거리에 복부 측면에있는 소골편에서 labium (이하 "아랫입술") 했네요. 그런 다음 부드럽게 남아있는 복부 등딱지 떨어져 입술을 리프트. 등딱지를 안감 조직에서 복부의 복부 부분을 분리하는 작은 가위를 사용합니다. 위는 게에서 추출한 때까지 pyloric ampullae 볼 때, 멀리 그것의 양쪽에있는 조직에서 배를 잘라.
- 아직 손바닥에 대한 배를 휴식과 입안에 부어 호수, 포셉있는 입술로 배를 들고. 이것은 위장을 확대하고 쉽게 갈라 수 있습니다. 아래 ampullae 사이의 소골편 통해 pylorus 오른쪽 사이의 입을에서 열 컷. 그런 다음 두 가지를 통해 cardial 대각선 아래로 했네요. 안쪽 위 세 치아의 끝을 잘라.
- 아래 복부의 내부와 대형, 검정, Sylgard - 코팅 접시에 배를를 놓습니다. 곤충 핀으로 준비 다섯 모서리를 핀과 (그림 1 참조) 전체 준비를 immersing, 차가운 식염수에 접시를 입력합니다.
2. 파인 해부
- , 미세 해부 도구는 미세 절개를 위해 필요합니다. 특히, 포셉 및 봄 가위는 텅스텐 바늘로 핀 홀더뿐만 아니라 필요합니다. 분명 Sylgard - 코팅, 배양 접시 및 일부 미세 와이어 핀도 준비되어 있어야합니다.
- 가장 낮은 배율에서 시작, 입 열어야하는 데 사용되는 입술 근처에 펄럭를 달아하여 시작합니다. 준비가 긴장하고 필요한 다른 영역에 핀으로 핀의 나머지 부분을 재배열.
- 조심스럽게 준비의 하단 부분을 덮고있는 발견 hypodermis를 들고 두 흰색 점들과 hypodermis의 패치를 떠나 전체를 잘라.
- 준비의 하단에있는 노란색, 작게 묶은, 막의 조직까지 필. mvns은 약하게이 조직의 아래쪽에 첨부됩니다. 그것이 뽑아므로 조심스럽게 노란색 조직에서 mvns를 구분한다. 노란색 조직을 따라 뇌 함께 했네요.
- 머리를 종료 두꺼운 프로세스를 따라 그 연장 laterallY. 이들은 commisural 신경입니다. commissural 신경의 끝에 도달하면, 거리에 두뇌의 측면에서 절단되어 해면, 오프 화이트 조직의 덩어리를 제거합니다.
- 이온와 아들이 톱니바퀴를 충족 어디, 이온와 아들의 길이를 나타내기 위해 근육과 조직을 버려야.
- 스파 티드 hypodermis 패치로 돌아가기 그것을 잘라. 이것은 STG 주변 동맥의 개통을두고해야합니다. 두 근육되는 측면 STG을 분리하기 위해 개방을 통해 잘라요. 이러한 근육의 끝부분을 들어 그들 동맥에서 분리하고 alns 및 agns을 폭로하기 위해 아래의 오른쪽 컷. 역 흩어져 연골처럼 멀리까지 측면 근육을 분리합니다.
- 어디 mvns, dgn에 STG를 둘러싼 동맥 조직을 떼어 버리기, 그리고 DVN 만나. lvns에 DVN을 작업하고 lvns를 덮고 약간 흰, 섬세한 조직을 통해 했네요.
- 준비 하단 소골편 통해 PSN을 찾습니다. PSN은 lvn 및 dlvn 접합을 찾습니다하는 데 사용할 수 있습니다.
- 다음 pyn 및 pdn를 찾습니다 dlvn을 따르십시오. pyn는 종종 오프닝 pyloric ampulla 이상 래핑합니다. pdn은 dlvn의 포크에서와 pyloric ampulla과 심장 pyloric 밸브 근육 사이에 있습니다. 준비가 맑은 Sylgard 요리로 전송되었을 때 그들이 쉽게 혼동 수 있기 때문에 이러한 신경 중 하나에 연결된 근육 둡니다.
- 일단 신경의 모든 STNS과 위장의 조직과 불필요한 신경 사이에 남아있는 연결이 끊어 밝혀왔다. 조심스럽게 모든 놓친 연결을 절단, 거리 위의 나머지 부분에서 STNS 이동합니다.
- Sylgard 더 이상 너무 끈적 거리거나 건조한 느낌이 없을 때까지 Sylgard의 표면 위에 바르고하여 위 조직의 나머지 질량과 맑은 Sylgard 요리 상태. Sylgard은 소수성이고 Sylgard - 코팅 요리이 방식으로 에어컨하지 않은 경우 STNS 그것을 적극 준수합니다.
- 접시 일부 차가운 호수를 추가합니다. 포셉와 commissural 신경의 위쪽 끝을 잡고 맑은 Sylgard 요리에 STNS 가져.
- Sylgard에 STNS을 핀. commissural 신경에서 두뇌 세버 아래 먼저 톱니바퀴의 네 끝을 보호를 위해 minuten 핀을 사용합니다. 준비가 ivn 떠나 Sylgard부터 가리키는 것을 선택하여 오른쪽까지 있는지 확인하십시오. STG는 오른쪽까지 때 dgn는 STG 아래 약간 종료해야합니다. 신경의 나머지 부분을 핀 미세 철사 핀과 함께 아래로 끝납니다.
- STNS에서 남아있는 근육이나 조직을 멀리 청소하십시오.
- Desheath 핀 홀더와 약간 중독, 괜찮아요, 텅스텐 바늘을 사용하여 STG합니다. 멀리 세포 기관에서 STG 칼집의 모서리에 작은 구멍을 만들어 칼집의 레이어 사이에 접근하기 위해 구멍을 사용합니다. 조심스럽게 STG neuropil와 세포 기관을 폭로 분리된 껍질을 떼어 잘라.
- 세포 기관에 접근을 증가하고 세포 레코딩을위한 STG 안정화를 아래로 껍질의 펄럭 핀. 각 신경 긴장 늦추지하고 잘 세포외 기록 (그림 3 참조) 간격 있도록 STNS의 나머지 부분을 다시 핀.
3. 검색 결과
- 이상적으로, 신경의, 특히 깨진 손상에서 기록되는 것들 무료로해야합니다. 신경의 어느 것도 리게하거나 트위스트해야합니다. STG는 neuropil 주위에 수염 형성에 배열 세포의 모두 손상됩니다. 그대로 STNS는 양자 대칭이고 다리, 팔, 머리로 앞쪽에 엔드로 mvns로 lvns와 homunculus 같다.
약어 :
| STNS | Stomatogastric 신경계 |
| STG | Stomatogastric 신경절 |
| 코그 | Commissural 신경절 |
| OG | Oesophageal 신경절 |
| mvn | 미디언 심실 신경 |
| 이온 | 열등 oesophageal 신경 |
| 아들 | 우수한 oesophageal 신경 |
| agn | 앞쪽에 위의 신경 |
| ALN | 앞쪽에 측면 신경 |
| dgn | 도설 위의 신경 |
| DVN | 도설 심실 신경 |
| lvn | 측면 심실 신경 |
| PSN | 후부 위 신경 |
| pyn | Pyloric 신경 |
| pdn | Pyloric 확장시키는 신경 |
| dlvn | 측면 심실 신경의 도설 지점 |
| ivn | 열등 심실 신경 |
그림 1 : 해부하기 전에 복부에 STNS의 대략적인 위치를 설명하는 다이어그램.
그림 2 : 밝은 녹색의 위장과 STNS의 오버레이의 하단 부분에 다양한 근육의 다이어그램. STG의 각 세포 유형은 그들이 신경을 분포시키다하는 것으로 알려져있는 근육과 함께 나열됩니다. 주어진 셀 (Nadim 연구실의 호의)에서 신호를 전달 신경을 해부하다 계획 때이지도는 유용합니다.
그림 3 : 세포내 전극과 세포외 우물 (Marder과 부처, 2007)로 STNS의 도식 다이어그램.
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Discussion
STNS의 해부는 전기 생리학 또는 immunohistochemistry 실험, 또는 세포 배양을위한 세포를 얻기위한 수행의 첫 단계입니다. 상관없이 의도 실험, 총 해부는 변경되지 않습니다. 그러나, 미세 절개가 다를 수 있습니다. 앞으로도에서 기록 세포와 신경 어느 시간 계획하는 것이 중요합니다. STG 대부분의 뉴런은 복부에있는 하나 이상의 근육 신경을 분포시키다 (그림 2 참조)하고 innervated 대상에 따라 분류되어 프로세스가 있습니다. 따라서, 세포외 음반 완전히 intracellularly 기록되고 세포의 신원을 확인하기 위해 필요합니다. pyloric 리듬의 주파수와 견고은 준비의 건강을 모니터링하는 데 사용됩니다. 따라서, 많은 실험 lvn에서 세포외 기록을 포함합니다. dgn은 일반적으로 위장 리듬을 모니터링하는 데 사용됩니다. 거기에 많은 modulatory 세포가 STNS의 앞쪽에 결국에는하고 신경을 severing하면 pyloric과 위장 리듬이 불규칙를 중지하거나이 될 발생할 수 있기 때문에 역은 종종 대부분의 실험을하는 데있어 매우 중요합니다.
미세 절개의 단계가 완료되는 순서는 중요하지 않다하더라도 STG가 주변에서 연결이 끊어졌습니다 때까지, 우리는 쉽게 근육에 고정 주변 신경의 끝을 유지하여 손상없이 STNS를 제거 찾기 조직. 이것은 안전하고 쉽게 근육과 그것을 둘러싼 조직을 제거하는 STG와 역 긴장 늦추지 충분히 유지합니다.
준비가 맑은 Sylgard 요리에되면, STNS에 남아있는 모든 조직은 실험 기간 동안 전극과의 간섭을 피하기 위해 제거되어야합니다. 그것은 준비가 신경에 손상을 유발하지 않고 가능한 긴장으로 넘어뜨린 때 좋은 안정적인 레코딩을하는 것도 쉽습니다. 그것은 STG가 가능한 많은 세포로 세포 내 전극 액세스를 제공하기 위해 짧은 핀이있는 alns에 의해 안전 넘어뜨린 것이 특히 중요합니다. 그것은 그 신경이 레코딩에 필요하지 않더라도 STG에서 발생한 신경의 적어도 부분을 절개하다 것이 바람직합니다. 그들은 더욱 접시에 STG를 안정화 추가 앵커를 제공할 수 있습니다. 최대 지원을위한 그들이 매우 짧게 유지하는 것이 가장 좋습니다.
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Acknowledgments
우리는 기꺼이 Marder 연구실의 구성원을 인정합니다. 우리는 그녀의 지원과 격려를위한 고문, 박사 이브 Marder을 감사합니다. 이 연구는 국립 신경 장애 뇌졸중 연구소 보조금 NS - 17813 및 NS - 058110에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
