Summary
Il sistema nervoso stomatogastric (STNS) del granchio Giona (
Abstract
Il ganglio stomatogastric (STG) è un modello eccellente per studiare le interazioni cellulari e di rete, perché contiene un numero relativamente piccolo di cellule (circa 25 in C. borealis) che sono ben caratterizzati. Le cellule del STG mostra una vasta gamma di uscite e sono responsabili delle azioni motorie dello stomaco. Lo stomaco contiene il mulino gastrico che scompone il cibo con tre denti interni, e il piloro che filtra il cibo prima che raggiunga il midgut. La STG produce due uscite ritmica per controllare il mulino gastrica e piloro conosciuto come generatori di pattern centrali (CPG). Ogni cella della STG possono partecipare a uno o entrambi questi ritmi. Queste CPGs permettono per lo studio della neuromodulazione, omeostasi, la variabilità cellulare e di rete, sviluppo della rete, e il recupero della rete.
La dissezione del sistema nervoso stomatogastric (STNS) dal granchio Giona (Cancer borealis) è fatto in due parti: la dissezione lordo e fine. Nella dissezione lordo stomaco intero sezionato dal granchio. Durante la dissezione bene il STNS viene estratto dallo stomaco utilizzando un microscopio dissezione e micro-dissezione strumenti (vedi figura 1). Il STNS comprende la STG, il ganglio esofageo (OG), ed i gangli commissurali (COG) così come i nervi che innervano i muscoli dello stomaco. Qui mostriamo come eseguire una dissezione completa del STNS in preparazione per un esperimento di elettrofisiologia in cui le cellule del STG sarebbe registrato da cellule ed i nervi periferici sarebbe stato utilizzato per le registrazioni extracellulari. La tecnica corretta per trovare i nervi desiderata è mostrata così come la nostra tecnica di desheathing ganglio di rivelare la somata e neuropilo.
Protocol
1. Dissezione lordo
- Posizionare un granchio in ghiaccio per 30 minuti opachi i sistemi sensoriali e motorie dell'animale. Lo circondano su tutti i lati con ghiaccio. I guanti dovrebbero essere indossati quando si maneggia il granchio.
- Preparati per la dissezione lordo ponendo la pentola dissezione e gli strumenti si intende utilizzare. Rongeurs, osso taglio forbici, forbicine, pinzette dentate, una spatola con un bordo affusolato, un nero Sylgard rivestita piatto, e perni insetti sono necessari.
- Rimuovere il granchio dal secchiello del ghiaccio per la sua zampa posteriore per evitare che pizzicotti e metterla nella padella dissezione.
- Rimuovere gli artigli prima ruotando verso l'interno di ogni uno. Quindi rimuovere ogni gamba con lo stesso movimento torsione.
- Utilizzando il Rongeurs, rimuovere la mascella che copre la bocca. Rimuovere anche il maxillule morbido.
- Utilizzando il Rongeurs ancora una volta, partire dalla fine laterale posteriore del carapace e ottenere un buon grip sul bordo di esso. Reprimere con la Rongeurs e rompere quel pezzo di carapace off. Assicurarsi di aver tolto abbastanza del carapace per consentire la spatola di entrare l'apertura. Continuare a rimuovere il bordo del carapace fino agli occhi e ripetete dall'altro lato.
- Con la parte conica della spatola, raschiare delicatamente i tessuti molli interiore, lontani dal tetto del carapace dorsale. Tenere la spatola a contatto con il carapace per evitare di danneggiare il STNS. Utilizzare il Rongeurs di rompere le parti del carapace che sono stati separati dal tessuto. Anche separati alcuni dei tessuti molli dal carapace ventrale facendo attenzione a separare ogni muscoli adduttori attaccare il tessuto al carapace.
- Rompere la corazza dorsale fino posteriore come il cuore dove ci sono due piccoli ossicini che sporgono dal carapace. Tagliare il più anteriore possibile. Stabilizzare la Cephalon (il "volto") con un dito mentre rottura con la parte più anteriore del carapace dorsale.
- Sul lato ventrale del carapace, tirare fuori le mandibole uno alla volta grazie all'ancoraggio del Rongeurs su una mandibola, torsione verso l'esterno per rimuovere la mandibola dal epistome allegato, e tirandolo via. Due ossicini lungo con i muscoli devono essere allegati alla mandibola estratto se fatto correttamente.
- Separare via il tessuto dai lati della Cephalon vicino agli occhi con la spatola. Con le forbici dissezione piccolo, attraversano il tessuto più vicino al crinale di ossicino come strato dopo strato possibile.
- Resto il granchio contro un muro della padella dissezione e prop in su fissandolo in posizione (gli artigli possono essere utilizzate per questo). Taglio del labbro ("labbro superiore") dal epistome avendo cura di non lasciare qualsiasi tessuto allegato. Utilizzando ossa di taglio forbici fare due tagli diagonali nel carapace ventrale per rimuovere la Cephalon.
- Prendere il labbro con una pinza dentata e tagliare il labium ("labbro inferiore") dal ossicino sul lato ventrale. Poi sollevare delicatamente il labbro dal carapace ventrale rimanenti. Utilizzare le forbici piccolo per separare la parte ventrale dello stomaco dal tessuto di rivestimento del carapace. Quando le ampolle sono visibili piloro, tagliare lo stomaco lontano dal tessuto su entrambi i lati fino a quando lo stomaco è estratto dal granchio.
- Ancora in mano allo stomaco con il labbro con una pinza, il resto lo stomaco contro il palmo della mano e versare salina in bocca. Questo si espande lo stomaco e rende più facile da tagliare aperto. Tagliato dall'apertura alla foce giù tra il diritto piloro attraverso la ossicino tra le ampolle. Poi tagliare in diagonale verso il basso attraverso i due rami cardiale. Tagliare le punte delle tre denti all'interno dello stomaco.
- Posizionare lo stomaco su un grande, nero, Sylgard rivestite piatto con l'interno dello stomaco in giù. Definire con precisione i cinque angoli della preparazione con perni di insetti e riempire il piatto con soluzione fisiologica fredda, immergendo l'intera preparazione (vedi figura 1).
2. Dissezione multa
- , Micro-dissezione strumenti sono necessari per la dissezione fine. In particolare, pinze e forbici a molla sono necessarie così come un supporto pin con un ago di tungsteno. Un chiaro, Sylgard rivestita, capsula di Petri e di alcuni perni di filo sottile avrebbe dovuto essere preparato.
- A partire l'ingrandimento più basso, iniziare pinning giù i lembi vicino al labbro che ha usato essere l'apertura della bocca. Riorganizzare il resto dei perni per rendere la preparazione teso e pin altre aree necessarie.
- Sollevare con cautela il ipoderma notato che copre la parte inferiore della preparazione e tagliare di traverso lasciando una chiazza di ipoderma con due puntini bianchi.
- Sbucciate il giallo, esile, il tessuto membranoso vicino al fondo della preparazione. Il mvns sono debolmente attaccati alla parte inferiore di questo tessuto. Separare con attenzione il mvns dal tessuto giallo, come si è tirato su. Segui il tessuto giallo e tagliate a fianco del cervello.
- Seguire i processi di spessore uscire il cervello che si estendono laterally. Questi sono i nervi commisural. Una volta alla fine del nervo commissurali viene raggiunto, rimuovere la massa spugnosa, di colore biancastro tessuto che è stato tagliato via dal lato del cervello.
- Dove gli ioni e figli incontrare gli ingranaggi, tagliare via il muscolo e del tessuto di rivelare la lunghezza degli ioni e dei figli.
- Ritorna alla patch ipoderma macchiato e tagliarlo fuori. Questo dovrebbe lasciare un'apertura nel arteria che circonda la STG. Tagliare attraverso l'apertura di separare i due muscoli che fiancheggiano la STG. Sollevare l'estremità di questi muscoli e tagliare proprio sotto di loro per separarli dalla arteria e per esporre il alns e AGN. Separare i muscoli ai lati fino a che la cartilagine che avvolge il stn.
- Tagliare il tessuto arterioso che circonda la STG fino a dove il mvns, DGN, e DVN si incontrano. Lavoro lungo la DVN al lvns e tagliare il biancastro, delicato tessuto che copre il lvns.
- Individuare il PSN negli ossicino vicino al fondo della preparazione. Il PSN può essere utilizzato per individuare il LVN e giunzione dlvn.
- Avanti seguire le dlvn giù per individuare il pyn e PDN. Il pyn avvolge spesso sopra l'ampolla pilorica per l'apertura. La PDN forking del dlvn ed è tra i pilorica ampolla ed i muscoli della valvola pilorica cardio. Lascia qualche muscolo collegato a uno di questi nervi, perché possono essere facilmente confusi quando la preparazione viene trasferito il piatto chiaro Sylgard.
- Una volta che tutti i nervi sono stati scoperti, recidere le connessioni sussistenti tra le STNS ei nervi dei tessuti e indesiderati dello stomaco. Muovere con cautela il STNS lontano dal resto dello stomaco, tagliando tutte le connessioni perse.
- Condizione il piatto Sylgard chiaro con la massa restante del tessuto dello stomaco per lo sfregamento sulla superficie della Sylgard fino alla Sylgard non si sente più troppo appiccicoso o secco. Sylgard idrorepellente ed il STNS aderisce fortemente ad esso se la Sylgard rivestite piatto non è condizionato in questo modo.
- Aggiungete un po 'salina fredda per il piatto. Afferrare le estremità superiori dei nervi commissurali con una pinza e portare il STNS al piatto chiaro Sylgard.
- Perno del STNS verso il basso sulla Sylgard. Sever il cervello dai nervi commissurali e utilizzare i pin minuten per fissare le quattro estremità della Cogs primo down. Garantire che la preparazione sia dal lato giusto controllando che il IVN è rivolta verso l'alto dalla Sylgard. Il dgn dovrebbe uscire un po 'sotto la STG quando la STG è da destra verso l'alto. Pin il resto del nervo termina verso il basso con i perni di filo sottile.
- Pulire via qualsiasi residuo muscolare o tessuto dal STNS.
- Desheath la STG all'utilizzo di un supporto e un pin leggermente aquilino, fine, ago di tungsteno. Fai un piccolo foro in un angolo della guaina STG lontano dal corpo cellulare e utilizzare quel buco per arrivare tra gli strati della guaina. Accuratamente tagliato un lembo di guaina separati per esporre il neuropilo STG e corpi cellulari.
- Pin qualsiasi lembi della guaina giù per aumentare l'accessibilità ai corpi cellulari e di stabilizzare la STG per le registrazioni intracellulari. Re-pin il resto del STNS garantire che ogni nervo è teso e ben distanziati per la registrazione extracellulare (vedi figura 3).
3. Risultati
- Idealmente, tutti i nervi devono essere privi di ammaccature e danni, in particolare quelli che saranno registrate da. Nessuno dei nervi dovrebbe essere aggrovigliati o torto. La STG dovrebbe essere intatto con tutte le celle disposte in una formazione barba intorno al neuropilo. Il STNS intatta è simmetria bilaterale e assomiglia a un omuncolo con il lvns come le gambe, il mvns come le braccia e la fine anteriore come la testa.
Abbreviazioni:
| STNS | Stomatogastric sistema nervoso |
| STG | Ganglio Stomatogastric |
| CoG | Ganglio commissurali |
| OG | Ganglio esofageo |
| mvn | Ventricolare nervo mediano |
| ione | Esofageo inferiore del nervo |
| figlio | Superiore nervo esofageo |
| AGN | Anteriore del nervo gastrico |
| ALN | Anteriore del nervo laterale |
| dgn | Dorsale del nervo gastrico |
| DVN | Ventricolare nervo dorsale |
| LVN | Ventricolare nervo laterale |
| PSN | Stomaco nervo posteriore |
| pyn | Nervo pilorica |
| PDN | Dilatatore nervo pilorica |
| dlvn | Ramo dorsale del nervo del ventricolo laterale |
| IVN | Ventricolare nervo inferiore |
Figura 1: Diagramma che indica la posizione approssimativa del STNS nello stomaco prima di dissezione.
Figura 2: Schema dei vari muscoli nella parte inferiore dello stomaco e una sovrapposizione della STNS in verde chiaro. Ogni tipo di cellula del STG è elencato con i muscoli è nota la loro innervare. Questa mappa è utile quando si pianifica di sezionare un nervo che trasporta un segnale da una determinata cella (per gentile concessione del laboratorio Nadim).
Figura 3: Rappresentazione schematica del STNS con elettrodi intracellulari e pozzi extracellulare (da Marder e Bucher, 2007).
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Discussion
La dissezione STNS è il primo passo per l'esecuzione di un esperimento o di elettrofisiologia immunoistochimica, o per l'ottenimento di cellule per la coltura cellulare. Indipendentemente l'esperimento previsto, la dissezione lordo rimarrà invariato. Tuttavia, la dissezione multa può variare. E 'importante pianificare in anticipo del tempo che cellule e nervi che si registra da. La maggior parte dei neuroni nel STG sono processi che innervano almeno un muscolo nello stomaco (vedi figura 2) e sono classificati secondo il loro obiettivo innervate. Pertanto, le registrazioni extracellulari sono tenuti a verificare pienamente l'identità di una cella che si sta registrando intracellulare. Frequenza del ritmo piloro e robustezza sono usati per monitorare la salute del preparato. Pertanto, molti esperimenti sono registrazioni extracellulari dal LVN. Il DGN viene comunemente utilizzato per monitorare il ritmo gastrico. Il stn è spesso cruciale per maggior parte degli esperimenti, perché ci sono molte cellule modulatorio alla fine anteriore della STNS e recisione del nervo che può causare i ritmi piloro gastrico e di cessare o diventare irregolare.
Anche se l'ordine in cui vengono effettuati i passaggi della dissezione multa non è importante, noi troviamo più facile rimuovere il STNS senza danni, mantenendo le estremità dei nervi periferici ancorata al muscolo fino a dopo la STG è stato scollegato dalla circostante tessuti. Ciò mantiene il abbastanza teso e STG stn per rimuovere in modo sicuro e facilmente i muscoli ei tessuti che li circondano.
Una volta che la preparazione è nel piatto chiaro Sylgard, qualsiasi tessuto che rimane sul STNS deve essere rimosso per evitare la sua interferenza con gli elettrodi durante un esperimento. E 'anche più facile ottenere buoni, registrazioni stabile quando la preparazione è immobilizzato come teso come possibile senza causare danni ai nervi. E 'particolarmente importante che la STG essere immobilizzato in modo sicuro dal alns con perni stretti per fornire l'accesso intracellulare elettrodi per numero di celle possibile. È preferibile sezionare fuori almeno una parte di uno dei nervi che hanno origine dalla STG, anche se i nervi non sono necessari per la registrazione. Possono fornire ancoraggi supplementari ulteriormente stabilizzare la STG sul piatto. E 'meglio tenerli abbastanza breve per il massimo supporto.
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Acknowledgments
Noi riconosciamo con gratitudine i membri del Laboratorio Marder. Ringraziamo il nostro consulente, il dottor Eve Marder, per il suo sostegno e incoraggiamento. Questa ricerca è stata finanziata dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke Grants NS-NS-17.813 e 058.110.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
