Summary
Стоматогастральных нервной системы (ст.) из краба Иона (
Abstract
Стоматогастральных ганглии (STG) является прекрасной моделью для изучения клеточных и сетевые взаимодействия, поскольку она содержит относительно небольшое число клеток (примерно 25 в С. сияние), которые хорошо охарактеризованы. Клеток в STG выставке широкий спектр выходами и несут ответственность за двигательным действиям желудка. Желудок содержит желудочный мельница который расщепляет пищу с тремя внутренними зубами, и привратника, который фильтрует пищу, прежде чем попасть кишки. STG производит два ритмических выходов для управления желудочной мельницы и привратника известный как центральные генераторы шаблон (CPGs). Каждая ячейка в STG может принять участие в одном или обоих этих ритмов. Эти CPGs позволяют изучение нейромодуляции, гомеостаз, сотовой сети и изменчивость, развитие сети и сетевые восстановления.
Рассечение стоматогастральных нервной системы (ст.) из краба Иона (Рак сияние) осуществляется в два этапа; общей и мелкой рассечение. В валовом рассечение всей желудка рассекается из краба. Во время вскрытия штраф ст. извлекается из желудка с помощью микроскопа рассечение и микро-рассечение инструментов (см. рисунок 1). Ст. включает STG, пищевода ганглии (ОГ) и спаечный ганглиев (ЦТ), а также нервы, которые иннервируют мышцы живота. Здесь мы покажем, как выполнить полное рассечение ст. при подготовке эксперимента электрофизиологии, где клетки в STG будет записан с внутриклеточно и периферических нервов будет использоваться для внеклеточных записей. Правильную технику для поиска нужной нервы показано, а также наши техники desheathing ганглия выявить somata и нейропиля.
Protocol
1. Валовой Dissection
- Место краба на льду в течение 30 минут, чтобы притупить сенсорных и моторных систем животного. Его окружают со всех сторон льдом. Перчатки должны быть надеты при обработке краба.
- Подготовка к валовой вскрытия путем прокладки из кастрюли вскрытие и инструменты вы будете использовать. Rongeurs, косторезное ножницы, маленькие ножницы, зубчатые щипцы, лопаточки с коническим краем, черный Sylgard покрытием блюдо, и насекомое контакты необходимы.
- Удалить из краба ведерко со льдом за задние ноги, чтобы он не щипать и поместите ее в кастрюлю рассечение.
- Удаление когтей первых, повернув каждый внутрь. Затем удалите каждую ногу, используя тот же движения скручивания.
- Использование rongeurs, удалите покрытие верхней челюсти рта. Также удалите мягкой максиллы.
- Использование rongeurs еще раз, начните с боковых заднем конце панцирь и получить хорошее сцепление на краю его. Зажим вниз с rongeurs и сломать эту часть панциря прочь. Убедитесь в том, чтобы удалить достаточно панцирь, чтобы лопаточка, чтобы войти в отверстие. Продолжить удаление края панциря до глаза и повторите с другой стороны.
- С конической сторону шпателя, аккуратно очистить мягкой внутренней ткани от крыши спинной панцирь. Держите шпатель в контакте с панцирем, чтобы не повредить ст.. Используйте rongeurs оторваться части панциря, которые были отделены от ткани. Также отдельные некоторые из мягкой ткани из брюшной панцирь убедившись, что для любого отдельного приводящие мышцы крепления ткани к панциря.
- Оторваться спинной панцирь, насколько задних как сердце, где Есть два небольших косточек торчащий из панциря. Вырезать до передней насколько это возможно. Стабилизировать головы («лицо») с одним пальцем в то время как отрыв самой передней части спинной панцирь.
- На брюшной стороне панциря, вытащить челюсти по одному за раз, привязывая rongeurs на нижней челюсти, крутя их наружу, чтобы выбить из челюсти прилагается epistome, и потянув ее. Два длинных косточек с мышцами, должны быть прикреплены к нижней челюсти извлеченные если делается правильно.
- Отдельный от ткани по бокам головы около глаз использованием шпателя. С маленькими ножницами рассечение, пересек ткань как можно ближе к хребту косточка возможно слой за слоем.
- Отдых краба против стены рассечение кастрюлю и поддерживать его закрепив его на место (когти могут быть использованы для этого). Вырезать губы ("верхняя губа") от epistome убедившись, не оставляя никаких следов ткани прилагается. Использование кости резки ножницами делают две диагональные разрезы в брюшной панцирь, чтобы удалить головы.
- Возьмите губы с зубчатым щипцами и вырезать губы ("нижняя губа") от косточек на брюшной стороне. Потом слегка приподнимите губу от оставшихся вентральной панциря. Используйте небольшие ножницы, чтобы отдельные вентральной части желудка от тканей, выстилающих панциря. Когда пилорический ампулы видны, разрезать живот от ткани по обе стороны от него до желудка извлекается из краба.
- Все еще держа живот губу щипцами, отдых желудок от ладони и залить солевым в рот. Это расширяет желудка и облегчает разрезать. Вырезать отверстие в рот вниз между привратника прямо через косточка между ампулы. Затем вырежьте по диагонали вниз через две кардиального филиалов. Отрежьте кончики трех зубов внутри желудка.
- Место желудка на большой, черный, Sylgard покрытием блюдо внутри желудка вниз. Pin вниз пятью углами препарат с насекомыми штифты и заполните блюдо с холодным физиологическим раствором, погружение вся подготовка (см. рисунок 1).
2. Изобразительное Dissection
- , Микро-рассечение инструментов, необходимых для тонкой рассечение. В частности, щипцы и ножницы весной необходимы, а также контактный держатель с вольфрамовой иглы. Ясно, Sylgard покрытием, чашки Петри и некоторые прекрасные контакты провода должны были также подготовлены.
- Начиная с низким увеличением, начнем с сковав закрылки возле губ, которые раньше были ротовое отверстие. Перестановка Остальные контакты, чтобы сделать подготовку тугой и контактный любые другие области необходимо.
- Аккуратно поднимите пятнистый гиподермы покрытие нижней части подготовки и обрежьте ее по всей оставляя участок гиподермы с двумя белыми точками.
- Пил до желтого, тонкими, мембранные ткани в нижней части подготовки. Mvns слабо прикреплены к нижней этой ткани. Аккуратно отделите mvns из желтой ткани, как он подъехал. Следуйте желтой ткани и вырезать вместе с мозгом.
- Следуйте толстые процессы выхода из мозга, которые простираются laterally. Это commisural нервы. После окончания спаечный нерва достигнута, удалить массы губчатой, не совсем белый ткани, которые были срезаны со стороны головного мозга.
- Если ионы и сыновья встретиться Cogs, срежьте мышц и тканей, чтобы выявить длина ионов и сыновей.
- Вернуться на патч гиподермы пятнами и его отрезать. Это должно оставить отверстие в артерии окружающих STG. Вырезать через отверстие для разделения двух мышц, которые фланге STG. Поднимите концы этих мышц и прорваться прямо под ними, чтобы отделить их от артерии и разоблачить alns и активных ядер галактик. Отдельные фланговые мышцы столь же далеко, как хрящ, лежащий над STN.
- Срежьте артериальной ткани, окружающие STG туда, где mvns, DGN, и DVN с концами. Работа вниз DVN на LVNs и прорезать беловатые, тонкие ткани, покрывающей LVNs.
- Найдите PSN за косточка в нижней части подготовки. PSN могут быть использованы для обнаружения и ЛВН dlvn перехода.
- Далее следуют dlvn вниз, чтобы найти pyn и ПДН. Pyn часто обертывания за пилорический ампула на открытие. ПДН вилки прочь dlvn и между пилорического ампулы и сердечно мышцы пилорического клапана. Оставьте немного мышц прикреплен к одному из этих нервов, потому что они могут быть легко запутаться, если подготовка передается ясно блюдо Sylgard.
- Как только все нервы были обнаружены, разорвать все оставшиеся связи между ст. и ткани и нежелательных нервы желудка. Тщательно перемещать ст. от остального желудка, резка пропущенных соединений.
- Условие ясно блюдо Sylgard с остальной массы ткани желудка, потерев его на поверхность, пока Sylgard Sylgard больше не чувствует себя слишком липким или сухим. Sylgard является гидрофобным и ст. будет придерживаться сильно к ней, если Sylgard покрытием блюдо не обусловлен именно таким образом.
- Добавьте немного холодной солевой к блюду. Захватите верхние концы спаечный нервы щипцами и привести к ст. ясно блюдо Sylgard.
- Pin ст. вниз на Sylgard. Север мозг от нервов и спаечный использовать Minuten контакты для обеспечения четырех углах Cogs в первую очередь. Убедитесь, что препарат является правой стороной вверх, проверяя, что IVN направлена вверх от Sylgard. DGN должны выйти чуть ниже, когда STG STG является правой стороной вверх. Pin остальные нервные окончания вниз с тонкой контакты провода.
- Чистый от оставшихся мышц и тканей у ст..
- Desheath STG использованием держателя контактный и слегка зацепило, хорошо, вольфрамовой иглы. Сделайте небольшое отверстие в углу STG ножны от клеточных тел и использовать его в отверстие, чтобы получить между слоями оболочки. Аккуратно вырежьте полы отделены оболочкой подвергать STG нейропиля и клеточных тел.
- Pin любые полы ножны вниз, чтобы увеличить доступность клеточных тел и стабилизировать STG для внутриклеточных записей. Re-контактный остальной ст. гарантируя, что каждый нерв тугой и хорошо расположенных на внеклеточные записи (см. диаграмму 3).
3. Результаты
- В идеале, все нервы должны быть свободны от вмятин и повреждений, особенно те, которые будут записаны. Ни один из нервов должна быть запутанной или витой. STG должна быть неповрежденной со всеми ячеек, расположенных в бороду формирование вокруг нейропиля. Нетронутым ст. двусторонне симметричные и выглядит как гомункула с LVNs как ноги, mvns как оружие и передний конец, как голова.
Сокращения:
| Ст. | Стоматогастральных нервной системы |
| STG | Стоматогастральных ганглии |
| CoG | Спаечный ганглии |
| О. Г. | Пищевода ганглии |
| MVN | Срединного нерва желудочка |
| ион | Нижний пищеводный нерва |
| сын | Улучшенный пищевода нерва |
| AGN | Передняя желудочного нерва |
| AlN | Передние боковые нервы |
| DGN | Спинной желудочного нерва |
| DVN | Спинной нерв желудочка |
| ЛВН | Боковой нерв желудочка |
| PSN | Задний нерв желудка |
| pyn | Пилорического нерва |
| PDN | Пилорического нерва расширитель |
| dlvn | Спинной ветвь бокового нерва желудочка |
| IVN | Нижний нерв желудочка |
Рисунок 1: Схема, иллюстрирующая примерный размещения ст. в желудке до вскрытия.
Рисунок 2: Схема различных мышц в нижней части живота и наложение ст. в светло-зеленые. Каждый тип клеток в STG указана с мышцами, они, как известно, иннервируют. Эта карта является полезной при планировании вскрыть нерв, который несет в себе сигнал от данной клетки (благодаря Надим лаборатории).
Рисунок 3: Принципиальная схема ст. с внутриклеточными электродами и внеклеточной скважин (из Мардер и Bucher, 2007).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рассечение ст. является первым шагом в выполнении электрофизиологии или иммуногистохимии эксперимент, или для получения клеток для клеточной культуры. Независимо от того, предназначена эксперимент, валовой рассечение останется без изменений. Тем не менее, прекрасно вскрытия могут быть различными. Важно планировать заранее, какие клетки и нервы которых вы будете запись. Большинство нейронов в STG имеют процессы, которые иннервируют по крайней мере одна мышца живота (см. рисунок 2) и классифицируются в соответствии с их целевым иннервируются. Таким образом, внеклеточная записей, необходимое для полной проверки личности ячейку, в настоящее время зарегистрированы внутриклеточно. Частота пилорического ритм и надежности используются для мониторинга здоровья подготовки. Поэтому многие эксперименты включают внеклеточной записи с ЛВН. DGN обычно используется для контроля желудочного ритма. STN часто имеет решающее значение для большинства экспериментов, поскольку Есть много клеток модуляторных в переднем конце ст. разрыв и, что нервные может вызвать пилорического и желудка ритмы прекратить или становятся нерегулярными.
Хотя порядок, в котором шаги в изобразительном вскрытия делается не важно, мы находим его легче удалить ст. без повреждений, держа концы периферических нервов крепятся к мышце только после STG был отключен от окружающих ткани. Это держит STG и STN тугой достаточно, чтобы безопасно и легко удалить мышцы и ткани вокруг них.
После подготовки в открытом блюдо Sylgard, любая ткань, которая остается на ст. должна быть удалена, чтобы избежать его вмешательства в электродах во время эксперимента. Кроме того, легче получить хорошие, стабильные записи, когда препарат скованы, как тугие, как возможно без ущерба для нервов. Особенно важно, что STG быть скованы надежно alns с короткими контактами обеспечить доступ внутриклеточных электродов столько ячеек, сколько возможно. Желательно, чтобы рассекать по крайней мере часть любого из нервов, которые исходят от СТГ, даже если эти нервы не нужны для записи. Они могут предоставить дополнительные якоря дальнейшей стабилизации STG на блюдо. Лучше всего держать их достаточно короткий для максимальной поддержки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы выражаем глубокую признательность членам Лаборатории Мардер. Мы благодарим наших советник, доктор Ева Мардер, за ее поддержку и поощрение. Работа выполнена при поддержке Национального института неврологических расстройств и инсульта Гранты NS-17 813 и NS-058 110.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Sylgard 170 | Other | Dow Corning | 170 | Gross Dissection |
| Fine Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Insect Pins size 6 | Surgery | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Scissors | Surgery | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Micro-Spatula | Surgery | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeurs | Surgery | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Tissue Forceps | Surgery | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Surgery | California Fine Wire Company | Fine Dissection | |
| Forceps #5 | Surgery | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Surgery | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Surgery | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Dish (100x15mm) | Other | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Pin Holder | Surgery | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Super fine forceps #5SF | Surgery | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten Needles | Surgery | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Wild | MC3 | Misc. |
| Jonah Crab (C. borealis) | Animal | Commercial Lobster |
References
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
